基于蛋白組學方法研究黃芩對正常大鼠能量代謝的影響

陳平平，張亞男，高鑫，王洪玉，劉樹民*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥藥性理論研究是傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論體系中的主要組成部分，反映了藥物影響人體陰陽盛衰、寒熱變化方面的作用趨勢[1]。臨床上運用藥物四氣治療疾病主要是根據(jù)藥物的寒、熱、溫、涼之偏性，調(diào)節(jié)疾病的寒和熱，從而使人體達到相對平衡狀態(tài)[2-3]。但到目前為止，由于中藥成分的復雜性，一般在機體中發(fā)揮多途徑、多靶點的協(xié)同調(diào)節(jié)作用，很難通過常規(guī)研究來詮釋中藥整體寒、熱藥性的科學內(nèi)涵，這也成為了中藥藥性理論研究工作中的難點。

匡海學教授提出中藥性(氣)味科學內(nèi)涵的新假說，即“……藥性(氣)是藥物通過不同途徑以主要影響機體的能量代謝、物質(zhì)代謝為特征的……促進機體能量代謝、物質(zhì)代謝的中藥具有熱(或溫)性，抑制機體能量代謝、物質(zhì)代謝的中藥具有寒(或涼)性。藥性(氣)可以通過動物實驗以及系統(tǒng)生物學等方法予以評價歸屬”。課題前期研究結(jié)果明確了黃芩水煎液能夠抑制大鼠的物質(zhì)代謝、能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)及植物神經(jīng)系統(tǒng)等相關的20種酶的表達[4-5]。因此,本文采用蛋白質(zhì)組學的研究方法，進一步在蛋白質(zhì)層面上開展黃芩對能量代謝的研究。為完善中藥寒、熱藥性的評價方法奠定基礎，并進一步豐富和詮釋中藥性味理論的科學內(nèi)涵。

1 實驗材料

1.1 儀器與試劑

EASY-nLC 1000納升級液相色譜儀(Thermo Finnigan)；Q-Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan公司)；電泳儀(GE Healthcare EPS601)；低溫高速離心機 (Eppendorf5430R)；iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit (AB SCIEX)；溴酚藍、甘油(生工生物工程有限公司)；Urea、SDS、Trisbase、IAA、DTT(美國伯樂公司)；KH2PO4、KCl、HCl(國藥集團化學試劑有限公司)；ACN(Merck)、30 kd超濾離心管(Sartorius)；NH4HCO3(Sigma，A6141)。

1.2 藥材

黃芩飲片(河北承德藥材有限公司，批號20140623)經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院王連芝副研究員鑒定為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，經(jīng)鑒定符合2015版《中國藥典》規(guī)定。

1.3 動物

SD大鼠，雄性，20只，體質(zhì)量(200～240)g，許可證號：[SCXK(黑)2015-004]，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。實驗室環(huán)境：室溫(22±1)℃，相對濕度(65±5)%，實驗動物在代謝籠中適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

2 實驗方法

2.1 黃芩水煎液的制備

黃芩飲片加6倍石油醚超聲50 min，2次，抽濾。合并濾液減壓濃縮，將揮發(fā)油組分揮去，藥渣干燥后，用水煎煮，第一煎加入10倍量水、第二煎加入8倍量水提取(兩煎均冷凝回流2 h), 合并2次煎液，減壓回收提取液至適當濃度，得到黃芩水煎液。

2.2 動物分組及給藥

將20只大鼠隨機分成空白組及給藥組，每組10只，其中給藥組每天上午灌胃給予黃芩水煎液(3 g生藥/kg)，空白組給予等劑量生理鹽水，連續(xù)造模及灌胃給藥15天。末次給藥24 h后取肝臟并迅速凍存于液氮中，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存待測。

2.3 樣品制備

2.3.1 制備方法

將各組內(nèi)每3只大鼠肝臟的等量蛋白混合為1個pool，作為一個生物學重復。加入SDT裂解液，勻漿后進行超聲，沸水浴5 min裂解后14 000 g，45 min離心，取上清部分，BCA方法蛋白質(zhì)定量后，低溫保存。

2.3.2 電泳、酶解和肽段定量

取20 μg蛋白質(zhì)樣品按5∶1加入緩沖液，沸水浴5 min，14 000 g離心10 min取上清液，進行12.5% SDS-PAGE電泳。電泳條件：恒流：14 mA，90 min?？捡R斯亮藍染色。將300 μg樣品加入200 μL緩沖液(UA buffer)混勻，轉(zhuǎn)入超濾管中，14 000 g離心2次，每次15 min,棄濾液,加入100 μL封閉試劑，振蕩、離后加入100 μL緩沖液 (UA buffer)，離心，重復2次。加入100 μL裂解液(Dissolution buffer)，14 000 g 10 min離心，重復2次。加入40 μL胰蛋白酶(Trypsin buffer)，600 r/min振蕩1 min，37℃ 反應。次日，換新收集管，14 000 g離心10 min，取濾液，OD280肽段定量[6]。

2.4 SCX分級

采用儀器：AKTA Purifier 100，緩沖液： A(0.01 mol/L磷酸二氫鉀,25%乙酸，pH值3)， B(0.01 mol/L磷酸二氫鉀，0.5 mol/L氯化鉀,25% 乙酸，pH值3)。進行SCX分級，梯度:0～25 min，100% A，25.01～32 min，100%～90% A，32.01～42 min，90%～80% A，42.01～47 min，80%～55% A，47.01～52 min，55%～0% A，52～60 min，0% A，60.01～75 min，100% A。

2.5 質(zhì)譜分析與鑒定

采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)EASY-nLC 1000進行分離。緩沖液：A(0.1%甲酸水溶液)，B(0.1%甲酸乙腈水溶液，乙腈為84%)，流速為300 nL/min。梯度如下：0～55 min，100%～60% A，55.01～58 min，60%～0% A，58.01～60 min，0% A。分離后用質(zhì)譜儀進行分析。分析時長：60 min，檢測方式：正離子，掃描范圍：300～1 800 m/z。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Mascot2.2 和Proteome Discoverer1.4(thermo)對差異蛋白及代謝通路進行分析。相關參數(shù)如表1～2。

表1 蛋白樣本定性檢索參數(shù)

表2 Proteome Discoverer1.4定量分析參數(shù)

3 結(jié)果

3.1 SDS-PAGE電泳結(jié)果

經(jīng)電泳分離后如圖1所見,樣品蛋白質(zhì)條帶清新，條帶之間平行度較好，亞基分離量范圍為10.5～175 kd之間，樣品符合標準。

3.2 差異蛋白結(jié)果統(tǒng)計

進行(T-Test)顯著性分析，顯著性差異表見表3。

表3 黃芩水煎液組與空白組差異蛋白對比結(jié)果

注：P<0.05，ratio>1.2or<0.833

3.3 黃芩全成分對正常大鼠差異蛋白的影響

采用相同標準(Fold change>1.2or<0.833,P<0.05)進行篩選，同時找尋與物質(zhì)能量代謝相關的差異蛋白。其中黃芩全成分組與空白組比較，篩選出差異蛋白有22個，蛋白信息見表5，上調(diào)蛋白5個，下調(diào)蛋白17個，其中上調(diào)蛋白有肌醇多磷酸-1-磷酸酶、鳥苷酸環(huán)化酶亞基β-1、Sn-1-甘油-3-磷酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶、鈣依賴性磷脂酶A2、COX15細胞色素C氧化酶;下調(diào)蛋白有3-磷酸甘油醛脫氫酶、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(Ugt2b15、Ugt2a1、Ugt2b)、β-氨基己糖苷酶、酰基輔酶A合成酶acsm、3NADH脫氫酶、細胞色素C氧化酶亞基2、細胞色素C氧化酶亞基t 7A2、肌醇-3-磷酸合成酶、NADP依賴性蘋果酸脫氫酶、細胞色素C氧化酶亞基t 7A2、萜烯環(huán)化酶、單甘酯脂肪酶、哌啶酸氧化酶、醛氧化酶4。分別對戊糖和葡萄糖相互轉(zhuǎn)化、抗壞血栓和維生素C代謝、類固醇激素的生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、丁酸甲酯代謝、肌醇磷酸代謝、甘油酯代謝、甘油磷脂代謝、鞘脂代謝、嘌呤代謝、賴氨酸降解糖酵解/糖異生、氧化磷酸化、丙酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸的延伸、類固醇的生物合成、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、色氨酸代謝、賴氨酸代謝、酪氨酸代謝等多條與物質(zhì)能量代謝有關的通路有顯著的調(diào)控作用。

圖1 樣品SDS-PAGE 電泳圖注：上樣量為20 μg，SGK為空白組，SGQ為給藥組

序號蛋白號蛋白名稱中文名基因名覆蓋率等電點差異倍數(shù)P值1E9PTV9Glyceraldehyde-3-phosphate de-hydrogenase3-磷酸甘油醛脫氫酶RGD156275835.147.720.607↓0.000 1952D3ZLR6UDP-glucuronosyltransferase葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶Ugt2b1538.688.401.271↑0.003 9553A0A0G2JW02UDP-glucuronosyltransferase葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶Ugt2a116.456.711.429↑0.001 4704F1LM22UDP-glucuronosyltransferase葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶Ugt2b33.778.502.447↑0.000 4195Q6AXR4Beta-hexosaminidase subunit betaβ-氨基己糖苷酶Hexb3.727.940.732↓0.019 6656Q6SKG1Acyl-coenzyme A synthetase AC-SM3酰基輔酶A合成酶acsm3Acsm39.487.990.693↓0.000 3417Q6AYK3Inositol-3-phosphate synthase 1肌醇-3-磷酸合成酶Isyna12.336.040.739↓0.026 6018P13697NADP-dependent malic enzymeNADP依賴性蘋果酸脫氫酶Me130.596.930.733↓0.035 6709Q5RJK6Inositol polyphosphate-1-phos-phatase肌醇多磷酸-1-磷酸酶Inpp13.035.051.211↑0.000 02510B2RYS8NADH dehydrogenaseNADH脫氫酶Ndufb814.526.050.829↓0.019 66511Q5UAJ6Cytochrome c oxidase subunit 2細胞色素C氧化酶亞基2COX226.434.730.342↓0.002 68212P35171Cytochrome c oxidase subunit 7A2細胞色素C氧化酶亞基t 7A2Cox7a227.7110.270.828↓0.008 09613D4A414COX15 homolog, cytochrome c oxidase assemCOX15細胞色素C氧化酶Cox151.939.831.221↑0.009 15914D3ZHG0Protein Hacd2蛋白Hacd2Hacd23.949.550.782↓0.000 13815A0A0G2JVC8Terpene cyclase萜烯環(huán)化酶Lss12.146.670.824↓0.391 00016Q924S11-acyl-sn-glycerol-3-phos-phate acyltransferase deltaSn-1-甘油-3-磷酸酯?；D(zhuǎn)酶Agpat41.858.411.573↑0.011 84517Q8R431Monoglyceride lipase單甘酯脂肪酶Mgll11.227.370.770↓0.013 02118P97570calcium-independentolipasephos-phA2鈣依賴性磷脂酶A2Pla2g60.747.121.205↑0.024 92719P20595Guanylate cyclase soluble subunit beta-1鳥苷酸環(huán)化酶亞基β-1Gucy1b34.205.401.250↑0.006 84320Q64565Alanine--glyoxylate amin-otransferase 2丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶2Agxt245.128.070.825↓0.000 42721Q5I0K1Pipecolic acid oxidase哌啶酸氧化酶Pipox14.108.250.719↓0.000 61322A0A0G2K1Z5Aldehyde oxidase 4醛氧化酶4Aox412.456.710.827↓0.000 626

注：SGK為空白組，RGQ為給藥組，P<0.05，ratio>1.2or<0.833

圖2 黃芩水煎液對大鼠差異蛋白的KEGG富集分析圖

3.4 KEGG通路富集分析

本文采用KEGG(京都基因與基因組百科全書，http://www.kegg.jp/)對鑒定的蛋白所在通路層面信息進行富集分析，在KEGG富集分析中,P<0.05表示該通路被顯著性富集。

由圖2可見，黃芩水煎液在新陳代謝途徑中富集最顯著，并且在細胞色素P450及其外源性物質(zhì)的代謝、藥物代謝、抗壞血酸維生素C代謝、葡萄糖與戊糖相互轉(zhuǎn)化、視黃醇代謝、淀粉和蔗糖代謝、類固醇生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、葡聚糖及多糖的降解、脂類代謝等途徑有較高的差異蛋白分布，這些信息指示了差異蛋白可能參與的主要生命活動。

4 討論

蛋白質(zhì)組學指的是高通量研究蛋白質(zhì)的特征，主要包括蛋白質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白互作等，最后明確各種蛋白質(zhì)的主要功能。中藥相關藥物代謝酶的研究是中醫(yī)藥研究的重點及難點，研究人員一直在探索和開拓適合研究中藥藥物代謝的方法和技術(shù)[7]。蛋白質(zhì)組學的研究與中醫(yī)整體觀和辨證論治的認識方法具有相似性，也是從整體水平上反映疾病過程中蛋白質(zhì)表達的動態(tài)演變過程。本實驗采用 iTRAQ技術(shù)，可以避免實驗人員的操作和儀器等造成的誤差，iTRAQ技術(shù)的優(yōu)勢在蛋白質(zhì)組學中得到證明。

肝臟作為最大的腺體，承擔著機體許多生理功能及生物轉(zhuǎn)化，肝臟中蛋白含量豐富，種類多，蛋白質(zhì)組學檢測的是藥物對蛋白表達的影響，而肝臟是合成白蛋白、總蛋白的場所，許多物質(zhì)、能量轉(zhuǎn)換等過程都是在肝臟中完成。因此本文對于蛋白組學研究選用的肝臟作為檢測組織。

采用uniprot_rat_35830_20160326.fasta數(shù)據(jù)庫對給藥組與空白組差異蛋白進行Pathway注釋，黃芩全成分與空白組比較最后篩選出與能量代謝相關的差異顯著的代謝途徑，如糖代謝、脂肪酸代謝，三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化等，對蛋白及通路進行分析如下。

糖酵解：糖酵解途徑是在供氧不足的情況下，葡萄糖在細胞液中分解成丙酮酸，丙酮酸進一步還原成乳酸，并且產(chǎn)生少量ATP的過程。3-磷酸甘油醛脫氫酶參與糖酵解途徑中的3-磷酸甘油醛氧化為1,3-二磷酸甘油酸過程，反應中該酶起到關鍵的催化作用，該反應過程生成ATP，并且促進糖酵解反應。3-磷酸甘油醛脫氫酶蛋白表達下調(diào)抑制糖酵解途徑。

磷酸戊糖途徑：此途徑為葡萄糖分解代謝的另一條重要途徑，其過程可分為兩個階段，第一階段是磷酸戊糖的形成階段，第二階段則是基團轉(zhuǎn)移反應。磷酸戊糖途徑為核酸的生物合成提供核糖，提供NADPH作為供氫體參與多種代謝反應。

磷酸戊糖途徑生成的NADPH可為乙酰輔酶合成脂酸或膽固醇，NADPH還參與羥化反應從膽固醇合成膽汁酸、類固醇激素等。葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶是化學物質(zhì)體內(nèi)生物轉(zhuǎn)移化第二時相中最重要的代謝酶，是一個超基因家族。該酶能催化葡萄糖醛酸與大量的外源性和內(nèi)源性化學物質(zhì)進行葡萄糖醛酸結(jié)合反應[8]，亦促進藥物代謝。Ugt2b15、Ugt2b、Ugt2a1表達上調(diào)，促進磷酸戊糖途徑及藥物代謝，促進機體的能量代謝。

脂肪酸的分解：需經(jīng)活化、轉(zhuǎn)移、β-氧化的過程，脂酸活化生成酯酰CoA的過程，是消耗少量能量的過程，酯酰CoA進入線粒體后生成多個乙酰CoA然后再經(jīng)過三羧酸循環(huán)被徹底氧化釋放出大量能量。?；o酶A合成酶acsm3在脂肪酸代謝過程中活化脂肪酸參與脂肪酸的合成和β-氧化過程中起到重要作用[9]?？梢岳瞄L鏈脂肪酸、ATP 和輔酶 A 作為底物，合成具有生物活性的酰基輔酶 A 酯，從而催化脂肪酸代謝的從頭合成[10]。生成?；o酶 A 酯的脂肪酸才能參加脂肪酸的β-氧化、去飽合、碳鏈延伸等反應，也參與合成膽固醇酯、甘油三酯和磷酯等多種脂類。 Acsm3表達下調(diào)，抑制脂肪酸的分解從而抑制機體的能量代謝。

磷酸肌醇代謝：磷酸肌醇為磷脂酰肌醇水解的產(chǎn)物，在催化酶作用下，其水解產(chǎn)生磷酸肌醇或多磷酸肌醇在細胞活化中起著第二信使的作用，磷酸肌醇代謝產(chǎn)生肌醇三磷酸和二?；视蚚11-12]。肌醇-3-磷酸合成酶于生物體中是催化從葡糖糖轉(zhuǎn)化為肌醇-3-磷酸的功能基因。肌醇-3-磷酸酯的代謝也有兩條途徑，途徑中最后由肌醇-1-磷酸酯酶將肌醇-4-磷酸酯和肌醇-1 -磷酸酯降解為游離的肌醇。當細胞處于靜止狀態(tài)時，在激酶和磷酸酯酶的作用下互相轉(zhuǎn)換。Isyna1表達下調(diào)，Inpp1表達上調(diào)影響磷酸肌醇代謝,但不確定是否抑制該代謝途徑。

三羧酸循環(huán)：三羧酸循環(huán)為脂肪酸及糖類有氧氧化的最后步驟，是釋放出大量能量的過程。在8種酶的催化下，從草酰乙酸開始，三羧酸循環(huán)每循環(huán)一次氧化1個乙?；?，產(chǎn)生2個二氧化碳，給出四對氫，還直接合成一個GTP。NADP依賴性蘋果酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)最后反應——蘋果酸脫氫生成草酸乙酸的催化酶。Me1表達下調(diào)，抑制了機體的能量代謝。

氧化磷酸化：在生物氧化過程中，細胞內(nèi)ATP形成的主要方式是氧化磷酸化，即在呼吸鏈電子傳遞的過程中偶聯(lián)ADP磷酸化，生成ATP。線粒體作為細胞最重要的細胞器，為生命活動提供基本能量。主要由位于線粒體內(nèi)膜上的5個復合體組成的線粒體呼吸鏈酶完成。NADH脫氫酶即線粒體復合體Ⅰ，是線粒體呼吸鏈中首個也是最大的膜蛋白復合體[13]。細胞色素C氧化酶(由13個亞基組成) 是線粒體電子傳遞鏈的線粒體復合體IV，在氧化磷酸化過程中發(fā)揮極為重要的調(diào)節(jié)作用[14]。NADH脫氫酶，細胞色素C氧化酶亞基2，細胞色素C氧化酶亞基t7A表達下調(diào)，COX15細胞色素C氧化酶表達上調(diào)，整體能夠抑制氧化磷酸化的過程，抑制能量的生成。

類固醇激素生物合成：類固醇激素又叫甾體激素，許多類固醇激素在糖代謝和水鹽代謝過程中發(fā)揮重要的作用，而且類固醇激素合成是耗能過程。萜烯環(huán)化酶(Lss)參與甾體激素的合成，法尼基焦磷酸在萜烯合酶的催化作用下合成甾醇類[15]。Lss表達下調(diào)抑制類固醇激素的生物合成，抑制機體能量的消耗。

甘油磷脂的合成/降解：合成是以磷脂酸為前體，需CTP參與，過程包括甘油二酯的合成途徑和CDP-甘油二酯合成途徑。降解是磷脂酶A、B、C、D催化下的水解反應。Sn-1-甘油-3-磷酸酯?；D(zhuǎn)移酶參與的是甘油磷脂合成中的甘油二酯的合成途徑，甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶催化甘油-3-磷酸酯與脂肪酸發(fā)生?；磻a(chǎn)甘油酯。鈣依賴性磷脂酶A2存在于細胞膜及線粒體膜上，參與的是甘油磷脂的降解，Ca2+為其激活劑，使甘油磷脂分解產(chǎn)生脂肪酸及溶血磷脂2。脂肪酶又稱甘油酯水解酶，單甘酯脂肪酶催化合成單甘酯具有高立體選擇性和區(qū)域?qū)Ｒ恍?，其基本功能是催化甘油三酰酯水解為甘油和脂肪酸，為一種高效的生物催化劑[16]。Agpat4、Pla2g6表達上調(diào)，Mgll表達下調(diào)，影響甘油磷脂的合成與降解,但不確定對能量代謝是否有抑制作用。

氨基酸代謝：鳥苷酸環(huán)化酶亞基β-1是催化鳥苷三磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)鳥苷酸的酶；丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶2催化乙醛酸轉(zhuǎn)氨基生成甘氨酸；醛氧化酶4是參與嘌呤類分解代謝的重要酶系[17]；賴氨酸是生物體內(nèi)重要的代謝產(chǎn)物，更是化學合成中重要的手性構(gòu)建模塊和多種生物活性分子的關鍵組成片段，哌啶酸氧化酶影響賴氨酸的代謝過程。Gucy1b3表達上調(diào),Agxt2、Pipox、Aox4表達下調(diào),整體抑制氨基酸代謝。

本文利用蛋白組學方法共鑒定了黃芩水煎液和空白組比較與物質(zhì)能量代謝相關的差異蛋白，結(jié)果黃芩水煎液能夠抑制機體的能量代謝，黃芩本為“寒性”，證實了假說中寒性藥物能夠抑制能量代謝的作用。并且對蛋白所在通路——黃芩抑制能量代謝具體通路進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩通過抑制糖酵解、脂肪酸的分解、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、類固醇激素生物合成、氨基酸代謝,抑制能量的生成或降低能量的消耗，從而抑制機體的物質(zhì)及能量代謝，在蛋白組學層面和能量代謝角度初步揭示了寒性中藥——黃芩對機體能量代謝影響的的內(nèi)在機制。

[1] 侯家玉.中藥藥理學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社,2002:4.

[2] ANDERSON N L,MATHESON A D,STEINER S.Proteomics: applications in basic and applied biology[J].Curr Opin Biotechnol,2000,11(4):408-412．

[3] WASINGER V C,CORDWELL S J,CERPA-POLJAK A,et al.Progress with geneproduct mapping of the Mollicutes;Mycoplasma genitalium[J].Electrophoresis,1995,16(7):1090-1093.

[4] 張亞男,陳平平,王洪玉,等.黃芩拆分組分寒熱藥性歸屬[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2017,19(12):32-36.

[5] 陳平平,張亞男,高鑫,等.基于水通道蛋白的黃芩利水作用研究[J].中醫(yī)藥信息,2018,35(1):1-5.

[6] WISNIEWSKI J R,ZOUGMAN A,NAGARAJ N,et al.Universal sample preparation method for proteome analysis[J].Naturemethods,2009,6(5):359-362.

[7] 蔣希成,張婷婷.缺血性中風的蛋白質(zhì)組學研究進展[J].中醫(yī)藥信息,2013,30(5):125-126.

[8] 彭金詠,欒連軍.尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的研究進展[J].中國現(xiàn)代應用藥學雜志,2002,19(5):373-376.

[9] 李慶崗,陶著,楊玉增.等.長鏈脂酰CoA合成酶(ACSL)的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2012,39(6):137-140.

[10] LI L O,KLETT L,COLEMAN R A.Acyl-CoA synthesis,lipid metabolism and lipotoxicity[J].Biochim Biophys Acta,2010,1801(3): 246-251．

[11] 程錦軒,肖嚴.磷酸肌醇代謝與新的第二信使[J].中國藥理學通報,1988,4(4):10-14.

[12] 唐蕾,李維業(yè).以肌醇磷脂代謝為基礎的第二信使與細胞調(diào)控[J].國外醫(yī)學:眼科學分冊,1988,12(6):324-330.

[13] 徐婷,李華,魯珊珊,等.線粒體電子傳遞呼吸鏈及其生物學意義的研究進展[J].復旦學報·醫(yī)學版,2015,42(2):250-255+261.

[14] BELEVICH I,VERKHOVSKY M I.Molecular mechanism of proton translocation bycytochrome coxidase[J].Antioxid Redox Signal,2008,10(1):1-29.

[15] 張艷,盧文玉.釀酒酵母細胞表達異源萜類化合物的研究進展[J].化工進展，2015,35(5):1265-1270.

[16] 孔明,楊博,姚汝華.脂肪酶催化合成單甘酯的研究進展[J].中國油脂,2003，28(7):11-14.

[17] GARATTINI E,MENDEL R,ROMAO M J,et al.Mammalian molybdo-flavoenzymes, an expanding family of proteins:structure,genetics,regulation,function and pathophysiology[J].Biochem J,2003,372:15-32.