膠原蛋白發(fā)展進(jìn)程中的3個(gè)問題

吳琎，徐雨情，王永久，段蕊

（淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港222005）

膠原蛋白指的是生物體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的一類結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，是一類外觀呈白色、不透明、沒有支鏈的纖維型蛋白質(zhì)，它一般分布于動(dòng)物肌腱、韌帶與軟骨、皮膚以及一些結(jié)締組織中，是現(xiàn)今哺乳動(dòng)物各組織器官中含量最為豐富、覆蓋面積最大的一種蛋白質(zhì)，其分子中通常最少有1個(gè)由α鏈構(gòu)成的三股螺旋構(gòu)象的結(jié)構(gòu)域，生物學(xué)上也稱膠原域，是高度保守的特征性結(jié)構(gòu)。膠原蛋白在生物體內(nèi)作為一種重要的功能性蛋白質(zhì)，在細(xì)胞再生、保證皮膚、骨骼發(fā)揮正常功能中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也與動(dòng)物的細(xì)胞分化、細(xì)胞衰老、關(guān)節(jié)潤(rùn)滑及疾病產(chǎn)生息息相關(guān)[1]。

膠原蛋白產(chǎn)品的研發(fā)使用開始于日本，起初有關(guān)這一新興產(chǎn)品功效的爭(zhēng)議不斷，這引起了日本各界的廣泛關(guān)注，由此也推進(jìn)了大量科研成果的產(chǎn)生。從備受質(zhì)疑到被少數(shù)人接受直至被消費(fèi)者廣泛認(rèn)可，膠原蛋白已經(jīng)成為日本人民日常使用的食品添加劑，在食品領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[2]。就全球領(lǐng)域而言，膠原蛋白早已不再單一應(yīng)用于食品行業(yè)，它被廣泛使用于于醫(yī)療藥品、化妝品及包裝材料等各領(lǐng)域[3]。我國(guó)從2005年開始興起了一股膠原蛋白熱潮，目前的膠原蛋白產(chǎn)品市場(chǎng)年需求量已經(jīng)達(dá)到了15 300 t，發(fā)展速度與規(guī)模與日俱增，但在消費(fèi)者及科研人員中仍存在著較大的爭(zhēng)議。這主要由于中國(guó)膠原蛋白行業(yè)起步較晚，市場(chǎng)教育不到位，行業(yè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)尚未制定等原因所致。同時(shí)，國(guó)內(nèi)的眾多消費(fèi)者在對(duì)膠原蛋白的認(rèn)知與消費(fèi)理念上還與日美各國(guó)存在著一定的差距，這些綜合問題導(dǎo)致了中國(guó)的膠原蛋白行業(yè)發(fā)展存在著各類不規(guī)范現(xiàn)象，使得膠原蛋白產(chǎn)業(yè)整體發(fā)展相對(duì)緩慢。

1 產(chǎn)品稱謂界定

膠原蛋白產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中有一些問題需要明確，首先是膠原蛋白的定義與界定[4]。膠原蛋白是一類物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)有相似之處，但應(yīng)用領(lǐng)域不同，其具體定義并不完全相同，目前市場(chǎng)上的膠原蛋白主要有兩類產(chǎn)品。

第一類，應(yīng)用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，此類膠原蛋白產(chǎn)品一般是指從生物體中提取得到的具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)和能很好發(fā)揮細(xì)胞間質(zhì)功能的產(chǎn)品（不變性膠原蛋白產(chǎn)品）[5]，此類產(chǎn)品目前應(yīng)用于醫(yī)療器械、細(xì)胞培養(yǎng)等領(lǐng)域，應(yīng)用者多為生物領(lǐng)域?qū)I(yè)人員。第二類產(chǎn)品是在食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域的膠原蛋白，此類產(chǎn)品是以動(dòng)物皮膚、骨骼等為原料，經(jīng)提取、酶解等工藝制備的小分子肽類產(chǎn)品[6]。此類產(chǎn)品是隨現(xiàn)代酶制劑工業(yè)的發(fā)展而發(fā)展起來的，目前廣泛用于食品配料、口服液、面膜、保健食品中，與消費(fèi)者聯(lián)系最為密切，也是廣受詬病的膠原蛋白制品，目前關(guān)于膠原蛋白的負(fù)面報(bào)道均來自于此類膠原蛋白產(chǎn)品，應(yīng)用者多為普通民眾。

由于膠原蛋白在不同領(lǐng)域代表了不同的產(chǎn)品，因此在稱謂使用過程中應(yīng)該注意區(qū)分。特別是政府部門在標(biāo)準(zhǔn)制定以及行業(yè)協(xié)會(huì)在產(chǎn)品名稱使用方面要區(qū)分開來。如目前我國(guó)比較普遍采用的膠原蛋白產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)分別有：QB 2732－2005《水解膠原蛋白》、GB/T 22729－2008《海洋魚低聚肽粉》、SB/T 10634－2011《淡水魚膠原蛋白肽粉》，還有一些企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)如Q/JYB 0065 S-2010《復(fù)配膠原蛋白粉》。

就 QB 2732－2005《水解膠原蛋白》和 SB/T 10634－2011《淡水魚膠原蛋白肽粉》而言，在其名稱上均可以明確的看出其產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)是針對(duì)以富含膠原蛋白的動(dòng)物皮膚、骨骼及明膠等為原料，經(jīng)提取、酶解等工藝制備的肽類產(chǎn)品。GB/T 22729－2008《海洋魚低聚肽粉》也同樣聲明了其產(chǎn)品為肽類制品。以上標(biāo)準(zhǔn)在使用上較好的避免了兩類膠原蛋白產(chǎn)品的混淆。

但是一些企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)如Q/JYB 0065 S-2010《復(fù)配膠原蛋白粉》，則可能產(chǎn)生歧義。從稱謂上看，容易被誤認(rèn)為其產(chǎn)品為生物學(xué)意義的膠原蛋白，但從內(nèi)容上看其主要是膠原蛋白肽。

建議如果產(chǎn)品生產(chǎn)工藝過程中有超過50℃的保溫以及酶解工藝，其產(chǎn)品在名稱上需要冠以“膠原蛋白肽”稱謂，明確其產(chǎn)品本身是“肽類制品”?！八饽z原蛋白”雖然與“膠原蛋白肽”為同一類產(chǎn)品，但水解是工藝過程，得到的產(chǎn)品則是肽，因此“膠原蛋白肽”的稱謂則更能體現(xiàn)產(chǎn)品的本質(zhì)。

同時(shí)也建議從事膠原蛋白產(chǎn)品研究與銷售的行業(yè)協(xié)會(huì)及科研團(tuán)體在以后的研討、產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量檢測(cè)等活動(dòng)中，盡量區(qū)分“膠原蛋白”與“膠原蛋白肽”[7]，使產(chǎn)品的稱謂符合其本身科學(xué)的定義。

2 膠原蛋白測(cè)定

目前，膠原蛋白并沒有特異性的檢測(cè)方法，國(guó)標(biāo)中膠原蛋白總量的檢測(cè)一般采用凱氏定氮法[8]，在實(shí)際生產(chǎn)或研究開發(fā)過程中還可以采用雙縮脲法、紫外檢測(cè)法、Lorry法等[9-12]，但無論采取哪種方法，所測(cè)定的值都代表了樣品中總蛋白的含量或肽鍵的含量，而不只是膠原蛋白的含量。

雖然我國(guó)涉及膠原蛋白的幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中，目前大部分仍在使用凱氏定氮法對(duì)膠原蛋白進(jìn)行檢測(cè)[13]，但應(yīng)該注意其凱氏定氮換算系數(shù)與一般蛋白質(zhì)不同。

對(duì)幾種不同來源膠原蛋白的氨基酸組分進(jìn)行分析，確定其占總氨基酸中的數(shù)目，并計(jì)算N元素的含量，得到的凱氏定氮換算系數(shù)如表1。

表1 幾種來源不同的膠原蛋白及肽類制品的氨基酸組分及N元素含量Table 1 Amino acid and N composition of collagen from various collagen byproducts

續(xù)表1 幾種來源不同的膠原蛋白及肽類制品的氨基酸組分及N元素含量Continue table 1 Amino acid and N composition of collagen from various collagen byproducts

從來源不同的膠原蛋白及肽類制品氨基酸組分及N元素含量的分析表中可以看出[14-15]，由于膠原蛋白的特殊氨基酸組成導(dǎo)致其中甘氨酸的含量約占總氨基酸含量的三分之一左右，所以N元素的含量比一般的牛奶、雞蛋蛋白的（16%）含量要高，如阿拉斯加鱈魚膠原蛋白中N元素含量為18.7%，折算后凱氏定氮的系數(shù)只有5.35，牛皮膠原蛋白中N元素含量為17.54%，折算的凱氏定氮系數(shù)為5.70，因此國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中膠原蛋白及肽類制品中蛋白質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)目中，凱氏定氮法折算常數(shù)是5.79，而不是一般的6.25。

由于羥基脯氨酸是膠原蛋白中特異性的氨基酸，在其他蛋白中不存在或很少存在，所以采用測(cè)定羥基脯氨酸含量的方法來比較產(chǎn)品中膠原蛋白的有效含量更為可靠。羥基脯氨酸含量的測(cè)定一般采用比色法，具體步驟可以參照GB/T 9695.23-2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測(cè)定》[16]。由于羥基脯氨酸含量測(cè)定過程中的影響因素[17]較多，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格控制顯色及測(cè)定的溫度和時(shí)間。此方法測(cè)定過程中不需要昂貴的儀器和設(shè)備，方法適用性強(qiáng)。

就不同原料得到的膠原蛋白產(chǎn)品中羥脯氨酸含量而言，最低的是深海魚膠原蛋白或肽類制品。即當(dāng)產(chǎn)品中羥脯氨酸含量相同的情況下，深海魚制品中膠原蛋白或肽類的有效含量最高，這也是當(dāng)前大部分膠原蛋白聲明其產(chǎn)品來源于深海魚的原因之一[18]。由表1可以看出，對(duì)于牛皮或豬皮膠原蛋白來說，每1 000個(gè)氨基酸殘基中，羥脯氨酸含量分別為94和91個(gè)，而對(duì)于大西洋鱈魚和阿拉斯加鱈魚來講，分別為51和55個(gè)，折算成質(zhì)量分?jǐn)?shù)后，羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）的最高含量約11.57（牛皮），最低含量最低約為6.12%（大西洋鱈魚）。在GB/T 22729－2008[19]《海洋魚低聚肽粉》中，海洋魚皮低聚肽粉中羥脯氨酸含量的限定≥3%，海洋魚骨低聚肽粉中羥脯氨酸含量≥2%，標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)偏低；而商業(yè)部中SB/T 10634－2011《淡水魚膠原蛋白肽粉》中羥脯氨酸含量限定≥5.5%的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過計(jì)算比較合適。為了保證測(cè)定樣品中羥基脯氨酸來源于膠原蛋白或其肽類制品，還有必要測(cè)定樣品中游離羥基脯氨酸占總羥基脯氨酸的比例，目前只有國(guó)家商務(wù)部發(fā)布的“淡水魚膠原蛋白肽粉國(guó)內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) SB/T 10634－2011《淡水魚膠原蛋白肽粉》[20]”中，對(duì)此項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了明確的規(guī)定，即游離羥基脯氨酸與總羥脯氨酸的質(zhì)量比≤5%。

另外由于膠原蛋白特殊的結(jié)構(gòu)[21]，甘氨酸殘基的量是所有氨基酸中含量最多的，約占總氨基酸殘基數(shù)量的33%，折算成質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其含量不小于總量的18%。但是目前我國(guó)的膠原蛋白及肽類制品標(biāo)準(zhǔn)中尚沒有甘氨酸以及L-脯氨酸、丙氨酸的限定指標(biāo)。在2010版國(guó)家藥典中規(guī)定，阿膠中L-羥脯氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、丙氨酸這4種氨基酸的含量分別不得少于8.0%、18.0%、10.0%、7.0%。由于阿膠的原料是驢皮，其氨基酸組分相對(duì)穩(wěn)定，所以檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)較為容易確定。市售的膠原蛋白及肽類制品原料來源雖然復(fù)雜，但也可借鑒藥典中對(duì)于阿膠氨基酸成分的規(guī)定，采用測(cè)定多種氨基酸含量的方法綜合評(píng)定產(chǎn)品。

測(cè)定氨基酸的方法為高效液相色譜法或氨基酸自動(dòng)分析儀法[22]，具體操作步驟參見GB/T 22729－2008《海洋魚低聚肽粉》中6.3.2.2.1氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定方法和6.3.2.2.1高效液相色譜儀測(cè)定法測(cè)定氨基酸含量。

現(xiàn)今我國(guó)市售的膠原蛋白及肽類制品多為水產(chǎn)（淡水或海洋魚類）膠原蛋白，少量來源于牛皮和牛骨。對(duì)于水產(chǎn)品，由于其具有富集水中重金屬離子的作用，所以其膠原蛋白及肽類制品一般要檢測(cè)重金屬離子含量，如無機(jī)砷、甲基汞、鉛、鎘等，具體的檢測(cè)過程參見金屬離子相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無機(jī)砷的測(cè)定》[23]，GB/T 5009.12-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉛的測(cè)定》[24]，GB/T 5009.15-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測(cè)定》[25]和GB/T 5009.17-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》[26]，對(duì)于來源于牛皮和牛骨的膠原蛋白及肽類制品尚需要補(bǔ)充鉻的指標(biāo)，以防止制革后皮料的誤入。

膠原蛋白及肽類制品的微生物檢測(cè)及感官評(píng)價(jià)的方法本文不再論述，應(yīng)符合我國(guó)食品或保健食品通用衛(wèi)生要求。

表2 我國(guó)膠原蛋白肽理化指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)匯總Table 2 Physicochemical Properties index from different criterions

3 產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定

目前，我國(guó)現(xiàn)有的膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)及其適用范圍的詳細(xì)介紹如下：

QB 2732－2005《水解膠原蛋白》[27]：由國(guó)家發(fā)展改革委員會(huì)于2005年7月發(fā)布的輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，適用于以明膠為原料生產(chǎn)的水解膠原蛋白粉和水解膠原蛋白水溶液，主要檢測(cè)膠原蛋白產(chǎn)品的微生物指標(biāo)和理化指標(biāo)。此標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定物質(zhì)較全面，指標(biāo)要求較高，但沒有對(duì)羥脯氨酸含量的限定。由于目前膠原蛋白肽生產(chǎn)一般以動(dòng)物的皮、骨等為原料，經(jīng)熱提取后加酶水解得到，而明膠是膠原蛋白肽制備過程中的一個(gè)中間產(chǎn)物，但并不是直接采用明膠作為初始原料提取膠原蛋白[28]，所以一定程度上導(dǎo)致了適用范圍上的模糊，給使用帶來了不便。

GB/T 22729－2008《海洋魚低聚肽粉》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)于2008年12月發(fā)布的中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，適用于以海洋魚皮、魚骨、魚肉為原料，酶解法生產(chǎn)，分子量低于1 000 u的低聚肽（短肽）為主要成分的粉末狀產(chǎn)品。產(chǎn)品按類別包括海洋魚皮膠原低聚肽粉、海洋魚骨膠原低聚肽粉、海洋魚肉低聚肽粉3類。此標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的理化指標(biāo)相對(duì)較少，要求比較寬泛，增加了分子量大小的限制，要求分子量范圍要小于1000u。

經(jīng)查文獻(xiàn)，分子量一般不用u作單位，而是道爾頓（Da）[29]。而且對(duì)于目前膠原蛋白產(chǎn)品，其分子量范圍不一定會(huì)低于1 000 Da，過分強(qiáng)調(diào)小分子量而降低了其他理化指標(biāo)的要求，在檢測(cè)中可能會(huì)出現(xiàn)主次顛倒的問題。

SB/T 10634－2011《淡水魚膠原蛋白肽粉》：中華人民共和國(guó)商務(wù)部于2011年12月發(fā)布的國(guó)內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，適用于以淡水魚皮和魚鱗為原料，酶解法生產(chǎn)，分子量低于5 000 Da的膠原蛋白肽粉。此標(biāo)準(zhǔn)適用范圍較窄（只限于淡水魚），測(cè)定的理化指標(biāo)較為全面[30]，其中首次引入游離羥脯氨酸占總羥脯氨酸的概念。與GB/T 22729－2008《海洋魚低聚肽粉》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比，其分子量放寬到低于5 000 Da。但后面具體項(xiàng)目要求中包含分子量低于5 000 Da的膠原蛋白肽含量不小于85%、75%、65%等，則會(huì)帶給人分子量不低于5 000 Da的另外15%、25%、35%的膠原蛋白肽部分到底適不適合本標(biāo)準(zhǔn)的疑問。

最后是較多的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)如Q/JYB 0065 S-2010《復(fù)配膠原蛋白粉》[31]：如由廣州金葉保健品有限公司2010年6月發(fā)布的廣東省食品安全企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，適用于以膠原蛋白粉，葡萄糖，植脂末為原料生產(chǎn)的復(fù)配膠原蛋白粉。此標(biāo)準(zhǔn)適用范圍較廣，測(cè)定物質(zhì)較全面，但指標(biāo)要求相對(duì)較低，同時(shí)缺少對(duì)羥脯氨酸含量的規(guī)定。

由以上分析可以看出，對(duì)于目前大量的以牛皮、豬皮、雞皮等為原料生產(chǎn)的膠原蛋白肽尚沒有統(tǒng)一的適用標(biāo)準(zhǔn)，即使對(duì)于大部分水產(chǎn)膠原蛋白肽，由于分子量限制，在使用上也有一定難度。

我國(guó)膠原蛋白肽理化指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)匯總見表2。

各標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)于蛋白質(zhì)含量均有具體的要求，標(biāo)準(zhǔn)2～4均標(biāo)示采用干基含量，1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)則沒有說明。其中標(biāo)準(zhǔn)2中蛋白質(zhì)含量以總氮占干基的百分比來表示，與其他標(biāo)準(zhǔn)不同。建議統(tǒng)一采用蛋白質(zhì)質(zhì)量占樣品質(zhì)量來表示。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于測(cè)定膠原蛋白中蛋白質(zhì)含量使用的方法多為凱氏定氮法，換算系數(shù)為5.79。同時(shí)由表2可以看出，不同標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于同一檢測(cè)項(xiàng)目，要求的具體指標(biāo)之間存在差異，而且對(duì)于水分、灰分差異較大，尚無較為統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

由于羥基脯氨酸是膠原蛋白及肽類產(chǎn)品標(biāo)志性的氨基酸，所以羥基脯氨酸含量指標(biāo)是標(biāo)準(zhǔn)中需要明確規(guī)定的。另外由于膠原蛋白特殊的結(jié)構(gòu)，甘氨酸是所有氨基酸中含量最多的，約占總蛋白質(zhì)33%，建議補(bǔ)充規(guī)定樣品中甘氨酸的含量指標(biāo)。

為了避免人為添加氨基酸，在標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定游離羥脯氨酸的含量也十分有必要，通過游離羥脯氨酸含量占總羥脯氨酸含量的數(shù)值，可以直觀準(zhǔn)確地檢測(cè)出樣品中是否存在人為添加羥脯氨酸的造假現(xiàn)象。

4 結(jié)論

本文在前人研究的基礎(chǔ)上重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了膠原蛋白的稱謂界定，明確“膠原蛋白”與“膠原蛋白肽”兩種不同的概念。在制定膠原蛋白產(chǎn)品的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)上，文中對(duì)各類理化指標(biāo)的制定給出了參考意見，同時(shí)建議通過幾個(gè)指標(biāo)綜合評(píng)定來對(duì)膠原蛋白及其肽類制品進(jìn)行定性及定量檢測(cè)，即在常見的水分、灰分、粗蛋白的基礎(chǔ)上增加羥基脯氨酸、甘氨酸、游離羥基脯氨酸含量、重金屬離子含量等指標(biāo)的檢測(cè)，為制定更為科學(xué)規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

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