姜黃素對人食管癌Eca-109細(xì)胞放射增敏作用的研究

(青島大學(xué)，山東 青島 266003； 1 附屬醫(yī)院腫瘤科； 2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

食管癌是指原發(fā)于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，為常見惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。在全球范圍內(nèi)，食管癌居于腫瘤死因的第6位。2010年由中國國家癌癥中心發(fā)布，食管癌發(fā)病率位居我國惡性腫瘤的第5位，死亡率位居惡性腫瘤的第4位[1]。由于病人就診時多為中晚期，食管癌病人僅約25%可行食管根治術(shù)，同時研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過術(shù)前放療可以提高手術(shù)切除率[2]。對于中段及上段的食管癌病人，放射治療和手術(shù)是最主要和有效的治療手段。但是由于放射治療的療效受多種因素的影響，尋找可以增敏的藥物對提高療效具有重要作用。姜黃素是從草本植物姜黃、郁金、菖蒲等根莖中提取出的一種酸性多酚類物質(zhì)，具有極廣泛的藥理作用，可調(diào)控多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，如趨化因子、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、炎性因子、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、酶、藥物抗性蛋白、受體、DNA等[3-6]。同時姜黃素具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗凝、抗氧化及抗類風(fēng)濕等功效[7-8]。本研究旨在探討姜黃素對食管癌Eca-109細(xì)胞的放療增敏作用，以便于臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人食管癌細(xì)胞系Eca-109購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。姜黃素購買自美國Sigma公司，純度為95%。胎牛血清購買自南美HyClone公司。PRIM-1640培養(yǎng)基購自北京賽默飛世爾公司。6 MV醫(yī)用直線加速器(型號23EX)購自美國Varian公司。流式細(xì)胞儀(型號Flow-CheckTM)購自德國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的PRIM-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃，含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d細(xì)胞傳代一次，細(xì)胞貼壁生長至對數(shù)生長期，且細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2CCK-8法測定姜黃素對Eca-109細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量約為5 000個。置于37 ℃，含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞貼壁時實驗組加入濃度分別為5、10、20、40和80 μmol/L的姜黃素，對照組加同等體積雙蒸水，每組設(shè)置5個復(fù)孔。將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育24和48 h，加入CCK-8。2 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度(A)值。計算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=100%-(A加藥-A空白)/(A對照-A空白)×100%，并計算細(xì)胞抑制率為10%的姜黃素濃度，即IC10，用于測定放療增敏性的實驗濃度。

1.2.3平板克隆法測定姜黃素對Eca-109細(xì)胞的放療增敏性 取對數(shù)生長期細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為(5～10)×106個/L，并接種于6孔培養(yǎng)板中。過夜，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為對照組和實驗組。實驗組加入10 μmol/L姜黃素，對照組加同等體積雙蒸水，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。兩組分別給予0、2、4、6、8 Gy放射線照射，然后繼續(xù)培養(yǎng)1 h。每2 d更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)約2周直至出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，行Giemsa染液染色，晾干，計數(shù)每個培養(yǎng)皿集落數(shù)，從而計算集落形成率(PE)及細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)。PE=照射劑量0 Gy時對照組的集落形成數(shù)/照射劑量0 Gy時對照組的接種細(xì)胞數(shù)×100%。SF=某一劑量照射實驗組的集落形成數(shù)/此組接種細(xì)胞數(shù)×集落形成率。存活曲線使用GraphPad Prism 5.0單靶多擊模型擬合，并計算準(zhǔn)閾劑量(Dq)、平均致死劑量(D0)、外推數(shù)(N)、2 Gy時的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF2)和放療增敏比(SER)。

1.2.4細(xì)胞凋亡測定 取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板中，待細(xì)胞過夜，將細(xì)胞分為對照組和實驗組。實驗組加入10 μmol/L姜黃素，對照組加同等體積雙蒸水，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，兩組分別給予0、2、4、6、8 Gy放射線照射。將經(jīng)過處理的細(xì)胞離心，棄上清液，PBS充分洗滌沉淀在底部的細(xì)胞3次，再次2 000 r/min離心5 min，逐滴加入體積分?jǐn)?shù)為0.70冰乙醇，邊加邊震蕩，使細(xì)胞充分分散，將樣品放入-4 ℃冰箱保存。取出固定的細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min棄上清液，加預(yù)冷的PBS 3 mL充分洗滌沉淀在底部的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，用400目的篩網(wǎng)過濾。2 000 r/min離心5 min，棄上清液。每管加入1 mL碘化丙啶染液染色，充分混勻，4 ℃避光保存30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測紅色熒光，然后采用細(xì)胞分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析。實驗重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞周期檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板中，待細(xì)胞過夜，將細(xì)胞分為空白組(A組)、加藥組(B組)、單純放療組(C組)以及放療和加藥組(D組)，D組以及B組加入姜黃素使其濃度為10 μmol/L，A、C組加同等體積雙蒸水，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將C、D組給予4 Gy放射線照射，離心，用預(yù)冷PBS洗滌沉淀3次，加入體積分?jǐn)?shù)0.70冰乙醇于4 ℃過夜。再次離心，于沉淀細(xì)胞中加入約1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞。每組細(xì)胞分為3管，每管加入0.5 mL碘化丙啶染色液，輕柔吹打細(xì)胞沉淀至單細(xì)胞懸液，4 ℃避光存放30 min。用流式細(xì)胞儀檢測紅色熒光，然后采用細(xì)胞分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量及細(xì)胞周期分析。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度姜黃素對食管癌Eca-109細(xì)胞增殖抑制作用

實驗結(jié)果表明，相同時間下不同藥物濃度對細(xì)胞生長抑制率差異有顯著性；不同時間下對生長抑制率差異有顯著性(F=280.21、5.53，P<0.05)。見表1。選擇IC10濃度為測定細(xì)胞放療增敏的實驗濃度[9]，即選取10 μmol/L姜黃素作用細(xì)胞24 h。

2.2 姜黃素對食管癌Eca-109的放射增敏比

使用姜黃素預(yù)處理過的Eca-109細(xì)胞的SF明顯低于對照組(F=3.55，P<0.05)。結(jié)果見表2。采用GraphPad Prism 5.0軟件，用單靶多擊模型SF=1-(1-еxp-Dq/D0)N，擬合生存曲線，如圖1所示，計算得到N、D0、Dq、SF2、SER。見表3。

表1 姜黃素對Eca-109細(xì)胞的增殖抑制作用比較

表2 不同照射劑量對兩組Eca-109細(xì)胞SF的影響

2.3 姜黃素對Eca-109細(xì)胞凋亡的影響

姜黃素作用Eca-109細(xì)胞后接受放射與單純放射相比，細(xì)胞凋亡率差異具有顯著性(F=4.429，P<0.05)。實驗組隨著放射劑量的增加，凋亡率差異有顯著性(F=31.198，P<0.05)。見表4。

表4 兩組Eca-109細(xì)胞凋亡率比較

2.4 姜黃素對食管癌Eca-109細(xì)胞周期的影響

單純姜黃素處理可將Eca-109細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，單純放療也可阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，放療與姜黃素雙重作用可使更多細(xì)胞阻滯于G2/M期，差異有顯著性(F=6.786，P<0.05)。見表5。

分組G0/G1SG2/MA組53.23±0.2639.05±0.257.72±0.18B組46.24±0.0734.52±0.2919.24±0.32C組39.72±0.4329.61±0.3530.67±0.42D組12.04±0.1421.71±0.3866.25±0.24

3 討 論

放療增敏劑是一種化學(xué)或藥物制劑，當(dāng)與放射同時應(yīng)用時可以提高射線對生物體的殺傷效應(yīng)。本實驗根據(jù)放療增敏劑量的選擇原則[9]，選取對細(xì)胞生長抑制率低的低劑量濃度作為姜黃素對Eca-109細(xì)胞的放療增敏濃度。

劑量存活曲線反映的是照射劑量與細(xì)胞凋亡率之間的關(guān)系，是分析受照射細(xì)胞群體輻射效應(yīng)的一種模式[10]。劑量存活曲線的直線部分斜率的倒數(shù)為D0值，為細(xì)胞的平均致死劑量。D0值代表細(xì)胞放射敏感性的高低。Dq是準(zhǔn)閾劑量，為克服肩區(qū)所需的劑量，代表細(xì)胞亞致死性損傷修復(fù)的能力。細(xì)胞接受照射后受到亞致死性損傷，并不造成死亡，經(jīng)過一定時間，細(xì)胞所受損傷可被修復(fù)，稱為亞致死性損傷修復(fù)。SF2為離體腫瘤細(xì)胞經(jīng)受2 Gy照射后的SF，代表腫瘤細(xì)胞內(nèi)在放射敏感性[11]。D0、Dq、SF2值越小，細(xì)胞放射敏感性越高，細(xì)胞修復(fù)亞致死性損傷的能力越小，細(xì)胞內(nèi)在放射敏感性越高。本實驗中經(jīng)過姜黃素處理的Eca-109細(xì)胞較單純放療組D0、Dq、SF2值增大，SER為1.37，表明經(jīng)姜黃素處理的Eca-109細(xì)胞與對照組相比，放射敏感性高。

放療敏感性與凋亡有密切關(guān)系[12]。許多機(jī)制可激活細(xì)胞凋亡，有研究表明某些凋亡通路與放療敏感性相關(guān)。研究顯示，經(jīng)姜黃素處理后的宮頸癌HeLa細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)漸增，Bcl-2/Bax比值下降[13]。姜黃素可以增加促凋亡基因p53在G2細(xì)胞期的表達(dá)，并促使其凋亡[14]。JNK通路也與放療敏感及細(xì)胞凋亡有關(guān)[15-16]。在本實驗中，姜黃素和放射線的聯(lián)合作用對食管癌Eca-109細(xì)胞系有明顯促凋亡作用，伴隨放射劑量的增加細(xì)胞凋亡比例明顯增高。改變細(xì)胞凋亡水平可能增加放療的敏感性。

細(xì)胞周期有4個階段，包括G1、S、G2、M期，其中G2、M期對放療敏感性最高，G1期次之，對放療敏感性最差的是G0、S期。使腫瘤細(xì)胞停留在G2和M期是增強(qiáng)放療敏感性的一個重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可使鼻咽癌細(xì)胞G1期增加、G2/M期阻滯，從而增加放療敏感性[17]。喉癌Hep-2細(xì)胞系細(xì)胞周期G2/M期阻滯也可增加放療增敏性[18]。姜黃素組和射線的聯(lián)合應(yīng)用比放射線的單獨(dú)應(yīng)用增大了宮頸癌細(xì)胞的凋亡率，且處于G0/G1期的細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞周期阻滯于G2/M期[19-20]。本實驗中，姜黃素將食管癌Eca-109細(xì)胞系阻滯于G2/M期，增加了其放射增敏性。

總之，姜黃素對人食管癌Eca-109細(xì)胞系有增殖抑制作用，并與時間和劑量有關(guān)，并且可以增加Eca-109細(xì)胞系的SER，增加其細(xì)胞凋亡，阻滯其細(xì)胞周期。本實驗為下一步探討姜黃素對人食管癌Eca-109細(xì)胞放射增敏的具體機(jī)制提供了依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 陳萬青,張思維,曾紅梅,等. 中國2010年惡性腫瘤發(fā)病與死亡[J]. 中國腫瘤, 2014,23(1):1-10.

[2] 董國華,許飚,姚圣,等. 食管癌放療后手術(shù)切除116例臨床分析[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報, 2013,26(9):948-951.

[3] PUTERI B, NAZILAH S, SHAIK F K, et al. Curcumin improves the efficacy of cisplatin by targeting cancer stem-like cells through p21 and cyclin D1-mediated tumour cell inhibition in non-small cell lung cancer cell lines[J]. Oncol Rep, 2016,35(1):13-25.

[4] 高文,何彥津,梁鳳鳴. 姜黃素抗腫瘤血管生成分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 國際眼科雜志, 2016,16(3):466-468.

[5] 李軍,熊琨,龔元,等. 基于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的姜黃素抗氧化機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2016,47(13):2373-2380.

[6] 李強(qiáng),趙曙光,王旭霞,等. 姜黃素激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對人肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2010,19(2):154-156.

[7] BIMONTE S, BARBIERI A, LEONGITO M, et al. Curcumin anticancer studies in pancreatic cancer[J]. Nutrients, 2016,8(7):433.

[8] 涂燕華,孫連娜. 姜黃素與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)實驗研究進(jìn)展[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2012,18(19):310-314.

[9] 魏偉,吳希美,李元建. 藥理實驗方法學(xué)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2010:976-978.

[10] 朱廣迎. 放射腫瘤學(xué)[M]. 北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社, 2005:98-139.

[11] 江浩. 腫瘤細(xì)胞SF-2的放射生物學(xué)意義及臨床價值[J]. 實用癌癥雜志, 2002,17(5):558-560.

[12] TOFILON P J, CAMPHAUSEN K. Molecular targets for tumor radiosensitization[J]. Chem Rev, 2009,109(7):2974-2988.

[13] SINGH M, SINGH N. Molecular mechanism of curcumin induced cytotoxicity in human cervical carcinoma cells[J]. Mol Cell Biochem, 2009,325(2):107-119.

[14] CHOUDHURI T, PAL S, DAS T, et al. Curcumin selectively induces apoptosis in deregulated cyclin D1-expressed cells at G2phase of cell cycle in a p53-dependent manner[J]. J Biol Chem, 2005,280(20):20059.

[15] 侯炳旭,馮麗英. JNK信號通路介導(dǎo)的凋亡在疾病中的作用[J]. 世界華人消化雜志, 2011(17):1819-1825.

[16] SUI X, KONG N, YE L, et al. P38 and JNK MAPK pathways control the balance of apoptosis and autophagy in response to chemotherapeutic agents[J]. Cancer Lett, 2014,344(2):174-179.

[17] WANG J, CHANG L, LAI X, et al. Tetrandrine enhances radiosensitivity through the CDC25C/CDK1/cyclin B1 pathway in nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Cell Cycle, 2017(1):33.

[18] 梁慧玲,何曉琴,甘園園,等. SHIP2在放射線處理后喉癌Hep-2細(xì)胞中的增殖、凋亡及細(xì)胞周期中作用[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報, 2017,14(36):4-8,20.

[19] 沈方方,李銀萍. CYP 2J2和MMP-9在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2014,35(1):81-84.

[20] 張莉,鄧守恒,李芳,等. 姜黃素體外同步放療對宮頸癌細(xì)胞增殖影響的實驗研究[J]. 山西醫(yī)藥雜志(下半月刊), 2013,42(4):369-371.