基于免疫共沉淀-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的新型孕烷X受體配體檢測方法的建立

趙爽，姜棋予，孫慧偉，柴燕濤，李曉娟，王志杰，侯俊，趙敏

1.北京大學(xué)三〇二臨床醫(yī)學(xué)院；2.解放軍第三〇二醫(yī)院 臨床研究管理中心；北京 100039

肝炎病毒在我國有很高的感染率，超過8000萬人攜帶肝炎病毒或罹患肝炎病毒引起的各種慢性肝病，盡管對癥治療（如各種抗病毒治療策略）能夠發(fā)揮抗病毒作用、延緩疾病惡化，但仍有相當(dāng)比例的患者最終會進(jìn)展為肝細(xì)胞癌（hepato?cellularcarcinoma，HCC），對我國的公共衛(wèi)生系統(tǒng)以及臨床診療構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)[1]。在此基礎(chǔ)上，受限于現(xiàn)有臨床診療技術(shù)，大部分HCC患者初診即為進(jìn)展期（advancedHCC），失去手術(shù)治療等根治性治療的機(jī)會，因此抗腫瘤藥物治療具有極其重要的地位[1]。進(jìn)展期肝細(xì)胞癌治療藥物極為有限，主要是多靶標(biāo)蛋白激酶抑制劑等分子靶向藥物，包括惟一的一線治療藥物索拉非尼（sorafenib），以及少數(shù)二線治療藥物如瑞戈非尼（regorafenib）或阿帕替尼（apatinib）等[2-4]。盡管索拉非尼的廣泛使用能夠在一定程度上延長患者生存期、改善患者生存質(zhì)量，但僅有部分患者（26%～43%）對索拉非尼敏感，而隨著治療的進(jìn)行，這些對索拉非尼初始敏感的患者，往往會出現(xiàn)對藥物的耐受[5]。因此，探究進(jìn)展期HCC患者接受分子靶向治療敏感性差異和耐藥相關(guān)調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

目前，對進(jìn)展期HCC分子靶向治療耐藥的機(jī)制相關(guān)研究主要是探索不同信號通路之間的相互作用，如MAPK、PI3K/AKT等[5]。HCC除分子靶向治療耐藥外，還具有對傳統(tǒng)細(xì)胞毒性化療藥物的多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）[6]。盡管取得了一些進(jìn)展，但現(xiàn)有研究理論或模型等涉及的信號通路并非HCC特異的，也難以揭示HCC抗腫瘤耐藥的根源。我們的前期研究表明，孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）是一種重要的核受體，多種內(nèi)/外源小分子藥物/毒物都能夠作為PXR的配體/激動劑識別和活化PXR，誘導(dǎo)PXR下游基因的表達(dá)[7]。PXR的下游基因種類多樣、作用廣泛，包括各類耐藥蛋白（即藥物Ⅲ相代謝酶/藥物轉(zhuǎn)運體）、細(xì)胞色素氧化酶CYP450（即藥物Ⅰ相代謝酶/藥物氧化代謝酶）、基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶（即藥物Ⅱ相代謝酶/基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶）。這些既是人體外源性毒物代謝、清除與解毒所必需的，也是各種藥物耐藥相關(guān)蛋白。PXR作為肝臟對外源性藥物和毒物代謝與解毒機(jī)制的調(diào)控樞紐，活化的PXR最終通過這些代謝相關(guān)蛋白加速抗腫瘤藥物的代謝與清除等過程，最終影響HCC的治療效果[8]。由于肝臟是人體代謝中心，而HCC細(xì)胞具有更為旺盛的物質(zhì)攝取和代謝特性，因此PXR介導(dǎo)的抗腫瘤藥物的代謝與清除機(jī)制可能是HCC對抗腫瘤藥物MDR的根本來源和特異性機(jī)制。

綜上所述，作為配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子（核受體），PXR的活性與其配體/激動劑等密切相關(guān)?？鼓[瘤藥物、農(nóng)藥、環(huán)境污染物及各類固醇類激素等小分子物質(zhì)，都有可能作為PXR的配體參與調(diào)控抗腫瘤藥物耐藥，研究與確證這些小分子與PXR的相互作用具有重要意義[8]。但目前的研究技術(shù)存在諸多限制：螢光素酶報告基因?qū)嶒?、?xì)胞免疫熒光與核質(zhì)分離、染色質(zhì)免疫共沉淀等技術(shù)僅可在細(xì)胞體系中觀測小分子化合物對核受體等生物大分子的影響[9]；表面等離子共振（sur?facep lasmon resonance，SPR）等技術(shù)對設(shè)備要求較高，也難以直接觀測生物大分子與小分子的相互作用[10]；對蛋白質(zhì)等生物大分子可使用抗原-抗體相互識別進(jìn)行檢測，而傳統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究技術(shù)、策略難以檢測與識別小分子化合物。為解決這一問題，我們選取已知的PXR激動劑利福平為模型藥物，采用免疫共沉淀技術(shù)，形成生物大分子PXR與小分子利福平的復(fù)合物，利用免疫印跡實驗識別復(fù)合物中的蛋白分子，用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）識別復(fù)合物中的小分子，最終建立了基于免疫共沉淀-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的新型PXR配體檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293細(xì)胞，肝細(xì)胞癌細(xì)胞HepG2，前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、PC-3由本實驗室保存；帶有Flag標(biāo)簽的雄激素受體（androgen receptor，AR），PXR表達(dá)載體，PXR下游基因CYP3A4啟動子區(qū)序列（XREM與PXRE區(qū)域）的螢光素酶報告基因載體XREM-Luc、PXRE-Luc，AR應(yīng)答元件（andro?gen response element，ARE）報告基因載體（ARELuc）等由本實驗室保存[11-13]；利福平（Rifampicin）購自Selleck公司；雄激素二氫睪酮（dihydrotestos?terone，DHT）購自Sigma公司；常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)試劑［DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）等］購自Hyclone公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板等實驗耗材購自Corning公司；1.5mLEP管購自Eppendorf公司；真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipo?fectAMINE 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；Flagbeads、Flag抗體、乙腈（acetonitrile，ACN）及二甲亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）等為 Sigma公司產(chǎn)品；蛋白印跡實驗使用的化學(xué)發(fā)光試劑盒為北京天根公司產(chǎn)品；常規(guī)儀器均由本實驗室提供；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HEK293細(xì)胞于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于添加10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中；HepG2細(xì)胞于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于添加10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中。在真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中，細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)增長期，待其狀態(tài)良好時進(jìn)行實驗，取0.5μLLipofectAMINE2000試劑與Flag-AR、Flag-PXR表達(dá)載體（用5μL無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液充分溶解與稀釋）分別加入2個EP管中，每管添加24.5或20μL無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基，充分混勻后室溫靜置15min，最后將2管液體等量混合，輕輕混勻后室溫靜置15 min即為轉(zhuǎn)染工作液。細(xì)胞換為無血清培養(yǎng)基，將配制所得轉(zhuǎn)染工作液輕輕、緩慢加入細(xì)胞中，37℃孵育4h后換液，用含10%FBS的培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3 藥物配制

用精密天平稱取藥物，用DMSO充分溶解藥物。對于小分子、蛋白結(jié)合實驗，藥物用DMSO溶解后，用生理鹽水稀釋，終濃度為1μmol/L；對于螢光素酶報告基因?qū)嶒?，用DMSO溶解利福平后，配制為10、3、1、0.3、0.1、0.03及 0.01mmol/L等系列濃度梯度的工作液，在進(jìn)行實驗時稀釋，最終藥物作用于細(xì)胞的濃度為 10、3、1、0.3、0.1、0.03及0.01μmol/L，DMSO濃度約為1‰。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用實驗

用乙腈配制利福平溶液，按照Dompreh等[14]的方法進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測，表1列出具體的實驗/檢測條件。利福平相對分子質(zhì)量為823（母離子），在施加電壓后利福平離子被打碎，釋放出一個相對分子質(zhì)量約791的分子碎片（為子離子），以在這一過程中的利福平相對分子質(zhì)量變化（823/791）為其檢測特征。

1.5 免疫共沉淀實驗

在約2×108HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag空載體、Flag-AR或Flag-PXR的表達(dá)載體48h后收集細(xì)胞并裂解，用高鹽的免疫共沉淀緩沖液進(jìn)行免疫共沉淀實驗，用Flag-beads將Flag、Flag-AR或Flag-PXR蛋白從體系中分離出來。在此基礎(chǔ)上，將Flag-beads-蛋白復(fù)合物與1μmol/L利福平溶液于4℃孵育過夜。通過免疫印跡方法檢測Flagbeads-蛋白-利福平復(fù)合物中的Flag-AR與Flag-PXR，用液相色譜檢測復(fù)合物中的利福平。按照Ding等[15]的方法進(jìn)行免疫印跡實驗，辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的Flag單克隆抗體稀釋為1∶5000。

1.6 螢光素酶報告基因檢測

PXR轉(zhuǎn)錄因子活性檢測：在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-PXR表達(dá)載體以及螢光素酶報告基因表達(dá)載體XREM-Luc（含PXR下游基因CYP3A4增強(qiáng)子區(qū)域-7836/-7208序列）、PXRE-Luc（含PXR下游基因CYP3A4啟動子區(qū)域-362/+52序列）；在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-PXR表達(dá)載體以及螢光素酶報告基因表達(dá)載體XREM-Luc。

表1 液相色譜-質(zhì)譜參數(shù)

AR轉(zhuǎn)錄因子活性檢測：在PC-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-AR表達(dá)載體及螢光素酶報告基因ARE-Luc表達(dá)載體，在LNCaP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染螢光素酶報告基因ARE-Luc表達(dá)載體。

轉(zhuǎn)染實驗24h后收集細(xì)胞并裂解，依據(jù)Yang等的方法檢測報告基因的螢光素酶活性[16]。

1.7 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件，采用單因素方差分析比較x±s，計算P值。

2 結(jié)果

2.1 用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測利福平

結(jié)果如圖1，檢測到利福平的母離子/子離子對（Pair），表明建立了利福平的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。

2.2 Flag-PXR與Flag-AR的免疫共沉淀檢測

結(jié)果如圖2，轉(zhuǎn)染Flag-PXR與Flag-AR的表達(dá)載體，能夠在HEK293細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)融合蛋白；Flag-beads能夠從HEK293細(xì)胞體系中分離得到Flag-PXR與Flag-AR蛋白。這表明可以利用Flag-beads從HEK293細(xì)胞中免疫共沉淀Flag融合蛋白，并用免疫印跡實驗對Flag-beads-Flag蛋白復(fù)合物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測蛋白-小分子復(fù)合物中的利福平

用乙腈將復(fù)合物中的利福平萃取出來，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測，在特異性確證（利用特異性相對分子質(zhì)量的823/791離子對確證檢測到利福平）后，用質(zhì)譜掃描與記錄檢測到的823離子信號（圖3）；在此基礎(chǔ)上，能夠從利福平溶液（In?put）中檢測到利福平的液-質(zhì)信號，從空載體（Flag）組、Flag-AR組微珠中無法檢測到利福平，而從Flag-PXR組微珠中能夠檢測到明確的利福平信號（圖4）。這表明，只有PXR而非Flag標(biāo)簽或Flag-AR能夠與利福平相互作用。

我們不得不承認(rèn)，現(xiàn)代詩的進(jìn)一步成就的學(xué)習(xí)不能僅僅依靠課堂上的幾十分鐘，現(xiàn)代詩的美和它的寫作藝術(shù)都是值得我們學(xué)習(xí)和考究的。戴望舒在《雨巷》的創(chuàng)作中，不僅將中國詩歌的典雅清韻運用得淋漓盡致，而且還將國外現(xiàn)代詩的精華與之結(jié)合，這無疑將現(xiàn)代詩向前推進(jìn)了一大步。他的大膽和勇敢造就了他，也成就了《雨巷》，成為現(xiàn)代詩的絕唱，使得無數(shù)讀者被它的美所感染。

2.4 利福平誘導(dǎo)PXR轉(zhuǎn)錄因子活性的螢光素酶報告基因活性檢測

前述可知，PXR能夠與利福平相互作用。為確定利福平作用于PXR的特異性，利用螢光素酶報告基因活性實驗檢測利福平對PXR轉(zhuǎn)錄因子活性的影響，結(jié)果如圖5，利福平能夠劑量依賴地誘導(dǎo)PXR的轉(zhuǎn)錄因子活性。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測了利福平對AR轉(zhuǎn)錄因子活性的影響，結(jié)果如圖6，利福平不能誘導(dǎo)AR的轉(zhuǎn)錄因子活性。轉(zhuǎn)錄因子活性實驗結(jié)果驗證了小分子與核受體的相互作用。

3 討論

進(jìn)展期肝細(xì)胞癌藥物研發(fā)與臨床診療面臨巨大挑戰(zhàn)，闡明抗腫瘤藥物耐藥的機(jī)制，研究與開發(fā)逆轉(zhuǎn)耐藥的干預(yù)策略具有重要意義。我們的前期研究著眼于肝細(xì)胞癌自身的特性：肝臟是人體代謝的中心，而HCC細(xì)胞具有更為旺盛的物質(zhì)攝取和代謝特性，因此PXR介導(dǎo)的抗腫瘤藥物的代謝與清除機(jī)制可能是HCC對抗腫瘤藥物MDR的根本來源和特異性機(jī)制，最終發(fā)現(xiàn)與提出PXR的活化進(jìn)而誘導(dǎo)抗腫瘤藥物代謝與清除，最終造成抗腫瘤藥物耐藥[3,17]。PXR的配體或激動劑是PXR活化所必需的，因此檢測與確證小分子化合物是否能夠與PXR結(jié)合并相互作用具有重要意義[7-8]。

圖1 基于母離子/子離子對的利福平液相質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法

盡管發(fā)現(xiàn)與鑒定PXR的潛在配體或激動劑具有重要意義，但這一研究也對現(xiàn)有實驗技術(shù)構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)。對于傳統(tǒng)生化或細(xì)胞學(xué)研究者，可通過抗原-抗體識別等技術(shù)研究蛋白質(zhì)等生物大分子，通過PCR等特異性擴(kuò)增目的核酸片段，但小分子化合物的研究與鑒定是難點。以螢光素酶報告基因等為代表的生化與細(xì)胞學(xué)研究技術(shù)僅能間接反映小分子對生物大分子的影響。最近被廣泛應(yīng)用的SRP等技術(shù)雖然能夠檢測蛋白質(zhì)與小分子的相互作用，但設(shè)備要求很高且實驗費用昂貴，仍然是間接檢測：蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合后，其構(gòu)象等性質(zhì)發(fā)生變化，通過生物-化學(xué)/生物-物理傳感器等檢測到蛋白性質(zhì)的變化，間接反應(yīng)出蛋白與小分子的結(jié)合或相互作用。

圖2 免疫共沉淀實驗檢測與識別Flag融合蛋白

為進(jìn)一步完善相關(guān)研究，本研究建立了基于免疫共沉淀-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的PXR配體檢測方法：用免疫共沉淀與免疫印跡技術(shù)識別蛋白-小分子復(fù)合物中的蛋白質(zhì)組分，用LC-MS/MS技術(shù)識別蛋白-小分子復(fù)合物中的小分子化合物。在HEK3293細(xì)胞中表達(dá)得到帶有Flag標(biāo)簽的目的蛋白Flag-PXR與Flag-AR，用Flag-beads將這些蛋白分離純化，再與利福平溶液孵育。用Flag抗體可對Flag-PXR、Flag-AR蛋白進(jìn)行檢測，用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對復(fù)合物中的利福平進(jìn)行識別。

圖3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測利福平

圖4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測復(fù)合物中的利福平

圖5 利福平對PXR轉(zhuǎn)錄因子活性檢測實驗

圖6 利福平對AR轉(zhuǎn)錄因子活性檢測實驗

作為低背景的細(xì)胞模型，HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率很高，是研究的理想模型，結(jié)果特異性較高。免疫共沉淀相關(guān)技術(shù)是特異性檢測蛋白質(zhì)的常用技術(shù)，同時免疫共沉淀系統(tǒng)對樣品有純化與富集作用，也更利于LC-MS/MS檢測。在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用螢光素酶共沉淀實驗?zāi)軌驅(qū)π》肿幼饔玫奶禺愋赃M(jìn)行驗證。值得一提的是，雄激素受體被用作無關(guān)對照，目前尚無利福平影響AR的報道，本研究中利福平不能與AR相互作用，也不能誘導(dǎo)AR的轉(zhuǎn)錄因子活性。綜上所述，我們建立了基于免疫共沉淀-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的新型孕烷X受體配體檢測方法，能夠利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對蛋白質(zhì)-小分子復(fù)合物中的小分子化合物進(jìn)行直接觀測，這不僅拓展了我們對大分子-小分子相互作用的研究，也對抗腫瘤藥物耐藥研究具有重要意義。

參考文獻(xiàn)