馬尾藻提取物對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制作用

李秀菊，袁 夢(mèng)，黃嘉麗，李若齊，顏亨梅，汪 波

(北京師范大學(xué)珠海分校 工程技術(shù)學(xué)院，珠海 519085)

硝酸鹽和亞硝酸鹽攝入過多會(huì)對(duì)人體造成危害[1]，具有強(qiáng)氧化性的亞硝酸鹽能使正常的亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變成高鐵血紅蛋白而失去運(yùn)氧功能[2]。當(dāng)人體血液有20%的亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白時(shí)就會(huì)造成缺氧癥狀，臨床表現(xiàn)為皮膚黏膜青紫，頭暈、嘔吐、全身無力，嚴(yán)重者會(huì)因呼吸衰竭而死[3]。亞硝酰胺中甲基以及亞硝基脲可以使大鼠、小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物子代產(chǎn)生先天畸形，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形[4]。因此，合理有效地控制體內(nèi)的亞硝酸鹽及亞硝胺具有重大意義?，F(xiàn)今藥物的研究主要以陸生植物為主，且其中大部分為名貴中藥，這并不利于藥物的開發(fā)應(yīng)用。于是，人們把目光投向有著巨大發(fā)掘和利用空間的海洋，逐漸關(guān)注到馬尾藻這種種植周期短，投入成本低的溫暖性海藻[5]。在中國大多數(shù)沿海地帶有馬尾藻生長(zhǎng)，并能夠?qū)嵭写笠?guī)模養(yǎng)殖，所以馬尾藻作為原材料來源豐富[6]。

姚勇和孟慶勇對(duì)輻射損傷型小鼠服用馬尾藻提取劑后，發(fā)現(xiàn)馬尾藻提取劑所制備的口服液具有優(yōu)良的抗輻射效果，并且作用效果與馬尾藻提取劑的用量呈正相關(guān)；由此可見，馬尾藻具有良好的抗輻射能力[7]。海藻多糖在實(shí)驗(yàn)中已驗(yàn)證能提高哺乳動(dòng)物非特異性免疫和特異性免疫,能大幅度地增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫能力及其腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力[8]。肖為等利用乙醇進(jìn)行全緣馬尾藻的粗提取，并測(cè)定了全緣馬尾藻提取物的抗氧化活性及對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制作用，其結(jié)果表明，全緣馬尾藻醇提取物具有一定的抗氧化能力，且其對(duì)清除體內(nèi)亞硝酸鹽與阻斷亞硝胺合成有一定效用[9]。

楊亞云對(duì)藻泥和藻粉的研究表明，藻泥和藻粉具有一定的保濕性，以藻多糖作為基本原料制成的護(hù)膚霜能增加皮膚的膠原蛋白含量和皮膚的彈性值[10]。這表明馬尾藻具有綜合開發(fā)利用的廣闊前景，如開拓它的美容護(hù)膚品市場(chǎng)，提高其附加經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

多數(shù)海藻的提取物質(zhì)具有抗氧化和抗腫瘤的功效，但是關(guān)于馬尾藻提取物清除亞硝酸鹽以及阻斷亞硝胺合成的報(bào)道并不多見[9]。在驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)所用的馬尾藻是一種安全無污染原材料的基礎(chǔ)上，測(cè)定了馬尾藻對(duì)亞硝胺合成的阻斷率以及對(duì)亞硝酸鹽的清除率，從而對(duì)馬尾藻粗提物抑制亞硝化作用的能力進(jìn)行研究分析，為馬尾藻的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海藻來源：中國珠海東澳島馬尾藻(Hizikiafusiformis)。

主要材料前處理：購得的新鮮馬尾藻去除雜質(zhì)洗凈，再用蒸餾水沖洗2次，放入80℃烘干機(jī)烘干至恒重后，剪碎。馬尾藻粉末過篩后儲(chǔ)存于干燥的玻璃瓶備用[11]。

采用固-液浸提法。稱取5份重量分別為10 g的干燥馬尾藻樣品，分別用140 mL不同濃度(0%、25%、50%、75%和100%)的乙醇置于4℃冰箱浸提3 d。真空抽濾得到不同濃度的醇提液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

農(nóng)藥殘留和重金屬殘留的測(cè)定：砷詳細(xì)步驟見GB/T5009.11—2003[12]；鉛詳見GB5009.12—2010[13]；有機(jī)磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥詳見GB/T20769—2008[14]。

馬尾藻提取物對(duì)亞硝胺合成阻斷率的測(cè)定采用α-萘胺法[15]；馬尾藻對(duì)亞硝酸鹽清除率采用鹽酸萘乙二胺比色法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬和農(nóng)藥殘留檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)表1可知鋁的含量為76.7 mg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于DB53/T288—2009中的要求，故馬尾藻中鋁的含量在安全范圍內(nèi)。砷、銅、鎘的含量均在國標(biāo)或者地標(biāo)要求的安全范圍內(nèi)。根據(jù)表2可知，馬尾藻的各項(xiàng)農(nóng)藥殘留均未檢出；由此可知，本實(shí)驗(yàn)所用的馬尾藻是一種安全、無農(nóng)藥殘留的原材料。

表1馬尾藻重金屬殘留檢測(cè)結(jié)果(mg/kg)Table 1 Detection results of heavy metal residue in Hizikia fusiformis

表2馬尾藻農(nóng)藥殘留檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test results of pesticide residues in Hizikia fusiformis

2.2 馬尾藻對(duì)亞硝胺合成阻斷結(jié)果

根據(jù)圖1可知，馬尾藻具有很強(qiáng)的阻斷亞硝胺合成的能力，最高可達(dá)100%。當(dāng)提取的乙醇濃度在0%～50%之間時(shí)，馬尾藻阻斷亞硝胺合成的能力隨著乙醇濃度的提高而升高。乙醇濃度在50%～75%之間時(shí)，清除效果最佳，清除率高達(dá)100%。之后隨著乙醇濃度的提高，馬尾藻阻斷亞硝胺合成的能力反而降低。

圖1 不同濃度乙醇提取液對(duì)亞硝胺合成的阻斷率Fig 1 Nitrosamine synthesis blocking rate of H.fusiformis extract with different ethanol concentrations

2.3 馬尾藻對(duì)亞硝酸鹽的清除率

由圖2可知，馬尾藻提取物有較強(qiáng)的清除亞硝酸鹽的能力。提取馬尾藻的乙醇濃度在0%～75%之間時(shí)，馬尾藻提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除率與乙醇濃度呈正相關(guān)，在乙醇濃度為75%時(shí)，馬尾藻提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除率最高值達(dá)到53.33%。之后馬尾藻對(duì)亞硝酸鹽的清除率隨著乙醇濃度的升高而降低。

圖2 不同濃度乙醇提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率Fig 2 Nitrite scavenging rate of H.fusiformis extract with different ethanol concentrations

3 討論

檢測(cè)結(jié)果表明，馬尾藻中鉛等高危重金屬未檢出，鋁的含量為76.7 mg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于DB53/T288—2009的要求；而敵敵畏、氧樂果、甲氰菊酯等農(nóng)藥殘留未檢出；由此表明：實(shí)驗(yàn)所用馬尾藻安全、無農(nóng)藥殘留。

在模擬人體胃液條件下(溫度37℃、pH 3.0)，馬尾藻醇提物可一定程度上阻斷亞硝胺合成，當(dāng)乙醇濃度為0%時(shí)，馬尾藻粗提物對(duì)亞硝胺的合成阻斷率可達(dá)到72.59%；之后阻斷率隨著乙醇濃度的升高而提高，乙醇濃度在50%～75%之間時(shí)對(duì)亞硝胺合成的阻斷能力最強(qiáng)，清除率達(dá)到100%。 當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)升高時(shí)，馬尾藻粗提物對(duì)亞硝胺的合成阻斷率逐漸下降，當(dāng)乙醇濃度為100%時(shí)，阻斷率下降到82.94%。肖為等測(cè)定在不同乙醇提取比例下全緣馬尾藻的提取物對(duì)亞硝胺合成的阻斷能力，得出用75%乙醇提取的醇提物對(duì)亞硝胺合成的阻斷能力最強(qiáng)，達(dá)到22.78%[9]。分析結(jié)果產(chǎn)生差異的原因可能為原材料采用的馬尾藻亞種不同，不同亞種之間的活性成分的種類和比例存在差異，在提取過程中得到的提取物的成分與比例有差異，從而導(dǎo)致了馬尾藻提取物對(duì)亞硝胺的阻斷能力有差異。

同時(shí)，馬尾藻提取物有清除亞硝酸鹽的能力。乙醇濃度在0%～75%之間時(shí)，亞硝酸鹽的清除率逐漸提高，并且在25%～50%之間清除率顯著提高，當(dāng)醇提液的濃度是75%時(shí)，馬尾藻粗提物對(duì)亞硝酸鹽的清除效果最佳，清除率達(dá)到最高值53.33%。隨后隨著乙醇濃度的增加，亞硝酸鹽的清除率逐漸下降，當(dāng)乙醇濃度為100%時(shí)，清除率下降到42.10%。究其原因可能是馬尾藻中的活性成分分為脂溶性和水溶性[17]，可能當(dāng)乙醇濃度為75%時(shí)，有機(jī)溶劑與水的比例十分契合馬尾藻活性成分的萃取的最佳要求，從而萃取的活性成分含量最高，對(duì)亞硝酸鹽的清除效果最佳。

在海藻活性成分的提取方法中，水提法和醇提法具有操作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。本項(xiàng)目采用的提取方法為醇提法，相對(duì)于水提法，醇提法提取時(shí)間短，方便快捷，但是提取率較低，水提法用時(shí)長(zhǎng)，但提取效率高，成本低[18]。同時(shí)，不同的乙醇濃度會(huì)影響活性成分的浸出率，肖為等[9]測(cè)定在不同乙醇提取比例下全緣馬尾藻的提取物對(duì)亞硝酸鈉的清除能力，得出用0%乙醇提取的醇提物對(duì)亞硝酸鈉的清除能力最強(qiáng)，達(dá)到12.42%；隨著浸取液中乙醇比例的增加，提取物對(duì)亞硝酸鈉的清除能力呈下降趨勢(shì)。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生差異的可能原因有如下兩條：1)本實(shí)驗(yàn)與肖為等人的實(shí)驗(yàn)采用的原材料——馬尾藻亞種不同，不同亞種之間的活性成分的種類和比例存在差異，最終導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致。2)肖為等人實(shí)驗(yàn)的樣品液是烘干后再溶解的無醇樣液，本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的樣液是含有乙醇的粗提液，可能是由于乙醇的存在影響了粗提物對(duì)亞硝酸鈉的清除能力。

本項(xiàng)目當(dāng)醇提液的濃度是75%時(shí)，馬尾藻粗提物對(duì)亞硝酸鹽的清除效果最佳，當(dāng)乙醇濃度在50%～75%之間時(shí)對(duì)亞硝胺合成的阻斷能力最強(qiáng)，由此分析乙醇濃度對(duì)馬尾藻提取物的浸出率的影響。張郁松探究乙醇濃度對(duì)沙棘果渣中總黃酮提取的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，提取效果以50%濃度最好，分析原因可能是乙醇濃度過高會(huì)溶解一定的脂類物質(zhì)，從而降低了乙醇對(duì)黃酮類物質(zhì)的溶解[19]。魏穎等優(yōu)化蘋果渣中多酚的提取工藝，發(fā)現(xiàn)乙醇的體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)提取效果最好[20]。尹麗和郭小慧通過正交試驗(yàn)對(duì)銀杏葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度75%是提取的最佳條件[21]。通過75%乙醇消毒效果最好以及乙醇消毒原理猜想：乙醇具有很大的滲透能力，能進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)蛋白凝固，殺死細(xì)胞，從而使細(xì)胞膜喪失通透性，胞內(nèi)物質(zhì)浸出，而當(dāng)乙醇濃度過高時(shí)，乙醇很快使細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)凝固，從而形成一層蛋白質(zhì)硬膜，這層硬膜對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，阻止乙醇進(jìn)一步滲入細(xì)胞，胞內(nèi)物質(zhì)浸出率下降。只有當(dāng)乙醇與水以一定比例混合時(shí)，乙醇才能有效殺死細(xì)胞，改變細(xì)胞膜的通透性，達(dá)到最高的提取率。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：乙醇濃度為50%和75%時(shí)，馬尾藻提取物對(duì)亞硝胺合成的阻斷率高達(dá)100%；乙醇濃度為75%時(shí)，馬尾藻提取物清除亞硝酸鹽的能力最好，清除率為53.33%。由此可知，馬尾藻對(duì)亞硝化反應(yīng)具有良好的抑制作用。因此，進(jìn)一步研究馬尾藻醇提物的有效成分和功能，并加以開發(fā)利用，對(duì)預(yù)防癌癥有一定的積極意義。

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