生物表面活性劑Surfactin的界面行為研究

李艷艷 白 晶 張 劍

（1. 山西大學化學化工學院，山西太原，030006；2. 山西勇寧記科技有限公司，山西太原，030006）

生物表面活性劑Surfactin是由微生物枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生的具有兩親結(jié)構(gòu)特征的次級代謝產(chǎn)物，屬于胞外產(chǎn)物，呈晶狀形貌[1,2]，是迄今報道的表面活性最強的表面活性劑種類之一。生物表面活性劑Surfactin具有表面活性強大、乳化和發(fā)泡性能良好[3-4]、毒性低、易生物降解、環(huán)境無污染等優(yōu)良特性，同時還具有抗真菌和細菌，溶解血液紅細胞、原生質(zhì)體和原生質(zhì)球等生物活性[5]。如能將水的表面張力從72mN/m降低到27mN/m，將十六烷烴的界面張力降至1mN/m[6]；可以有效保持食品的口感和風味，并且可以有效抑制食品中有害微生物的滋生，起到食品防腐的作用[7]。鑒于Surfactin強大的表面活性和生物活性，其在環(huán)保行業(yè)、石油開采行業(yè)、高端化妝品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、食品加工行業(yè)等有很廣泛的用途[8]。近幾年來，Surfactin在醫(yī)藥行業(yè)的相關(guān)應(yīng)用研究受到國內(nèi)外研究者的廣泛青睞，這使得Surfactin在抗病毒制劑[9]、抗腫瘤制劑[10]、溶血栓制劑[11]、口服免疫佐劑[12]、乙肝疫苗[13]以及糖尿病治療[14]等方面的應(yīng)用研究取得了重大突破。

研究表明，生物活性分子的表面活性和生物活性主要在界面處發(fā)生，并受活性分子在親水-疏水界面上分子形態(tài)的影響[15]。因此，關(guān)于Surfactin界面行為的研究對于進一步促進Surfactin表面活性和生物活性的應(yīng)用是非常必要的；關(guān)于Surfactin在界面處分子形態(tài)的研究對于了解Surfactin的界面行為起著至關(guān)重要的作用，有助于從分子水平認識其活性作用機制。而界面處的分子形態(tài)主要是指兩親分子在界面定向?qū)拥呐帕蟹绞?、分子?gòu)型與取向以及在定向?qū)觾?nèi)可能形成的特殊結(jié)構(gòu)如微區(qū)和有序分子聚集體等。另一方面，對于Surfactin這類兩親分子在氣-液界面的分子組裝及其LB膜構(gòu)筑的研究，將擴展其在分子組裝體領(lǐng)域的研究和應(yīng)用[16]。本文介紹了Surfactin的結(jié)構(gòu)、Surfactin在氣-液界面上的分子形態(tài)、Surfactin在氣-液界面上的分子組裝以及LB膜構(gòu)筑、Surfactin在油-水界面上的界面行為、Surfactin在固-液界面上的界面行為，對了解Surfactin的表面活性以及生物活性的作用機理具有重要意義。

1 Surfactin的結(jié)構(gòu)

生物表面活性劑Surfactin是一系列具有相似基本結(jié)構(gòu)的環(huán)狀脂肽的總稱。其基本結(jié)構(gòu)是b-羥基脂肪酸和多肽以內(nèi)酯鍵結(jié)合而成的環(huán)狀脂肽，該肽含有7個氨基酸，排列順序一般為L-Glu1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Leu7，其中第一位的Glu（谷氨酸）和第五位的Asp（天冬氨酸）是酸性氨基酸，這使得整個Surfactin分子可帶負電且容易形成鹽類，并且位置7-，4-，2-的氨基酸容易被其他氨基酸替換，另外，b-羥基脂肪酸鏈的長度為C13-C15，Surfactin的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1[16-19]：

圖1 Surfactin的結(jié)構(gòu)示意圖[16]

Surfactin系列物結(jié)構(gòu)上的差別就在于幾個位置的氨基酸的種類不同以及氨基酸的連接順序不同，同時碳鏈的長度及支鏈位置也不相同。目前，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并且分離出來的Surfactin結(jié)構(gòu)類似物有以下12種（見表1）[19]。

Surfactin分子的構(gòu)成決定了它是同時具有親水性和疏水性的兩親性物質(zhì)[20]。它的環(huán)肽中的谷氨酸（Glu）殘基和天冬氨酸（Asp）殘基提供了親水結(jié)構(gòu)域，其他氨基酸殘基和脂肪酸鏈提供了疏水結(jié)構(gòu)域，并且肽環(huán)中的氨基酸殘基之間可以形成氫鍵，這促使Surfactin分子在水中形成了b折疊結(jié)構(gòu)，類似于馬鞍[21]。馬鞍分為兩面，其中一面由第1、5位氨基酸殘基和相鄰的第2、6位氨基酸殘基構(gòu)成：氨基酸殘基L-Leu2和D-Leu6彼此面對，氨基酸殘基L-Glu1和L-Asp5構(gòu)成了極性親水結(jié)構(gòu)域；另一面由第3、4、7位氨基酸殘基和脂肪酸鏈構(gòu)成：氨基酸殘基D-Leu3、L-Val4和L-Leu7與脂肪酸鏈構(gòu)成疏水結(jié)構(gòu)域[22-23]。

2 Surfactin的界面行為

2.1 氣-液界面處分子的行為

Surfactin在氣-液界面處分子形態(tài)的研究對于了解Surfactin界面行為起著至關(guān)重要的作用。氣-液界面的分子形態(tài)主要是指兩親分子在表面定向?qū)拥呐帕蟹绞?、分子?gòu)型與取向以及在定向?qū)觾?nèi)可能形成的特殊結(jié)構(gòu)如微區(qū)和有序分子聚集體等，其有助于從分子水平認識其活性作用機制。而在氣-液界面的分子組裝及其LB膜構(gòu)筑的研究，將擴展其在分子組裝體領(lǐng)域的研究和應(yīng)用[16]。

2.1.1 氣-液界面處分子形態(tài)的研究

Hsin-Hui Shen等人[24]使用中子衍射技術(shù)研究了空氣-水界面處Surfactin在不同pH和一價/二價陽離子存在下的界面行為。中子衍射譜記錄了空氣-水界面處pH和離子強度對Surfactin結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示：Surfactin具有疏水性球狀結(jié)構(gòu)，并且pH和陽離子的變化導(dǎo)致每個Surfactin分子所占面積的變化和親水性的變化，但都存在緊湊的球狀結(jié)構(gòu)。同時他們還研究了Surfactin在不同的pH和離子的條件下空氣-水界面的吸附層結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果表明：Surfactin具有球形結(jié)構(gòu)和頭部基團，比大多數(shù)常規(guī)合成表面活性劑的疏水基團要小得多，并且觀察到兩種不同的與頭部基團相關(guān)的Surfactin結(jié)構(gòu)，但這兩種結(jié)構(gòu)并沒有太大的差異。另外，由于Surfactin分子之間電荷的排斥作用和帶負電的頭部基團對脂質(zhì)體的增溶作用使得Surfactin強烈影響膜結(jié)構(gòu)使平面膜不穩(wěn)定和形成囊泡，類似于抗生素肽，因此中性Surfactin比在高pH值下帶電的Surfactin具有更高的疏水性，這可能會導(dǎo)致中性的Surfactin的表面活性更高且溶血活性更高。

表1 Surfactin的系列物[19]

Maget-Dana等人[25]研究了Surfactin在氣-液界面的吸附行為。發(fā)現(xiàn)液相的pH值強烈影響Surfactin在氣-液界面的吸附參數(shù)，如圖2所示。在pH=10的堿性環(huán)境下，Surfactin稀溶液（5×10-8M）很快在氣-液界面達到吸附平衡；當濃度為5×10-8～5×10-7mol/L時，其界面最大吸附量Γmax約為3×1018molecule/m2，這個數(shù)值相當于每個分子所占的面積僅為30?2，表明Surfactin分子在界面上的排列很緊密。他們還發(fā)現(xiàn)Surfactin在氣-液界面很容易擴散。

圖2 液相pH對表面壓-分子面積(π-A)曲線的影響[25]

2.1.2 氣-液界面處分子組裝及其LB膜的研究

Chang-Sheng Song等人[26]用LB膜技術(shù)將Surfactin單分子層從空氣-水界面轉(zhuǎn)移到云母基質(zhì)上，用原子力顯微鏡（AFM）進行了表征，從而研究了沉積壓力對SuC14（具有14個C的b-羥基脂肪酸鏈的Surfactin系列物）的LB膜形貌的影響。原子力顯微鏡的圖像顯示在較低的沉積壓力下有相分離，表明存在Surfactin結(jié)構(gòu)域。在較高的沉積壓力下，云母基質(zhì)完全被Surfactin單層覆蓋，球形聚集體形成于頂部。他們還將Surfactin系列物（相同的極性頭，不同的脂肪烴鏈長度）用于研究疏水鏈長度對聚集行為的影響，使用AFM和FTIR技術(shù)進行表征。AFM可以觀察到沉積Surfactin的LB膜中的納米尺寸的二維分子簇，發(fā)現(xiàn)表面簇的形態(tài)受到疏水鏈長度的影響，表面聚集物的形式和大小的差異可能是由于疏水鏈構(gòu)象的變化造成的；FTIR研究表明：Surfactin內(nèi)酯環(huán)上羧基氫鍵參與表面聚集體的形成。他們提出了氣-液界面處的表面聚集物的一種形成過程，提出因為疏水相互作用，自組裝分子的疏水鏈聚集在團簇的中心，并凸向空氣，而親水肽環(huán)通過氫鍵進行排列。他們的研究關(guān)注于Surfactin的LB膜上的聚集體形成，為兩親性脂肽在空氣-水界面的界面行為提供了新的見解。這對于了解Surfactin的顯著特性是非常重要的，如驅(qū)動陽離子進入生物細胞膜以及Surfactin與細胞膜脂質(zhì)之間的相互作用。然而，Surfactin的LB膜中的球形團簇的結(jié)構(gòu)以及這些表面聚集體的形成機理尚不明確。因此，可將原位儀器等如布魯斯特角顯微鏡和原位紅外光譜用于研究空氣-水界面上分子聚集行為來獲取界面處分子水平上的結(jié)構(gòu)信息。

Maget-Dana等人[25]利用Langmuir膜天平研究了液相pH、溫度以及陽離子對表面壓-分子面積(π-A)曲線的影響，從而報道了Surfactin在空氣-水界面的界面性質(zhì)。他們發(fā)現(xiàn)在酸性的亞相環(huán)境下，π-A曲線主要由擴張膜（Ⅰ區(qū)）、平臺區(qū)（Ⅱ區(qū)）和固態(tài)膜（Ⅲ區(qū)）構(gòu)成，如圖3。他們認為在擴張態(tài)，Surfactin分子中的肽環(huán)和脂肪烴鏈平躺在氣-液界面；在平臺區(qū)，分子中的肽環(huán)和脂肪烴鏈逐漸直立；而在固態(tài)膜中，分子中的肽環(huán)和脂肪烴鏈完全垂直于界面。

圖3 Surfactin在空氣-水界面表面壓-分子面積(π-A)曲線[25]

Yutaka Ishigami等人[27]研究了Surfactin在酸性亞相上鋪展的單分子膜的行為、結(jié)構(gòu)和分子取向，并用暗場電子顯微鏡（dark- fi eld electron microscope）在Surfactin的LB膜（Langmuir-Blodgett film）上觀察到有球形的表面聚集體存在，推測Surfactin分子由于脂肪烴鏈之間存在疏水相互作用而形成二聚體。在單分子膜的擴張態(tài)，二聚體中的脂肪鏈平躺在界面上，隨著表面膜的壓縮，二聚體中的脂肪烴鏈逐漸直立，而肽環(huán)始終水平地仰臥在界面，如圖4。在平臺區(qū)，由于分子的b-片層（b-sheet）結(jié)構(gòu)，Surfactin分子可能緊密堆積、形成非均勻的多層膜，并且進一步壓縮表面膜有利于二維Surfactin分子的重新定向，使分子之間的接觸更加緊密，但會促成多層不均勻薄膜的形成。

2.2 油-水界面處分子的行為

圖4 Surfactin在氣-液界面的結(jié)構(gòu)示意圖[27]

Nicolas等人[28]研究了己烷-水界面處Surfactin分子的界面行為。運用分子動力學研究了親疏水介質(zhì)系統(tǒng)己烷-水界面處不同界面濃度下生物表面活性劑Surfactin的動力學性質(zhì)。記錄了Surfactin分子的形狀和取向，如氫鍵和Ramachandran角，用來研究環(huán)境對分子結(jié)構(gòu)的影響。證明Surfactin分子的肽環(huán)部分在界面采用四面體形狀，類似于緊湊的“馬鞍形”構(gòu)象，肽環(huán)骨架結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出很大的靈活性，構(gòu)象運動和結(jié)構(gòu)波動強烈依賴于界面濃度，如圖5。圖5顯示了Surfactin的濃度對“馬鞍形”構(gòu)象形狀和取向的影響、肽環(huán)部分的翻轉(zhuǎn)以及分子的聚集狀態(tài)（adih表示肽環(huán)形成的二面角用來表征肽環(huán)的形狀，Sheight表示肽環(huán)底部到頂部的高度用來表征肽環(huán)取向）。此外，他們通過計算界面張力和橫向旋轉(zhuǎn)擴散系數(shù)來測量Surfactin的表面活性。他們的研究證明了在相同的親水/疏水界面處Surfactin分子根據(jù)其界面濃度采取不同的構(gòu)象：在高濃度的環(huán)境中，分子相互聚集使得疏水殘基和親水介質(zhì)之間的相互作用最小化，分子間的聚集主要由范德華力和羧酸側(cè)鏈的氫鍵維持穩(wěn)定。此外，當親水殘留被環(huán)境屏蔽時，肽部分可以發(fā)生一個完整的翻轉(zhuǎn)，這可能與Surfactin分子穿過疏水介質(zhì)脂質(zhì)膜的能力有關(guān)。他們的研究是首次在原子水平上進行的Surfactin在液體親水/疏水環(huán)境的動力學研究，為Surfactin分子的結(jié)構(gòu)變化性與界面濃度和分子環(huán)境的關(guān)系研究帶來了有趣的見解。

2.3 固-液界面處分子的行為

Sagheer A. Onaizi等人[29]使用表面等離子體共振技術(shù)（SPR）研究了親水性固-液界面以及疏水性固-液界面處Surfactin分子的吸附性質(zhì)。親水性固-液界面的固相采用十八烷硫醇官能化的SPR傳感器芯片（BME-液），疏水性固-液界面的固相采用b-巰基乙醇功能化的SPR傳感器芯片（ODT-液）。在親水性固-液界面（BME-液體界面），Surfactin平均表面覆蓋面積隨其體積濃度變化的實驗數(shù)據(jù)使用Langmuir吸附等溫線擬合，得出最大值吸附量（Γmax）和親和常數(shù)（Ka）分別為（0.44±0.03）mg/m2和（1.6±0.3）×105M-1，單分子占據(jù)面積為（401±27）?2；在疏水性固-液界面（ODT-液體界面），Surfactin平均表面覆蓋面積隨其體積濃度變化的實驗數(shù)據(jù)使用Langmuir吸附等溫線擬合，得出最大吸附量（Γmax）和親和常數(shù)（Ka）分別為（0.12±0.01）mg/m2和（1.1±0.1）×106M-1，單分子占據(jù)面積為（157±2）?2?？梢钥闯觯琒urfactin在親水性固-液界面的吸附量比它在疏水性固-液界面的吸附量低三倍左右。從而證明了疏水相互作用在Surfactin分子吸附過程中特別重要，且Surfactin分子在疏水性固-液界面的堆積比在親水性固-液界面的堆積更緊湊。

Hsin-Hui Shen等人[24]使用中子衍射技術(shù)研究了固-液界面（固相為具有六方晶格的氧化鋁Al2O3的結(jié)晶形式）處Surfactin在不同pH下的界面行為。發(fā)現(xiàn)Surfactin在親水性固-液界面的界面行為對pH有很強的依賴性，當pH值從7.5到6.5再到5.5，中子反射率增強，當pH值從5.5到6.5再到7.5，中子反射率減弱到起始值，如圖6。圖6表明，不同pH值條件下，Surfactin分子吸附到固體表面的過程是可逆的。研究結(jié)果表明：pH值為7.5時，Surfactin分子呈現(xiàn)疏水球狀結(jié)構(gòu)，不容易吸附到固體表面；pH值為6.5時，Surfactin分子在固體表面的吸附膜是不完整的；pH值為5.5或低于5.5時，Surfactin分子在固體表面會形成多層吸附結(jié)構(gòu)。

圖5 己烷-水界面處Surfactin濃度對其分子形狀和取向的影響

圖6 Surfactin在固-液界面處中子反射率隨pH的變化[24]

3 總結(jié)與展望

生物活性分子的界面行為對于促進其分子表面活性和生物活性的應(yīng)用具有特殊的意義。研究生物表面活性劑Surfactin在界面上的分子行為對了解Surfactin的表面活性以及生物活性的作用機理具有重要意義。

生物表面活性劑Surfactin在不同界面處的分子形態(tài)與其結(jié)構(gòu)有緊密的聯(lián)系。即對于Surfactin系列物，分子中親水或疏水基團的差異可導(dǎo)致其分子形態(tài)明顯不同。因而有必要對Surfactin的結(jié)構(gòu)進行修飾，研究其結(jié)構(gòu)與界面活性的關(guān)系，這將有助于了解其活性作用基團并設(shè)計合成新型的具有特殊活性的化合物。Surfactin在單分子膜內(nèi)自組裝形成具有二維和三維尺度的表面聚集體結(jié)構(gòu)，但是目前對于其表面聚集機制以及聚集體內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的了解還比較有限。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多可用于界面原位在線檢測和結(jié)構(gòu)分析的技術(shù)和方法，如X射線反射、X射線衍射和中子反射等。相信這些界面原位在線檢測及結(jié)構(gòu)分析技術(shù)和方法的發(fā)展和應(yīng)用，將為Surfactin在界面上微觀結(jié)構(gòu)的研究提供更多信息[16]。

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