紅三葉根際促生菌中具生防效果菌株篩選、鑒定及特性研究

李海云，姚 拓*，張 榕，榮良燕,，馬亞春，張惠榮，羅慧琴，李政璇，高亞敏，張建貴

（1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2 甘肅省草原技術(shù)推廣總站，甘肅蘭州 730010；3 甘肅省農(nóng)牧廳外資項目管理辦公室，甘肅蘭州 730030）

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，作物病蟲害主要依靠化學(xué)農(nóng)藥進行防治，但由此造成的病原菌和害蟲的抗藥性以及土壤和作物中的農(nóng)藥殘留，給人類健康和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的危害。近年來，生物防治以其無毒害、不污染環(huán)境、不易引起抗藥性等特點備受世界各國的廣泛關(guān)注，許多生防菌劑已成功地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[1–4]。與此同時，利用微生物進行土壤修復(fù)的研究也取得了很大的進展[5]。目前研究報道的生防菌主要包括：惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)、銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)[6]、熒光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens)[7,8]、波紋假單胞菌(Pseudomonas corrugata)[9]、歐文氏菌 (Erwinia chrysantemi)[10]、丁香假單胞菌 (Pseudomonas syringae)[11]、洋蔥伯克霍爾德菌 (Burkholderia cepacia)[12]、腸道沙門氏菌 (Salmonella enterica) 等[13]。針對不同生防菌的生防機理開展了大量研究。Helmy等[14]研究發(fā)現(xiàn)，從熒光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens) 等分離純化獲得的嗜鐵素可以有效抑制黑曲霉 (Aspergillus niger)、煙草赤星病菌 (Alternaria alternata)、黃曲霉 (Aspergillus flavus)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) 等病原菌的生長[15]。此外，植物根際促生菌還可利用抗生素誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性來拮抗病原微生物。

2015年國家農(nóng)業(yè)部明確提出了“一控、兩減、三基本”的目標(biāo)來治理農(nóng)村環(huán)境污染等突出問題。其中“兩減”是指把化肥、農(nóng)藥的施用總量減下來。岷山紅三葉病害前期防治依靠大量農(nóng)藥的施用，不但使病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，同時也嚴(yán)重影響了岷山紅三葉的藥用價值，因此，本研究旨在通過前期研究從岷山紅三葉根際分離篩選出的109株優(yōu)良促生菌株為供試菌株，從中篩選出具有生防能力的菌種資源并研究其生防特性，為制備促生、生防復(fù)合生物菌肥提供菌種資源和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 本課題組前期從岷山紅三葉根際分離的根際促生菌 (固氮、溶磷和分泌IAA) 109株，菌株編號為MHS1～MHS109。

1.1.2 供試病原菌 3種植物病原菌分別為：立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani)、黃瓜枯萎菌 (Fusarium oxysporium f. sp. cucumerinum)，西瓜尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum f. niveum)。

1.1.3 培養(yǎng)基 1) 鉻天青 (CAS) 培養(yǎng)基：菌株分泌鐵載體能力測定采用CAS培養(yǎng)基[16]，其成分為：CAS 0.02515 g，氯化鐵 0.0027 g，十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB) 0.1456 g，補加蒸餾水至0.1 L。

2) SA液體培養(yǎng)基：鐵載體定量使用SA液體培養(yǎng)基，具體配方為蔗糖 20.0 g、L-天門冬酰氨2.0 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、補加蒸餾水至1 L、調(diào)節(jié)pH為7.0。

3) PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂20 g、補加蒸餾水至1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 優(yōu)良生防菌株初篩 采用平板對峙法篩選優(yōu)良生防菌株。供試菌株經(jīng)LB平板培養(yǎng)基活化并接種至LB液體培養(yǎng)基，28℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。同時將3種病原真菌活化后接種至PDA平板培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)6 d。并將培養(yǎng)好的病原真菌制成直徑5 mm菌餅，接種至PDA培養(yǎng)基中心，同時將供試菌株發(fā)酵液接種于PDA培養(yǎng)基，接種位置距培養(yǎng)皿中心點2 cm。接種后，在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，測定3株病原真菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落半徑 (對照菌落半徑) 和病原真菌距離生防菌近端半徑 (處理菌落半徑)，將有拮抗能力的菌株斜面保存。

抑菌率 (%) = (對照菌落直徑 – 處理菌落直徑)/對照菌落直徑 × 100

1.2.2 生防菌發(fā)酵液對病原菌拮抗性測定 將初篩生防菌株活化接種至LB液體培養(yǎng)基，在28℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 d后，將菌懸液在10000 g離心20 min，用無菌過濾器 (0.22 μm) 過濾上清液2～3次，在4℃條件下保存。制備PDA平板培養(yǎng)基時，將其與發(fā)酵液混合均勻 (配比為9∶1)，設(shè)不加發(fā)酵液為對照。在PDA培養(yǎng)基中心接種病原菌菌餅，接種后，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)期間觀察各病原真菌的生長狀況，并測量病原真菌形成的菌落大小，計算抑菌率并篩選優(yōu)良生防菌株進行保存。

1.2.3 生防菌對病原菌菌絲生長的影響 將經(jīng)過生防菌發(fā)酵液處理的病原菌及對照組培養(yǎng)皿置于40 × 光學(xué)顯微鏡下，觀察菌落邊緣菌絲生長情況，記錄并拍照。

1.2.4 生防菌產(chǎn)鐵載體能力測定 1) 定性測定 將上述篩選出的生防菌，采用平板劃線接種到LB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)結(jié)束后，將各單菌株分別接種到CAS平板上，在28℃條件下培養(yǎng)6 d。觀察并記錄菌落及透明圈大小、顯色結(jié)果以及可溶性指數(shù)初步定性判斷菌株的產(chǎn)鐵載體能力。

2) 定量測定 將活化單菌株接種至SA液體培養(yǎng)基，以不接菌為對照。在28℃ 150 r/min下振蕩培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)結(jié)束后在4℃ 8000 g離心20 min，準(zhǔn)確吸取10 mL上清液，加入到10 mL CAS檢測液，混合均勻靜置1 h。測定其吸光值 (As630)。鐵載體活性單位為 (Ar – As)/Ar × 100，其中，Ar為對照組吸光值。

1.2.5 菌株鑒定 將上述篩選的優(yōu)良生防菌株進行活化，接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28℃ 150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在4℃ 10000 r/min離心1 min，棄上清液收集菌體沉淀。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌總DNA，利用細菌通用引物27F，1492R進行16S rRNA基因序列的擴增。反應(yīng)體系 (50 μL)：25 μL 2 × Taq PCR MasterMix，2 μL DNA 模板，引物各 2 μL，19 μL ddH2O。PCR 擴增參數(shù)為：預(yù)變性 (95℃，5 min)，變性 (95℃，30 s)，退火 (57℃，60 s)，延伸 (72℃，30 s)，重復(fù)循環(huán)30次，總延伸 (72℃，10 min)，保存在–20℃待用。序列測定由上海生物工程技術(shù)有限公司完成。測序后將16S rRNA基因序列采用EzBioCloud(http://www.ezbiocloud.net) 數(shù)據(jù)庫進行同源性序列比對，采用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值為1000次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌株初篩結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)，有8株供試生防菌株對3株供試病原菌具有拮抗作用 (表1)。其中，在培養(yǎng)第3 d時，對立枯絲核菌有抑制作用的菌株為MHS3、MHS27、MHS31和MHS39，抑菌率分別是10.1%、43.5%、35.3%和25.4%；對黃瓜枯萎菌有抑制作用的菌株為MHS3、MHS7、MHS38和MHS48，抑菌率在21.0%～40.7%之間，其中MHS7的抑菌率最高；對西瓜尖鐮孢菌有抑制作用的菌株為MHS31，MHS27，MHS9和MHS48，抑菌率分別為36.3%、35.6%、30.5%和22.8%。在培養(yǎng)第6 d時，生防菌對3種病原真菌的抑菌率有所提高，如菌株MHS7對黃瓜枯萎菌的抑菌率增長了33.1個百分點，但對其他兩種病原真菌沒有抑制作用。菌株MHS27、MHS31對立枯絲核菌的抑制率分別達到64.3%、71.2%，對西瓜尖鐮孢菌的抑制率分別達到了81.7%、64.5%。綜上，菌株MHS3、MHS7、MHS27、MHS31和MHS48對3種病原真菌的拮抗效果較好，故作為下一步研究的供試菌株。

2.2 生防菌發(fā)酵液對病原菌的拮抗效果

從表2可以看出，在培養(yǎng)3 d時，菌株MHS7、MHS27和MHS31發(fā)酵液對立枯絲核菌有抑制作用，MHS7的抑菌率最低 (8.2%)；在培養(yǎng)6 d時，菌株MHS27和MHS31對立枯絲核菌有抑制作用，抑菌率分別為40.1%、47.1%。此外，菌株MHS3在平板對峙試驗中表現(xiàn)出拮抗立枯絲核菌，但其發(fā)酵液無抑菌作用，說明MHS3抑制該病原真菌的作用機理不是其分泌物，而是需要活體細菌參與。在培養(yǎng)3 d時，菌株MHS7和MHS48發(fā)酵液對黃瓜枯萎菌有抑制作用，抑菌率分別為22.4%、25.0%；培養(yǎng)6 d時，抑菌率分別為26.1%、22.8%。在平板對峙試驗中表現(xiàn)出拮抗黃瓜枯萎菌的菌株MHS3和MHS38，其發(fā)酵液對病原菌沒有明顯的抑菌作用。菌株MHS3、MHS7、MHS48發(fā)酵液對西瓜尖鐮孢菌沒有抑制作用。綜上可知，生防菌株MHS7、MHS48對黃瓜枯萎菌和菌株MHS27、MHS31對立枯絲核菌和西瓜尖鐮孢菌的拮抗作用可能與其產(chǎn)生的分泌物及次生代謝產(chǎn)物有關(guān)。

2.3 生防菌對病原菌菌絲生長的影響

通過顯微鏡觀察病原菌菌絲生長情況發(fā)現(xiàn)，生防菌MHS7能使黃瓜枯萎菌的菌絲生長混亂，MHS27和MHS31能使立枯絲核菌和西瓜尖鐮孢菌的菌絲發(fā)生變化 (圖1)。其中，被菌株MHS7抑制的黃瓜枯萎菌菌絲畸形腫脹，生長雜亂；經(jīng)過菌株MHS27處理的西瓜尖鐮孢菌菌絲扭曲和纏繞，細胞壁變薄和破裂，并有溶解的趨勢，細胞質(zhì)溢出(圖1-B)；菌株MHS31使立枯絲核菌絲發(fā)生扭曲，生長雜亂，菌絲細胞內(nèi)的原生質(zhì)溢出，細胞內(nèi)含物稀少 (圖1-D)。所有對照組病原菌的菌絲生長規(guī)則，表面光滑，菌絲細胞壁完好，細胞質(zhì)均勻分布(圖 1-A、1-C)。

表 1 生防菌培養(yǎng)3 d和6 d對病原菌的拮抗效果Table 1 Antagonistic effect of the biocontrol bacteria on pathogenic fungus on the 3rd and 6th days

2.4 生防菌產(chǎn)鐵載體能力測定

2.4.1 生防菌產(chǎn)鐵載體定性檢測 通過測定8株生防菌株在CAS檢測平板上形成的菌落及周圍暈圈大小、顯色結(jié)果 (表3)，表明在CAS檢測平板上正常生長且形成桔黃色暈圈的菌株有4株，分別是菌株MHS7、MHS27、MHS31和MHS48。其中，暈圈直徑大于8 mm的菌株有MHS7、MHS27和MHS31。菌株MHS7暈圈最大 (9.63 mm)，其次為菌株MHS27 (9.00 mm)，菌株MHS31為8.84 mm。4株生防菌株可溶性指數(shù)分別是3.68、3.00、2.46和2.04(數(shù)值越大表示菌株分泌的鐵載體在培養(yǎng)基上的分布范圍就越大，在相同培養(yǎng)條件和時間內(nèi)，該菌株的產(chǎn)鐵載體能力越強)。本研究中產(chǎn)鐵載體能力由強到弱的生防菌依次為：MHS7 (3.68) ＞ MHS27 (3.00) ＞MHS31 (2.46) ＞ MHS48 (2.04)。其余 4株生防菌(MHS3、MHS9、MHS38和MHS39) 在平板對峙試驗中能夠拮抗病原真菌，但卻在CAS檢測平板上不產(chǎn)生桔黃色暈圈，即不產(chǎn)生鐵載體。

表 2 生防菌發(fā)酵液對病原菌的拮抗效果Table 2 Antagonistic effect of the biocontrol bacteria fermentation broth on pathogenic fungus

圖 1 生防菌發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的影響Fig. 1 Effect of biocontrol bacteria fermentation broth on mycelial growth of the pathogenic fungus

2.4.2 生防菌產(chǎn)鐵載體定量測定 為準(zhǔn)確測定供試菌株的產(chǎn)生鐵載體能力，本研究對8株生防菌株進行了定量測試 (表4)。通過定量分析測出各菌株在630nm處的吸光度值，并計算出鐵載體活性單位。從表4可以看出，菌株MHS7、MHS27、MHS31和MHS48具有較強的分泌鐵載體能力，鐵載體活性大小與定性測定結(jié)果相同。其它供試菌株在630 nm處的吸光度值 (As) 小于CK (Ar)，即表現(xiàn)為產(chǎn)生鐵載體能力相對較差或不產(chǎn)生鐵載體。

表 3 生防菌產(chǎn)鐵載體能力測定Table 3 The siderophore producing capacity of biocontrol bacteria

表 4 生防菌產(chǎn)鐵載體量Table 4 Amounts of siderophore production from bio-control bacteria

2.5 優(yōu)良生防菌株鑒定

本研究對4株優(yōu)良生防菌株進行16S rRNA基因序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖2)。菌株MHS7與特基拉芽孢桿菌 (AYTO01000043) 的相似性為99.73%，初步鑒定為特基拉芽孢桿菌 (Bacillus tequilensis)；菌株MHS27與溶蛋白芽孢桿菌(KJ812418) 的相似性為99.56%，初步鑒定為溶蛋白芽孢桿菌 (Bacillus proteolyticus)；菌株MHS31與Pseudomonas paralactis (KP756923) 的相似性為99.93%，初步鑒定為Pseudomonas paralactis；菌株MHS48與克雷伯氏菌 (AB004754) 的相似性為99.08%，初步鑒定為克雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca)。

3 討論

圖 2 基于16S rRNA基因序列同源性構(gòu)建的優(yōu)良生防菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of excellent bio-control bacteria based on the 16S rRNA gene sequences homology

植物根際不同生防菌種對植物病害的生防機制各不相同，主要作用機制有營養(yǎng)和空間位點的競爭、分泌抗菌物質(zhì)、寄生和誘導(dǎo)植物體抗性等。本研究通過測定生防菌株發(fā)酵液對病原菌的抑制作用和產(chǎn)鐵載體能力，發(fā)現(xiàn)生防菌株MHS7、MHS48發(fā)酵液對黃瓜枯萎菌，菌株MHS27、MHS31發(fā)酵液對立枯絲核菌和西瓜尖鐮孢菌具有拮抗作用。孫廣正等[17–19]研究發(fā)現(xiàn)，生防菌LHS11使番茄早疫病菌菌絲膨大變粗，菌株FX2使病原菌菌絲中膨大出球形節(jié)點，有些細胞中看不到細胞質(zhì)，僅剩細胞壁，對西葫蘆根腐病拮抗病原菌進行篩選，發(fā)現(xiàn)菌株LHS11使尖孢鐮刀菌菌絲扭曲、腫脹，隨著時間的延長，菌絲細胞壁溶解出現(xiàn)斷裂；菌株FX2和FX1使菌絲扭曲纏繞，局部變形。韓立榮等[20]研究發(fā)現(xiàn)11-3-1菌株對油菜菌核病菌菌絲生長有明顯影響，可致使油菜菌核病菌菌絲體畸形、扭曲和原生質(zhì)濃縮外滲等。說明這些菌株是通過營養(yǎng)競爭和空間位點競爭、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等其他方式抑制病原菌菌絲的生長。趙帥等[21]研究發(fā)現(xiàn)，菌株HD-087所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)能使黃瓜枯萎病病原菌菌絲畸形、分生孢子萌發(fā)受到抑制，抑制率可達72.1%。通過定性、定量測定生防菌株產(chǎn)鐵載體能力，生防菌株MHS7、MHS27、MHS31分別對黃瓜枯萎菌(Fusarium oxysporium f. sp. cucumerinum)、西瓜尖鐮孢菌 (Fusarium oxysporum f. sp. niveum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani) 具有一定的生防作用。這3種促生菌都具備較好的產(chǎn)鐵載體性能，可見，產(chǎn)鐵載體是岷山紅三葉根際促生菌 (MHS7、MHS27、MHS31)拮抗上述3種病原真菌的主要原因之一。Helmy等[14]從熒光假單胞菌 (P. fluorescens)、銅綠假單胞菌 (P.aeruginosa) 等菌株分離純化的嗜鐵素可以抑制黑曲霉 (Aspergillus niger)、歐文氏病菌 (Erwinia carotovora)、煙草赤星病菌 (Alternaria alternata)、黃曲霉 (Aspergillus flavus)、尖孢鐮刀菌 (Fusarium oxysporum) 等病原菌的生長[15]。林超等[22]將產(chǎn)鐵載體的洋蔥伯克霍爾德氏菌 (Burkholderia cepacia) 接種至芒果，其炭疽病發(fā)病率降低了14%。近年來研究表明，生防菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對防控植物病害也有一定的作用。其中，報道較多的有熒光假單胞菌，它可以產(chǎn)生胞外殼聚糖酶、溶菌酶、幾丁質(zhì)酶、木聚糖酶等[23-24]，通過這些次生代謝產(chǎn)物可以有效控制植物病害。為了證明次生代謝產(chǎn)物的生防途徑，研究學(xué)者利用基因控制技術(shù)，將合成次生代謝產(chǎn)物的前體物質(zhì)進行基因突變，發(fā)現(xiàn)合成次生代謝產(chǎn)物的功能缺失之后，防病能力明顯下降，經(jīng)分離純化的次生代謝產(chǎn)物可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[22]。綜上，不同生防菌的生防途徑和生防機理存在多樣性，即使是同一種生防菌在不同植物上也會產(chǎn)生不同的作用效果。植物病害生物防治從室內(nèi)到田間還存在很大的差距，本研究篩選的具有生防效果的促生菌株的生防機理和田間防治效果尚需進一步研究和分析。

4 結(jié)論

從岷山紅三葉根際促生菌中篩選出8株對立枯絲核菌、黃瓜枯萎菌和西瓜尖鐮孢菌具有拮抗效果的菌株，即菌株MHS3、MHS7、MHS9、MHS27、MHS31、MHS38、MHS39和MHS48。生防菌株MHS7、MHS48發(fā)酵液對黃瓜枯萎菌，菌株MHS27、MHS31發(fā)酵液對立枯絲核菌和西瓜尖鐮孢菌具有拮抗作用。產(chǎn)嗜鐵素是生防菌 (MHS7、MHS27、MHS31、MHS48) 拮抗立枯絲核菌、黃瓜枯萎菌和西瓜尖鐮孢菌的主要途徑之一。經(jīng)16S rRNA基因序列分析初步鑒定：菌株MHS7為特基拉芽孢桿菌 (Bacillus tequilensis)，菌株MHS27為溶蛋白芽孢桿菌 (Bacillus proteolyticus)，菌株MHS31為Pseudomonas paralactis，菌株MHS48為克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。

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