RNA質量對內參基因選擇和qRT-PCR結果評價的影響

霍雪萍，張琳萍，趙向絨，劉勤社，王海芳

1.陜西省人民醫(yī)院 中心實驗室，陜西 西安 710068；2.西安交通大學 醫(yī)學部中西醫(yī)結合專業(yè)，陜西 西安 710061；3.陜西省中西醫(yī)結合心血管病防治重點實驗室，陜西中醫(yī)藥大學，陜西 西安 712046

在研究分子機理時，檢測相關基因在mRNA水平的表達差異是重要環(huán)節(jié)，目前多采用實時定量 熒 光 PCR（quantitativereal-timePCR，qRTPCR）方法，具有定量準確、靈敏度高、快速簡便及高通量等特點[1]。制備高質量的RNA，選定表達穩(wěn)定的內參基因，對目的基因的相對表達量進行校正，是獲得真實準確的實驗數據的前提。

核酸質量的控制是對qRT-PCR實驗結果質量控制的第一步。核酸在260nm處有最大吸收峰，蛋白質在280nm處有最大吸收峰，鹽和小分子在230nm處有最大吸收峰。D260nm/D280nm和D260nm/D230nm是核酸純度的指示。高質量RNA的D260nm/D280nm能達到 1.8～2.2，如果比值低于 1.8，表示存在蛋白質或酚類物質的影響；D260nm/D230nm值應大于2.0，若比值小于2.0則表明樣品被糖類、鹽類或有機溶劑污染[2]。以往的研究關注D260nm/D280nm值對qRT-PCR結果的影響較多，而對D260nm/D230nm值的影響關注較少。

我們在利用qRT-PCR法檢測腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor α，TNFα）調控下游細胞間黏附分子1（intercellularcelladhesionmolecule-1，ICAM-1）基因表達的研究中，發(fā)現RNA質量對于內參基因的選擇和基因表達水平的評價分析具有顯著影響。在此進行報告，以期為相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠動脈內皮細胞（arterialendothelialcell，AEC）購自上海拜力生物科技有限公司；RPMI-1640細胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自Clontech公司；細胞培養(yǎng)用青霉素/鏈霉素和胰蛋白酶購自碧云天生物技術研究所；重組小鼠TNFα購自北京義翹神州生物技術公司；總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理

小鼠AEC貼壁生長于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫密閉細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，0.025%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。將6孔細胞培養(yǎng)板中長滿（80%～90%）的AEC分為正常組和TNFα組。A批次的TNFα組為50 ng/mLTNFα誘導6h，B批次的TNFα組為30ng/mLTNFα誘導6h。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

收集細胞，加入1mLTRIzol試劑，按說明書實驗流程提取細胞總RNA，用NanoDrop2000C紫外分光光度計（Thermoscientific公司）檢測總RNA濃度和純度，每個樣品上樣量為1μL。D260nm值作為RNA濃度測定的指標（以ng/mL為單位），D260nm/D280nm和D260nm/D230nm比值作為RNA純度的指標。反轉錄反應采用PrimeScriptRTMaster Mix（PerfectRealTime）試劑盒（TaKaRa公司）。反轉錄體系為10μL，以500ng總RNA為起始材料，5×PrimeScriptRTMasterMix2 μL，無 RNA酶水補足10μL。反轉錄條件：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。

1.4 引物設計與合成

用NCBI軟件設計β-actin、GAPDH和ICAM-1引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息見表1。

1.5 qRT-PCR法檢測基因表達

用 SYBR Premix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa公司）和ABI7500熒光PCR擴增儀（Life公司）進行熒光定量PCR檢測。PCR反應體系：SYBR Premix ExTaqⅡ（TilR NaseH Plus）10 μL，模板 cDNA1 μL，正反引物各 0.5 μL，ddH2O8μL，總體系20μL。所有操作在冰上完成，每個樣品設立3個復孔。反應條件：95℃預變性 5min，95℃變性 1min，58℃退火 45s，72℃延伸45s，在延伸階段進行熒光信號采集，40個循環(huán)。分別以β-actin、GAPDH為內參基因，計算同一樣本中目的基因與內參基因的含量比值，評價目的基因表達水平。

表1 引物信息

1.6 統(tǒng)計學方法

從ABI7500熒光定量PCR儀中導出閾值循環(huán)數（Ct），換算各基因的相對表達量為 2-ΔΔct，采用Excel軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 RNA質量評價

用NanoDrop2000C紫外分光光度計對RNA的濃度和純度進行檢測。A組樣品RNA的D260nm/D280nm為 1.8～2.2，D260nm/D230nm＞2.0，表 明 該 組 樣 品RNA純度好；B組樣品RNA的D260nm/D280nm為1.8～2.2，D260nm/D230nm＜2.0，表明該組樣品可能被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機溶劑污染。見表2。

2.2 qRT-PCR基因檢測結果

以1μLcDNA作為qRT-PCR的起始模板，確保cDNA大致相同的拷貝數，以保證后續(xù)結果具有可比性。圖1為內參基因和目標基因的溶解曲線，出現單一的信號峰，說明沒有引物二聚體和非特異性條帶產生，引物設計合理，結果準確可靠，滿足實時熒光定量PCR對引物的要求。表3為A、B批次樣品PCR反應中2種內參基因及目的基因ICAM-1的mRNA表達水平。A批次樣品β-actin和GAPDH基因的Ct值小于20，2個內參基因的表達量均較高且一致性好；B批次樣品β-actin基因的Ct值大于20，GAPDH基因的Ct值小于20，組內一致性均較好。以上數據表明實驗操作過程無誤，數據可信度高。

表2 RNA質量對照表

2.3 qRT-PCR結果分析

采用 2-ΔΔct法對 ICAM-1 的 mRNA 水平進行相對定量分析。A批次，采用2種內參基因進行相對定量，TNFα組的ICAM-1mRNA表達水平非常接近；B批次，以β-actin和以GAPDH作為內參基因對ICAM-1相對定量，TNFα組的表達水平差別近30倍（表4）。

圖1 基因熔解曲線

表3 qRT-PCR基因檢測結果（Ct值）

表4 內參基因對目標基因表達結果分析的影響

3 討論

實時熒光定量PCR是分析基因表達的一種有效方法，但分析結果會受RNA質量、RNA反轉錄、擴增效率等多種因素的影響[3]。為了避免這類誤差的產生，在分析目標基因的表達量時，須選擇表達穩(wěn)定性較高的內參基因作為校正標準。然而，任何一種內參基因的所謂穩(wěn)定表達都是在一定類型的細胞或實驗因素作用下在一定范圍內的恒定，并非絕對的穩(wěn)定表達[4]。許多研究證實理想的內參基因并不存在，不同的處理因素以及不同組織中內參基因表達的穩(wěn)定性是不一致的[5-6]。因此，在利用qRT-PCR進行基因表達的研究時，應根據不同的實驗條件、實驗樣品選用合適的內參基因。

TNFα是機體急、慢性炎癥反應的重要細胞因子，能夠誘導多種黏附分子的表達，促進單核細胞浸潤，參與炎癥病理進程。ICAM-1是公認的血管炎性疾病標志物之一。我們發(fā)現在研究TNFα作用的文獻中，有關ICAM-1分子水平的檢測大多采用β-actin作為內參基因。我們采用2種常用內參基因GAPDH和β-actin進行研究時發(fā)現，RNA質量對于內參基因的選擇和qRT-PCR結果評價具有重要意義。RNA的D260nm/D280nm和D260nm/D230nm比值都應當加以考慮。當核酸D260nm/D280nm在正常范圍內，D260nm/D230nm＞2.0，即RNA純度很高時，采用2種內參對于目的基因ICAM-1的相對表達量評價結果相近；如果D260nm/D230nm＜2.0，即RNA純度不高時，采用不同內參對于ICAM-1基因的相對表達量評估存在很大差異，比較而言，此時選用GAPDH內參評價結果的可信度更高。因此，在進行TNFα的相關分子研究以及對珍稀樣品進行生物學研究時，應針對核酸質量選擇合適的內參基因進行qRT-PCR實驗，必要情況下可選擇至少2個內參，綜合分析，得出可靠的實驗結果。