同時蒸餾萃取制備延藥睡蓮精油及其抗氧化研究

范楊楊，王健，余文剛，吉浩，鹿文舉，柏寶冰，趙瑩，宋希強

（海南大學熱帶農林學院/環(huán)南海陸域生物多樣性研究中心，海南海口570228）

睡蓮屬（Nymphaea）為睡蓮科（Nymphaeaceae）多年生水生草本植物，在溫帶及熱帶地區(qū)都有廣泛種植。睡蓮屬植物含有多種類型化合物，例如黃酮、多糖及生物堿等。從睡蓮屬植物中共分離得到的黃酮類及酚酸類化合物70余個，分別為黃酮、黃酮醇及異黃酮類[1]。根據對睡蓮的營養(yǎng)成分分析，結果表明睡蓮富含17種氨基酸，睡蓮蛋白屬優(yōu)質蛋白。分析結果還表明睡蓮含有豐富的VC、黃酮甙、微量元素鋅，這二者配合具有很強的排鉛功能[2]。

延藥睡蓮（Nymphaea stellata），又名藍藥睡蓮、延藥睡蓮，花大型，挺水開放，花瓣上部為美麗的深藍色，中下部淡藍色，花開呈星狀，有香氣，觀賞價值極高，是良好的切花花材。延藥睡蓮原產于印度及東南亞，據《海南植物志》記載我國僅在海南省萬寧市境內的丘陵濕地中及?？谑懈浇l(fā)現有自然分布[3]。延藥睡蓮具有廣泛的藥用價值，根莖的粉末可用于治療腹瀉，其浸出物作為一種潤滑劑和利尿劑，用于淋病及尿道感染的治療。其制成物可緩解咳嗽癥狀，并對膽病，嘔吐，眼花等有一定療效[4-5]。現代研究表明，延藥睡蓮在食品工業(yè)及醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)具有廣闊的應用前景。

同時蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）是通過同時加熱樣品液相與有機溶劑至沸騰來實現的，水蒸氣和溶劑蒸氣同時在儀器中被冷凝下來，水和溶劑不相混溶，在儀器U形管中被分開來，分別流向兩側的燒瓶中，結果蒸餾和提取同時進行，只需要少量溶劑就可提取大量樣品，香氣成分得到濃縮。該方法可以避免長時間高溫加熱帶來的負面影響。本文使用同時蒸餾萃取方法提取延藥睡蓮精油，并分析幾種不同因素對精油提取率的影響，并用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對精油進行成分分析，還對其體外抗氧化性初步研究。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

延藥睡蓮：海南榮豐花卉有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉、二氯甲烷、BHT、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）、磷酸緩沖液（（phosphate buffer saline，PBS）、六氰合鐵（Ⅲ）酸鉀、三氯乙酸：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

數顯恒溫水浴鍋（HH-4）：金壇市盛藍儀器制造有限公司；旋轉蒸發(fā)儀（RV10）：九方沃德科技發(fā)展有限公司；GC/MS聯(lián)用儀（HP6890/5975C）：美國安捷倫公司；多管架自動平衡離心機（TDZ5-WS）：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；紫外可見分光光度計（T52N）：上海佑科儀器儀表有限公司。

2 方法

2.1 延藥睡蓮前處理

將延藥睡蓮花瓣解離，在50℃下干燥10 h后，進行粉碎，過60目篩得到延藥睡蓮花瓣粉末。

2.2 不同因素對同時蒸餾萃取法制備延藥睡蓮精油得率的影響

2.2.1 NaCl含量對延藥睡蓮精油得率的影響[6-7]

準確稱取30 g延藥睡蓮花瓣粉末，放置于1L燒瓶中，依次用600 mL 0%、5%、10%、15%、20%NaCl溶液浸泡花瓣粉末，靜置浸泡4 h，將其安裝于同時蒸餾萃取裝置的左端，用電熱套加熱至其沸騰；將100 mL二氯甲烷裝入500 mL的燒瓶，接入同時蒸餾萃取裝置的右端，用恒溫水浴鍋加熱至50℃使其沸騰。同時蒸餾萃取2 h后，取下右端裝有二氯甲烷的燒瓶，加入無水硫酸鈉進行干燥，旋轉蒸發(fā)除去有機試劑，得到精油產物，計算精油得率/%=精油質量/30×100。

2.2.2 蒸餾時間對延藥睡蓮精油得率的影響

準確稱取30 g延藥睡蓮花瓣粉末，放置于1 L燒瓶中，用600 mL 10%NaCl溶液浸泡花瓣粉末，按照

2.2.1 操作步驟，依次同時蒸餾萃取 1、2、3、4、5 h 后，計算精油得率。

2.2.3 料液比對延藥睡蓮精油得率的影響

準確稱取30 g延藥睡蓮花瓣粉末，依次用料液比分別為 1∶10、1∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）的 含 10%NaCl水溶液浸泡花瓣粉末，按照2.2.1操作步驟，計算精油得率。

2.3 GC-MS分析延藥睡蓮精油成分

樣品加二氯甲烷溶解后濃縮至盡干，進樣1 μL。色譜 FB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫48℃，保持2 min，以4℃/min升溫至220℃，以10℃/min升溫至310℃，保留4 min，運行時間58 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓48 676.9 Pa，載氣流量1.0 mL/min；分流比：20 ∶1；溶劑延遲時間：5 min。

離子源為EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 624 V；接口溫度 280℃；質量范圍 29 amu～450 amu。對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統(tǒng)檢索及核對Nist2005和Wiley275標準質譜圖，確定了揮發(fā)性化學成分，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對質量分數。

2.4 延藥睡蓮精油的體外抗氧化活性初步研究2.4.1 清除DPPH自由基測定

用二氯甲烷溶液分別配制濃度為2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL的睡蓮精油溶液，2.0 mg/mL的BHT溶液作為樣品溶液。分別將2.0 mL樣品溶液和2.0 mL濃度為1.0×10-4mol/L的DPPH溶液，混勻后暗處放置0.5 h，以二氯甲烷作參比，測定517 nm處的吸光值A，同樣測定2.0 mL樣品溶液與2.0 mL二氯甲烷混合后517 nm處的吸光值A0，再測定2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL二氯甲烷混合液在517 nm處的吸光值A1，按下式公式計算清除率[8-9]：

2.4.2 清除2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+）自由基測定

配制2 mmol/L ABTS溶液，吸取50 mL上述溶液與200 mL K2S2O8溶液（70 mmol/L）混合，暗處放置 12 h，得到ABTS+自由基溶液。用磷酸緩沖液（PBS）將ABTS+自由基溶液稀釋至在734 nm下吸光度為0.70±0.02。用二氯甲烷溶液分別配制濃度為2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL的睡蓮精油溶液，2.0 mg/mL的BHT溶液作為樣品溶液，按下式公式計算清除率[10]：清除率/=（A0-A）/A0，式中：A0為ABTS+自由基溶液的吸光度；A為加睡蓮溶液后的吸光度。

3 結果與分析

3.1 不同因素對同時蒸餾萃取法制備延藥睡蓮精油得率的影響

3.1.1 NaCl含量對延藥睡蓮精油得率的影響

NaCl含量對延藥睡蓮精油得率的影響見圖1。

由圖1可知，隨NaCl含量的增加精油得率會先增加后降低，NaCl含量在5%～15%時，精油得率提取量較高；當NaCl含量大于10%后，精油得率會有所下降。在溶液中加入NaCl會產生鹽析效應，加速精油析出。然而，隨著鹽濃度的增加，水溶液的沸點也會隨之增加，過高的溫度會引發(fā)一些熱穩(wěn)定性差的化合物分解，導致精油得率下降[11-12]。

3.1.2 蒸餾時間對延藥睡蓮精油得率的影響

蒸餾時間對延藥睡蓮精油得率的影響見圖2。

圖1 精油得率隨NaCl含量的變化Fig.1 The change of yield of essential oil with the content of NaCl

圖2 精油得率隨蒸餾時間的變化Fig.2 The change of yield of essential oil with the distillation time

圖2結果表明，隨蒸餾時間的增加精油得率整體是增加的趨勢，達到4 h后，得率隨蒸餾時間增加而出現減少的趨勢。原因可能是因為溫度過高使得精油被破壞或者分解。并且，隨著蒸餾時間增長可能會伴隨副產物的產生，不但造成資源浪費，還會影響延藥睡蓮精油的品質[13-15]。

3.1.3 料液比對延藥睡蓮精油得率的影響

料液比對延藥睡蓮精油得率的影響見圖3。

圖3 精油得率隨料液比的變化Fig.3 The change of yield of essential oil with material liquid ratio

從圖3結果可看出，料液比達到1∶20（g/mL）后，得率不再隨料液比的增加而增加，而是出現減少的趨勢。原因可能是當料液比為1∶20（g/mL）時，隨著溶液體積進一步增加，延藥睡蓮花瓣在NaCl溶液中已經接近飽和，精油在水中的溶解量不會再增加[16-18]。

3.2 GC-MS分析延藥睡蓮精油成分結果

GC-MS分析延藥睡蓮精油成分結果見圖4和表1。

圖4 總離子流圖Fig.4 Total ion flow graph

表1 延藥睡蓮精油成分表Table 1 List of essential oil components of Nymphaea stellata

由表1可見，水蒸氣蒸餾萃取法得到的延藥睡蓮精油的主要成分有2-十七烷酮（32.573）、二十三烷（13.999）、葉綠醇（四甲基-2-十六碳烯-1-醇）（10.123）、6（Z），9（E）-十七碳二烯酸（3.821）和二十五烷（3.719）。從化合物的種類來看，主要是一些羰基類化合物如2-十七烷酮，飽和烷烴如二十三烷、二十五烷，還有烯烴類化合物如葉綠醇、6（Z），9（E）-十七碳二烯酸。

3.3 延藥睡蓮精油的抗氧化活性測定結果3.3.1 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定結果見圖5。

圖5 延藥睡蓮精油對DPPH自由基的清除能力Fig.5 Scavenging capacity of Nymphaea stellata essential oil to DPPH free radical

圖5表明延藥睡蓮精油對DPPH自由基存在清除能力，并且隨著精油量的增加，對DPPH的清除率也會隨之增加。氣質聯(lián)用分析結果表明，延藥睡蓮精油中含有較多的羰基類化合物和烯烴類化合物。隨著延藥睡蓮精油濃度的增大，上述兩種物質也會隨之增多。由此可推斷，可能是羰基類化合物和烯烴類化合物，對DPPH自由基有清除作用[19]。濃度為2.0 mg/mL的睡蓮精油對DPPH自由基的清除率比同一濃度的BHT要低，說明延藥睡蓮精油對DPPH自由基的清除率要比抗氧化劑BHT弱。

3.3.2 ABTS+自由基清除率的測定

ABTS+自由基清除率的測定見圖6。

圖6 延藥睡蓮精油對ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of Nymphaea stellata essential oil to ABTS+free radical

從圖6可看出，延藥睡蓮精油對ABTS+自由基存在清除能力，并且隨著精油量的增加，對ABTS+自由基的清除率也會隨之增加。濃度為2.0 mg/mL的睡蓮精油對ABTS+自由基的清除率達1.79%，而濃度為2.0mg/mL的BHT對ABTS+自由基的清除率達36.74%。因此，延藥睡蓮精油對ABTS+自由基的清除率要比抗氧化劑BHT弱。

4 結論

使用同時蒸餾萃取法（SDE）制備了延藥睡蓮精油，并采用GC-MS手段鑒定樣品中所含的化學成分。確定了SDE法提取精油的最佳工藝參數：10%NaCl含量、蒸餾時間為 2 h、料液比 1 ∶20（g/mL）、蒸餾溫度為50℃，在上述提取條件下，延藥睡蓮精油的得率可以達到0.101%。SDE法制備的延藥睡蓮精油含有較多的羰基類化合物，并且所得精油具有一定的體外抗氧化性。

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