冬凌草甲素生物合成途徑及關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展

徐會(huì)敏, 高登風(fēng), 魏閃閃, 史勝利, 蘇成福

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450008； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，鄭州 450008)

冬凌草是唇形科香茶菜屬植物碎米椏[Isodonrubescens(Hemsl.) Hara]，為多年生草本或亞灌木植物，也是一種重要的藥用植物，主產(chǎn)于河南省，國(guó)內(nèi)其他省份也均有分布[1-2]。

冬凌草全株入藥，具有抗癌、抗菌消炎[3-4]、清熱解毒、活血止痛等功效。冬凌草含有萜類、黃酮類、生物堿等多種活性成分[5]。其中，甲素是冬凌草的主要藥用成分，屬于對(duì)映-貝殼杉烷類二萜化合物[6-8]，具有重要的醫(yī)藥價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

二萜類化合物是植物體內(nèi)重要的次生代謝物，由4個(gè)異戊二烯基單元組成，含有20 個(gè)碳原子的一類天然化合物，廣泛存在于植物、微生物等生物體內(nèi)[9-10]。二萜類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)多變、來源豐富決定了其生物活性的多樣，也使得其成為藥學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[11]。

1 二萜類化合物生物合成途徑

目前，已知二萜類化合物的生物體合成途徑有兩條：甲羥戊酸途徑(Mevalonic acid，MVA)和5-磷酸脫氧木酮糖途徑(Methyl-D-erythritol phosphate，MEP)[12]，如圖1所示。在甲羥戊酸途徑中，以乙酰CoA為原料合成甲羥戊酸(MVA)，再經(jīng)多步酶促反應(yīng)合成異戊烯基焦磷酸(IPP)。參與此過程的酶有乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶(AACT)、羥甲基戊二酰CoA合酶(HMGS)、羥甲基戊二酰CoA還原酶(HMGR)、甲羥戊酸激酶(MK)、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MDD)等[13]。在MEP途徑中，丙酮酸與甘油醛-3-磷酸結(jié)合形成1-脫氧木酮糖-5-磷酸，再經(jīng)多步酶促反應(yīng)合成異戊烯焦磷酸(IPP)及其異構(gòu)物二甲基丙烯焦磷酸 (DMAPP)。參與此過程的酶有：1-脫氧-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、1-脫氧-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)、4-二磷酸胞苷-2-甲基-赤蘚醇合酶(CMS)、4-二磷酸胞苷-2-甲基-赤蘚糖激酶(CMK)、2-甲基-赤蘚糖醇-2,4-環(huán)焦磷酸合成酶(MCS)、1-羥基-2-甲基-2-丁烯基-4-焦磷酸合酶(HDS)、IPP/DMAPP 合酶(IDS)及異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IPI)等[14]。

MVA途徑和MEP途徑形成的IPP與DMAPP可轉(zhuǎn)化為牻牛兒基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate，GPP)，進(jìn)一步形成二萜骨架或貝殼杉烯化合物[15]，隨后細(xì)胞色素 P450等多種修飾酶對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，最終合成冬凌草甲素等二萜類化合物[16]。此過程需要下列酶的參與：牻牛兒基焦磷酸合酶(GPPS)、法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)、牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPPS)、柯巴基焦磷酸合酶(CPS)、 貝殼杉烯合酶(KS)，以及細(xì)胞色素 P450等多種修飾酶[17]。

植物萜類生物合成分為中間體生成、萜類生成和化學(xué)修飾等3個(gè)階段[18]。與之相應(yīng)，代謝途徑中的酶也分為3類。IPP與DMAPP生成前的酶屬于I類酶，其中DXS、DXR和 HMGR分別為MEP和MVA途徑的關(guān)鍵酶[19](圖1)。II類酶主要是各種環(huán)化酶，催化IIP和DMAPP生成各種不同分子量大小的形式各異的萜類化合物或中間體，是萜類生物合成的關(guān)鍵酶。III類酶的種類較多，其作用是對(duì)環(huán)化酶的作用產(chǎn)物進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)修飾，包括異構(gòu)化、甲基化、脫甲基化、羥基化及加成等過程。目前，萜類合成研究成果主要來自對(duì)I類和II類關(guān)鍵酶的研究，對(duì)III類酶研究較淺，了解的內(nèi)容也較少[20]。

2 冬凌草生物合成的關(guān)鍵酶及其編碼基因

冬凌草細(xì)胞內(nèi)甲素合成相關(guān)酶的表達(dá)量低，且有時(shí)空差異性，因而其分離純化較為困難。因此，研究冬凌草二萜類化合物生物合成途徑關(guān)鍵酶的編碼基因，是揭示甲素生物合成途徑的重要方法[21-22]。目前，冬凌草甲素生物合成途徑中僅有少數(shù)幾個(gè)I、II類酶的編碼基因完成測(cè)序及克隆，包括乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶(acetyl-CoA acetyltransferase，AACT)、羥甲基戊二酰CoA合酶(HMGS)、1-脫氧-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)和異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IPI)基因等。

2.1 乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶(acetyl-CoA acetyltransferase，AACT)

乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶屬于Ⅱ型硫解酶家族，是植物萜類生物合成 MVA 途徑中的首個(gè)關(guān)鍵酶，參與細(xì)胞中萜類、固醇類等重要代謝過程，不僅參與調(diào)節(jié)萜類合成代謝，還參與植物逆境脅迫的響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草AACT基因全長(zhǎng)1254 bp，可編碼由417 個(gè)氨基酸組成的、分子質(zhì)量約為42 949.6 u的親水性蛋白質(zhì)。冬凌草AACT基因片段與丹參AACT的同源性最高，為93%，與番茄、蓮、芝麻等雙子葉植物AACT的同源性為80%以上，編碼硫解酶的4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域及2個(gè)保守位點(diǎn)。該酶蛋白可能主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，也可能分布于過氧化物酶體或微體。冬凌草AACT表達(dá)具有組織器官特異性，其轉(zhuǎn)錄水平由高到低依次是花、葉片、根、莖、愈傷組織[23]。

圖 1 冬凌草甲素的生物合成路徑Fig 1 Biosynthesis pathway of oridonin

AACT: Acetyl-CoA acyltransferase; HMGS: Hydroxy methylglutaryl-CoA synthase; HMGR: Hydroxy methylglutaryl-CoA reductase; MK: Mevalonate kinase; PMK: Phosphomevalonate kinase; MDD: Mevalonate disphosphate decarboxylase; DXS: 1-Deoxy-xylulose-5-phosphate synthase; DXR: 1-deoxy-xylulose-5-phosphate reductoisomerase; CMS: 4-Diphosphocytidyl-2-methyl-erythritol synthase; CMK: 4-diphosphocytidyl-2-methyl-erythritol kinase; MCS: 2-methyl-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase; HDS: 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-pyrophosphate synthase; IDS: IPP/DMAPP synthase; IPI: Isopentenyl pyrophosphate isomerase; GPPS: Geranyl pyrophosphate synthase; FPPS: Farnesyl pyrophosphate synthase; GGPPS: Geranylgeranyl pyrophosphate synthase; CPS: Copalyl pyrophosphate synthase; KS: Kaurene synthase

2.2 羥甲基戊二酰CoA合酶(Hydroxy methylglutaryl-CoA synthase，HMGS)

羥甲基戊二酰CoA合酶催化乙酰乙酰CoA與乙酰CoA 縮合生成羥甲基戊二酰CoA的作用。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草HMGS基因全長(zhǎng)為1382 bp，編碼由460個(gè)氨基組成的，分子質(zhì)量約為50 571.5 u的親水性蛋白。冬凌草HMGS基因片段與薰衣草的同源性最高,為96%，與蓖麻、芝麻等雙子葉植物同源性為80%以上。HMGS蛋白結(jié)構(gòu)域高度保守，具有一個(gè)羥甲基戊二酰CoA 合成酶結(jié)構(gòu)域，以及半胱氨酸活性位點(diǎn)。該蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能分布于液泡、線粒體中。冬凌草HMGS蛋白表達(dá)量相對(duì)較高，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其在組培苗葉中表達(dá)量最高，其次是根，花中最低，可能在冬凌草植株合成累積冬凌草甲素中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[24]。

2.3 1-脫氧-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)

1-脫氧-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)是5-磷酸脫氧木酮糖(MEP)途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，催化丙酮酸與3-磷酸-甘油醛縮合生成1-脫氧-木酮糖-5-磷酸，在植物萜類物質(zhì)的生物合成中發(fā)揮重要的作用。冬凌草DXS基因，屬于植物DXS II家族，全長(zhǎng)2169 bp，編碼722個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為77.7 ku。冬凌草DXS蛋白與同科的丹參、薄荷等DXS蛋白序列具有較高的同源性，N端均含一段質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，且均具有一保守焦磷酸硫胺素結(jié)構(gòu)域，以及與吡啶結(jié)合相關(guān)的DRAG結(jié)構(gòu)域。DXS基因在冬凌草根、葉中表達(dá)量較高，而莖、花和愈傷組織中較低[25]。

2.4 1-脫氧-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(1-deoxy-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR)

1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)催化1-脫氧-木酮糖-5-磷酸生成5-磷酸脫氧木酮糖途徑(MEP)，參與類異戊二烯的合成和積累，是MEP途徑中最重要的限速酶，也是萜類代謝工程研究的重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草DXR基因全長(zhǎng)1500 bp，編碼為親水性蛋白。DXR蛋白在游離核糖體上合成完成后，被轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中行使功能，不與膜結(jié)合。DXR在愈傷組織中的表達(dá)量最低，莖中表達(dá)量較高[26]。

2.5 異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(Isopentenyl pyrophosphate isomerase，IPI)

異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IPI)催化異戊烯焦磷酸(IPP)異構(gòu)化形成二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP是萜類化合物合成的重要前體物質(zhì)，故IPI與萜類合成密切相關(guān)。冬凌草IPI基因全長(zhǎng)1050 bp，編碼由301個(gè)氨基酸組成親水性的非膜蛋白。該酶蛋白上存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)通過磷酸化/去磷酸化以調(diào)控其活性，使其成為調(diào)控下游代謝途徑的總開關(guān)，直接影響萜類合成的五碳前體庫的代謝流向。該酶蛋白在葉中表達(dá)量相對(duì)較高，在愈傷組織中表達(dá)量最低[27]。

2.6 柯巴基焦磷酸酶(Copalyl diphosphate synthase，CPS)

柯巴基焦磷酸酶催化牻牛兒牻牛兒基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)環(huán)化生成柯巴基焦磷酸[28]。研究發(fā)現(xiàn)冬凌草有一個(gè)柯巴基焦磷酸酶(CPS)基因家族，包括IrCPS1～I(xiàn)rCPS5。IrCPS1、IrCPS2、IrCPS4和IrCPS5均含有CPS典型的(D,E)XDD基序，但I(xiàn)rCPS3中的第二個(gè)Asp被Asn替代，其基序轉(zhuǎn)變?yōu)?D,E)XND，從而失去催化活性。IrCPS1全長(zhǎng)序列與毛萼香茶菜、丹參等物種CPS基因序列的相似性在98%～99%，IrCPS3、IrCPS4和IrCPS5的相似性為99%，而IrCPS2的相似性則小于93%。這些酶催化產(chǎn)物的旋光性不同，IrCPS1、IrCPS2催化生成普通柯巴基焦磷酸，而IrCPS4和IrCPS5則催化生成對(duì)映柯巴基焦磷酸。IrCPS1在根部高表達(dá)，IrCPS2與IrCPS5在多種組織中均有表達(dá)，IrCPS3在所有組織中的表達(dá)量都相對(duì)較低，而IrCPS4在葉片中高表達(dá)，提示IrCPS4在甲素等二萜類化合物的生物合成中可能發(fā)揮著更重要的作用[29]。

2.7 類貝殼杉烯合酶(kaurene synthase-like cyclase，KSL)

類貝殼杉烯合酶(KSL)催化柯巴基焦磷酸環(huán)化生成貝殼杉烯[30]。冬凌草中發(fā)現(xiàn)類貝殼杉烯合酶(KSL)基因家族，包括IrKSL1～ IrKSL6。與毛萼香茶菜、丹參等物種的KSL基因序列比較，IrKSL1和IrKSL3全長(zhǎng)序列的相似性在98%～99%，IrKSL6的相似性為99%，而IrKSL2、IrKSL4和IrKSL5的相似性則小于93%。IrKSL1、IrKSL3和IrKSL6為單起源基因，IrKSL3和IrKSL6含γ、β、α 3個(gè)結(jié)構(gòu)域，但I(xiàn)rKSL1無N端的γ結(jié)構(gòu)域，僅有β、α結(jié)構(gòu)域。IrKSL1在根部高表達(dá)，IrKSL5和IrKSL6在多種組織均有表達(dá)，IrKSL2、IrKSL3和IrKSL4在葉片中高表達(dá)。IrKSL2、IrKSL4和IrKSL5催化對(duì)映柯巴基焦磷酸發(fā)生反應(yīng)，其中IrKSL4可能在甲素合成中起重要作用[29]。

2.8 細(xì)胞色素P450 (Cytochrome P450 enzymes，CYP)

細(xì)胞色素P450單加氧酶系在二萜類化合物的生物合成中發(fā)揮著重要的作用。冬凌草中發(fā)現(xiàn)CYP76AH30，其序列與CYP76AH1[31]有80.5%相似性，與CYP76AH22-24的相似性為76.1%～ 77.6%。通過酵母菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CYP76AH30編碼Ferruginol合成酶，催化Miltiradiene生成Ferruginol[29]。

3 總結(jié)與展望

當(dāng)前，對(duì)冬凌草甲素生物合成途徑的研究主要集中在I類酶上，對(duì)II類酶和III類酶研究很少，需要深入研究，將來應(yīng)深入挖掘與冬凌草甲素合成關(guān)鍵酶及其基因，進(jìn)一步完善其生物合成途徑[32]。通過研究MVA /MEP 途徑的相互聯(lián)系，明確兩條途徑的調(diào)控機(jī)制，以及基因時(shí)空差異表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以實(shí)現(xiàn)對(duì)合成途徑中調(diào)控因子，包括正反作用元件的分離、鑒定與合理應(yīng)用，以及基因的協(xié)同轉(zhuǎn)化，通過基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)冬凌草甲素的大規(guī)模生產(chǎn)[33]。

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