國內(nèi)近10年鐵皮石斛多糖研究進展

鄒榮燦，王乾，孫俊，劉明月，向準，羅倩

（1.貴州師范大學生命科學學院，貴州貴陽550025；2.貴陽市長坡嶺國有林場，貴州貴陽550014；3.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025；4.貴州省生物研究所，貴州貴陽550009；5.貴州師范學院，貴州貴陽550018）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）系蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，主要分布于我國安徽、浙江、湖南、云南、廣西等地[1]，是我國傳統(tǒng)名貴中藥[2]，具有益胃生津、滋陰清熱、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等功效；用于陰傷津虧，口干煩渴，食少干嘔，病后虛熱，目暗不明[3]?，F(xiàn)代研究表明，鐵皮石斛含多糖、生物堿、菲類、聯(lián)芐類、氨基酸等多種活性成分[4]，其中多糖為其主要的活性成分，也是其中含量最高的物質[5]，具有降血糖[6]、降血脂[7]、降血壓[8]、增強免疫力[9-12]、抗疲勞[13-14]、抗菌[15]、抗腫瘤[16]以及抗氧化[17-18]等作用，因其廣泛的生物活性，備受科研工作者的關注，成為當今研究的熱點，為今后對鐵皮石斛多糖（Dendrobium officinale polysaccharides，DOP）的深度研究及相關藥食品開發(fā)利用，該文從DOP的提取、含量測定、分離純化、結構組成及生物活性等方面將近10年來的研究現(xiàn)狀進行綜述如下：

1 DOP的提取方法

經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻，目前用于DOP的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超高壓萃取法、閃式提取法及酶提法，針對各提取方法分析其優(yōu)勢和弊端，為今后合理選擇DOP的提取方法提供參考。

1.1 熱水浸提法

熱水浸提法操作簡單、成本低廉，是提取DOP常選擇的方法，原理是基于多糖易溶于水、不溶或微容于有機溶劑的性質，用高濃度乙醇（80%左右）將其從水中沉淀析出，再用適量無水乙醇或丙酮洗滌，經(jīng)冷凍干燥后獲得粗多糖?；玖鞒蹋簶悠贰兔衙撝撋?0%～80%乙醇除雜→蒸餾水浸提→醇沉過夜→離心→冷凍干燥→粗多糖。此法雖操作簡單、條件溫和、對儀器設備要求低，但提取率易受料液比、提取溫度、提取時間等因素的影響。吳迪等[19]以水為溶劑，對影響DOP得率的提取時間、溫度及料液比等因素進行了優(yōu)化研究，結果表明，在料液比1∶120（g/mL）、浸提溫度70℃、浸提時間90 min時DOP提取效果最好，提取率為55.2%。黃曉君等[20]同樣對DOP的提取工藝進行優(yōu)化，結果為料液比 1∶30（g/mL）、提取溫度 90℃、提取時間2 h，在此條件下多糖得率為30.56%。而秦向東等[21]采用水提醇沉法、正交試驗設計法優(yōu)化DOP的提取工藝，優(yōu)化后的最佳工藝為：溫度95℃，提取時間2.5 h，pH 值 8，料液比 1 ∶40（g/mL），乙醇濃度 90%時，DOP提取率高達60.6%。

1.2 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取法是基于超聲波的機械效應、熱效應和空化效應作用，從而增大物質分子運動的頻率和速度，提高溶劑穿擊力，加快有效物質溶出，從而縮短提取時間。葉余原[22]探索DOP的超聲波提取工藝條件，考察提取溫度、固液比、提取時間和超聲頻率4個因素對DOP提取率的影響，結果表明：在1∶30（g/mL）的料液比，50℃超聲水浴，45 kHz超聲頻率，提取1.5 h的條件下，DOP得率為15.3%，同等條件下較常規(guī)水提法（10.2%）得率高。此外，韓冉等[23]比較研究了超聲輔助提取法和酶解法對DOP得率的影響，結果，超聲輔助提取率為（15.78±0.072）%優(yōu)于酶解法（14.89±0.053）%，超聲波輔助提取法具有提取時間短、所需溫度低、得率高的特點，但超聲波功率不宜過高，否則會對多糖分子結構及特性產(chǎn)生負面影響。

1.3 微波輔助提取法

微波輔助提取法是基于微波穿透能力強的特點，利用物質在微波場中吸收微波能力的差異，使物質的某些區(qū)域或某些組分被選擇性溶出，陳盛余等[24]分別考察了單因素料液比、微波功率、提取時間和提取溫度對DOP得率的影響，結果表明，DOP的最佳提取工藝為料液比為1∶45（g/mL），微波功率900 W，提取時間30 min，提取溫度95℃。在此條件下，DOP的提取率達9.77%。該提取工藝簡單、快速，可以應用于從鐵皮石斛中提取多糖物質，但也存在對溶劑要求嚴格、局限于實驗室研究等弊端。

1.4 超高壓萃取法

超高壓萃取技術是近幾年發(fā)展起來的較為先進的提取方法，在發(fā)達國家用于食品加工領域的研究已較為普遍，在國內(nèi)主要用于滅菌、滅活、疫苗制取及中藥有效成分提取等方面，將其作為植物多糖提取方法的文獻鮮有報道，該法具有得率高、高效、快速、低能耗、綠色環(huán)保等優(yōu)點。縱偉等[25]探討了DOP的超高壓提取工藝及條件優(yōu)化，將石斛粉碎到80目后，按固液比 1 ∶20（g/mL），采用 300 MPa壓力提取 6 min，DOP 的得率達19.27%。

1.5 閃式提取法

閃式提取法是一種用于植物軟硬組織破碎的新型提取技術，依靠高速機械剪切力和超動分子滲濾技術，在室溫及溶劑存在下數(shù)秒內(nèi)把物料粉碎至細微顆粒，并使有效成分迅速達到組織內(nèi)外平衡，通過過濾達到提取的目的，具有溶劑用量少、提取時間短、效率高等優(yōu)點。蔡興等[26]使用該法對鐵皮石斛葉中多糖得率優(yōu)化，結果表明：最佳提取工藝條件為以25倍量水提取3次，每次90 s，得率為11.52%。李嬌等[27]比較了水提法、超聲法和閃式提取法對DOP提取率的影響研究，并用正交試驗法對最優(yōu)方法進行條件優(yōu)化，結果表明，水提法為10.90%，超聲法為18.75%，閃式提取法為 24.05%，提取時間分別為 120、60、2 min；與傳統(tǒng)水提法和超聲法相比，閃式提取具有明顯的優(yōu)越性。

1.6 酶提法

酶提法是利用酶對植物細胞結構的破壞，使細胞內(nèi)多糖有效的溶出。Hu等[28]利用Box-Behnken設計響應面法優(yōu)化DOP的酶法提取工藝，結果最佳提取工藝條件為：酶用量3.5 mg/mL，水解溫度53℃，反應時間70 min，DOP得率為16.11%，該法有效、穩(wěn)定、可行。楊巖等[29]通過對酶解溫度、酶解時間及加酶量3個因素進行優(yōu)化，提高DOP提取率；結果顯示，在酶解溫度為40℃、酶解時間1 h、加酶量2.5%時，多糖提取率為38.4%，而不加酶處理僅為21.7%。尚喜雨[30]同樣比較研究了酶法和水提法對DOP提取率的影響，結果酶法為26.49%，水提法為12.07%，酶法比水提法提高了119%。

基于以上不同提取方法，熱水浸提法操作簡單、成本低廉，但提取率低；超聲波輔助提取法用時間短、所需溫度低、得率高，但超聲波功率不宜過高；微波輔助提取法工藝簡單、快速，但局限于實驗室研究；超高壓萃取法得率高、高效、快速、低能耗、但對儀器設備要求高；閃式提取法和酶提法溶劑用量少、提取時間短、效率高；因原料的產(chǎn)地、處理方法不同，各提取方法提取的多糖得率有一定差異，因此，僅從多糖得率高低來判斷提取方法的優(yōu)越性沒多大意義、可從多糖的純度及活性方面綜合考慮，建議研究者應根據(jù)自己研究的目的、要求、條件及環(huán)境選擇適合的方法進行提取。

2 DOP含量測定及分離純化

2.1 DOP含量測定

當前用于DOP含量測定的方法主要有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，其原理是利用強硫酸水解多糖成單糖，形成糠醛化合物與苯酚或蒽酮形成有色物質，再利用其在可見光區(qū)的最大吸收波長作為檢測波長進行含量測定。苯酚-硫酸法檢測波長（490 nm左右），蒽酮-硫酸法檢測波長（620 nm左右），有研究表明，同一樣品，采用蒽酮-硫酸法測定多糖的含量高于苯酚-硫酸法，但苯酚-硫酸法的測定結果較為合理，可作為DOP含量測定的首選方法[31]。苯酚-硫酸法測多糖僅在一定時間內(nèi)穩(wěn)定性良好，因此，在顯色過程中要嚴格控制好時間、顯色劑及硫酸的用量問題，避免外界因素帶來的誤差。另外DNS比色法（3，5-二硝基水楊酸比色法）、高效液相色譜法也可作為DOP含量的測定方法。為保證測量值更加準確，在測量前需排除去色素，蛋白、單糖、寡糖等干擾。

2.2 DOP分離純化

經(jīng)不同方法提取的DOP中常含有蛋白質、色素、單糖、寡糖、脂類等雜質，如何除去這些雜質至關重要，如不除去雜質將影響提取物中多糖的含量及純度，影響其活性和功效，甚至影響結構鑒定及構效關系的研究。目前，國內(nèi)外除去DOP中蛋白常用的方法有Sevag法、三氯乙酸法、酶法、酶-Sevag法、等電點法、鹽酸法等[32]，其中Sevag法的優(yōu)點是適用范圍廣、成本低、檢測速率快、脫蛋白率高等，缺點是易損失提取物中的多糖影響其活性，另外Sevag法主要是除去游離蛋白，而很難除去與多糖結合的蛋白。三氯乙酸法脫蛋白較完全，但易使多糖降解，且殘留的三氯乙酸還會帶來安全隱患；DOP脫色的方法有活性炭脫色法、H2O2氧化法、離子交換樹脂法等。較常用的是活性炭脫色，因為活性炭為黑色多孔性粉末或顆粒，無嗅無味，具有較大的表面積，吸附能力強，脫色成本低等特點，李國濤等[33]探討DOP活性炭脫色工藝，以脫色率和多糖保留率為指標，結果表明：活性炭吸附法對DOP具有良好的脫色效果，最佳工藝條件為：溫度為70℃，活性炭使用量為體積分數(shù)0.5%，攪拌60 min，脫色率為71.64%，多糖保留率為87.29%；嚴婧等[34]以總多糖保存率和蛋白脫除率為評價指標，通過單因素試驗比較Sevage法、木瓜蛋白酶法、胰蛋白酶法和胰蛋白酶聯(lián)合Sevage法，結果表明：胰蛋白酶聯(lián)合Sevage法具有較高的總多糖保存率及蛋白脫除率，最佳工藝條件為酶解時間1.5 h，酶用量0.21 g/mL，酶解溫度63.25℃，總多糖溶液-Sevage試劑體積比（4.27∶1），蛋白脫除率（87.15±7.93）%，總多糖保存率（81.32±8.54）%。

2.3 DOP結構組成

要進一步探究DOP的組成、分子質量、結構特征，在脫色脫蛋白的基礎上還需進一步分離純化，常用的分離純化方法有離子交換樹脂法、凝膠過濾柱色譜法、親和色譜法、膜分離法。分析DOP成分是研究其生物活性的重要前提，王琳煒等[35]采用傳統(tǒng)的水提醇沉法提取霍山DOP，經(jīng)酶-Sevag法脫蛋白，再經(jīng)DEAE-52纖維素柱、SephadexG-100凝膠柱分離純化得到石斛多糖組分DOPA-1，單糖組成為甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質的量比為1∶0.42∶0.27。龔慶芳等[36]發(fā)現(xiàn)構成DOP的單糖不僅包括甘露糖、葡萄糖和半乳糖，還包括阿拉伯糖，其摩爾比為3.28∶31.83∶1.51∶1.00。羅秋蓮等[37]利用DEAE-52纖維素柱及Sephadex G-100對鐵皮石斛粗多糖進一步純化得4個組分，其中DOP1由甘露糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖組成摩爾比為3.42 ∶0.11 ∶1.08；DOP2、DOP3、DOP4 均由甘露糖和葡萄糖組成摩爾比分別為 8.56 ∶1.12；4.91 ∶1.0；3.61 ∶1.01。而賓宇波等[38]研究發(fā)現(xiàn) DOP 由 D-甘露糖、L（+）-鼠李糖和D-葡萄糖組成，其摩爾比為1.936∶0.856∶0.691。Luo等[39]研究發(fā)現(xiàn)DOP由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖組成，摩爾比為6.2∶2.3∶2.1∶0.1。各文獻報道的DOP組成及摩爾比存有一定差異，可能原因是因原料的產(chǎn)地、加工及純化等方式的不同所致（見表1）。

3 DOP的生物活性

鐵皮石斛被譽為“救命仙草”和藥界的“大熊貓”，斛中的極品，現(xiàn)代研究表明DOP為其主要的功效成分之一，在降血糖、降血脂、增強免疫力、抗氧化、抗疲勞、抗菌及抗癌等方面具有顯著療效，另外DOP還具有促毛發(fā)生長、改善肺功能和炎癥、增強胃腸道轉運率等作用（見表2），對于研發(fā)更多DOP的藥物制劑和保健產(chǎn)品，具有重要的經(jīng)濟價值和市場前景。

表1 DOP的提取、分離純化及單糖組成Table 1 The extraction，isolation and monosaccharide composition of Dendrobium officinale polysaccharides

表2 鐵皮石斛多糖的生物活性Table 2 The biological activities of polysaccharide from Dendrobium officinale

4 展望

綜上所述，DOP的提取方法有熱水浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、閃式提取法、超高壓萃取法及酶提法；含量測定方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3，5-二硝基水楊酸比色法、高效液相色譜法；分離純化方法有離子交換樹脂法、凝膠過濾柱色譜法、親和色譜法、膜分離法。DOP在降血糖、降血脂、增強免疫力、抗氧化、抗疲勞、抗菌及抗癌等方面具有顯著療效，另外還具有促進毛發(fā)生長、改善肺功能和炎癥、增強胃腸道轉運率等作用。

隨著科研工作者對DOP的日益深入研究，在DOP的提取、含量測定、分離純化、結構組成及生物活性等方面做了大量的研究工作，已取得了一定的成效。但仍存在一些問題亟須解決：①DOP的最適提取方法目前尚無定論，目前應用較多的提取方法是熱水浸提法，隨著科學技術的不斷進步，超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超高壓萃取法、閃式提取法及酶提法等也相繼應用于DOP的提取，這些方法的應用大大縮短了提取時間，更易獲得目標產(chǎn)物，還有一些較為先進的方法尚未用于DOP的提取，如超臨界流體萃取、雙水相萃取等，這些方法能否提高DOP的得率還有待進一步研究。因DOP的提取方法較多，各方法均有利弊，建議研究者跟據(jù)研究的目的、要求和條件對其合理選擇。②結構決定性質，對DOP的結構研究還處在一級結構中單糖的組成及分子量大小等階段，對于高級結構的研究進一步揭示DOP構效關系、代謝機理及作用機制是目前仍需迫切解決的問題。③DOP的藥理活性已被大量實驗證實，但都局限于粗提物，如何開發(fā)符合臨床需求的藥物制劑和相關保健品的開發(fā)，有待進一步研究。

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