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    運用數(shù)字PCR檢測乳腺癌組織FFPE樣品中人表皮生長因子受體2拷貝數(shù)的變化

    2018-06-13 03:34:22董周寰張晶王哲許程程王芳宋海峰付潔石懷銀
    生物技術通訊 2018年3期
    關鍵詞:檢測

    董周寰,張晶,王哲,許程程,王芳,宋海峰,付潔,石懷銀

    1.解放軍總醫(yī)院 病理科,北京 100853;2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 生命組學研究所,蛋白質藥物國家工程研究中心,北京 102206;3.北京金則醫(yī)學科技發(fā)展有限公司,北京 102206;4.軍科正源(北京)藥物研究有限責任公司,北京 102206

    人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2,又稱 ERBB2)是人表皮生長因子家族成員,其基因位于17號染色體。HER2過表達是促發(fā)多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵因素,也是靶向治療選擇的關鍵指標之一[1-3],抗體藥物赫賽汀可有效治療約25%的HER2高表達型乳腺癌[4]。研究表明,除乳腺癌外,胃癌等癌癥中HER2基因拷貝數(shù)會發(fā)生變異[5-6],因此準確考察HER2基因拷貝數(shù)變化(copy number varia?tion,CNV),對于靶向治療意義重大。

    目前臨床上常通過免疫組化(immunohisto?chemistry,IHC)和熒光免疫雜交(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)的方法進行靶點確證,判斷患者疾病進程,但研究表明HER2檢測有10%~20%結果無法準確反映[7],主要因素為:①操作者技術水平影響;②結果評判存在主觀性;③腫瘤的異質性導致取樣偏差[7-8]。另外,F(xiàn)ISH是用探針檢測切片樣品中HER2、CEP-17的信號,通過HER2、CEP-17熒光信號的比值來評價HER2的擴增程度,但有文獻報道CEP-17本身可能也會異常擴增[9],僅以其作為內參基因可能會導致部分患者不能受益于HER2靶向治療。

    雖然FISH是目前檢測HER2CNV的金標準,但由于上述局限性,以及通量低成本較高,仍需要更為準確、客觀、較高通量、成本較低的檢測技術加以輔助甚至替代。數(shù)字PCR(droplet digi?talPCR,ddPCR)是目前最具潛力的檢測方法之一,早在20世紀90年代就有科學家提出ddPCR的概念[10-12]。近幾年,ddPCR在微生物[13]、拷貝數(shù)變異[14]、基因突變[15]等分析領域有突破性貢獻。ddPCR是組織提取后勻質狀態(tài)下靶分子的絕對定量技術,具有很高的靈敏度與準確性[16]。我們將ddPCR用于HER2CNV檢測,并與IHC、FISH結果進行比較,希望將ddPCR發(fā)展為IHC、FISH檢測的有力補充手段之一。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    收集解放軍總醫(yī)院2015年3~7月經(jīng)病理確診為乳腺癌的福爾馬林固定石蠟包埋(formalinfixed and parrffin-embedded,F(xiàn)FPE)樣本 21例,其中IHC結果顯示為“++”樣品18例,“+++”樣品3例。該批樣本均經(jīng)FISH方法檢測HER2CNV。

    FFPE樣品DNA提取試劑盒購自凱杰公司;細胞基因組DNA(gDNA)提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;ddPCR探針法自動化微滴發(fā)生油、檢測預混液分析專用油購自Bio-Rad公司;HER2和CEP-17的DNA檢測引物探針序列由本實驗室參考文獻[17]及NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫后利用軟件Prime5.0設計(表1),由上海生工公司合成;HER2IHC檢測一抗為兔IgG,購自中杉金橋生物技術有限公司,克隆號EP3;二抗檢測系統(tǒng)為羅氏Ventana公司的UltraView Universal DABDetection試劑盒;FISH檢測使用乳腺癌HER2基因檢測試劑盒(FISH法)(PathVysion)。

    表1HER2及CEP-17引物探針序列

    Bio-RadQX200自動化數(shù)字PCR系統(tǒng)(微滴生成儀器,微滴讀取儀器,T100PCR儀,熱封儀);Thermo臺式離心機等實驗室常規(guī)儀器。

    1.2 標本核酸提取

    21例FFPE樣本經(jīng)石蠟包埋后切片用于IHC及FISH檢測判斷患者病理情況,同時每個組織再切2片,厚度均為5μm,置于1.5mL無核酸酶EP管中,室溫保存。用凱杰公司FFPE樣品DNA提取試劑盒提取樣品gDNA,用NanoDrop檢測濃度、純度后以10μL/管分裝保存于-60℃~-90℃冰箱。

    1.3 細胞系DNA提取

    HER2表達正常型細胞系人胚腎細胞293T、人口腔上皮細胞HOEC,以及HER2陽性表達卵巢癌細胞系SKOV3購于ATCC并保存于本實驗室,收集對數(shù)生長期細胞,用細胞gDNA提取試劑盒提取gDNA,并經(jīng)NanoDrop檢測濃度、純度后10 μL/管分裝,-60℃~-90℃保存。

    1.4HER2、CEP-17ddPCR檢測方法建立

    設計、合成HER2、CEP-17引物探針,以293T、HOEC、SKOV3細胞gDNA為模板建立反應體系及程序。ddPCR反應體系包括Supermix 10 μL,上、下游引物各 0.8 μmol/L,探針 0.25 μmol/L,DEPC水 4.3 μL,gDNA40ng/2 μL。將反應體系配置在96孔板后,在Bio-Rad自動化數(shù)字PCR微滴生成儀中生成微滴,封板后在普通PCR儀上進行擴增(擴增程序:95℃ 5min;94℃30s,60℃ 40s,40個循環(huán);98℃ 10min)。擴增畢,用微滴分析儀及QuantaSoft軟件分析結果,得到每個樣品中HER2、CEP-17基因的拷貝數(shù)。

    1.5 線性稀釋

    將293T細胞gDNA用DEPC水稀釋至20ng/μL,并按1/5梯度稀釋為5個濃度水平,上樣量均為 2 μL/反應,即上樣量分別為 40、8、1.6、0.32、0.064ng/反應。按1.4中的反應體系及程序配置ddPCR樣品并進行檢測。

    1.6 單通道、雙通道檢測方法比較

    以梯度稀釋的293T細胞gDNA為模板建立雙通道反應體系(上樣量分別為40、8、1.6、0.32ng/反應),即HER2、CEP-17引物和探針于同管反應。同時從IHC檢測結果為“++”和“+++”的樣品中各隨機挑選1個(最終選擇樣本為9#、14#),制備CEP-17(FAM,藍色)及HER2(VIC,綠色)單通道反應體系和雙通道反應體系,反應程序與1.4中描述相同。

    1.7 標本樣品ddPCR檢測

    所有樣品均采用雙通道檢測法檢測,以Ratio(HER2/CEP-17)表述樣品中的HER2CNV。

    1.8 標本樣品IHC及FFPE檢測

    IHC檢測流程:石蠟切片脫蠟至水;pH9.0 EDTA溶液修復1h;3%H2O2室溫孵育10min以消除內源性過氧化物酶的活性;蒸餾水沖洗,PBS浸泡;滴加一抗工作液,37℃孵育1h;PBS沖洗3次;按說明書進行二抗孵育及顯色;自來水充分沖洗,復染,脫水,透明,封片。

    FISH檢測按試劑盒說明書進行。

    2 結果

    2.1 細胞系HER2/CEP-17檢測結果

    HER2正常表達型293T細胞和HOEC細胞HER2/CEP-17值分別為 1.20(8020/6700)和 1.24(7880/6360),SKOV3細胞HER2/CEP-17值為4.83(22010/4560)。

    2.2 線性稀釋結果

    為考察引物、探針響應性,以293T細胞gDNA樣品系列稀釋模板做線性考察,結果表明R2>0.99,2種基因引物探針符合檢測要求,典型的ddPCR結果見圖1。

    2.3 單通道、雙通道檢測結果

    293T細胞gDNA稀釋至1/5,分別用CEP-17和HER2引物探針進行單通道、雙通道檢測,以考察引物探針PCR反應性能。如圖2,單、雙通道結果一致,線性R2>0.99,引物、探針符合ddPCR檢測要求,且在1個反應孔中進行2種靶基因的擴增不會相互干擾。9#、14#樣品的單、雙通道檢測結果顯示HER2/CEP-17值精密度高(CV分別為2.4%、3.1%)。

    2.4 ddPCR檢測結果界定

    鑒于293T、HOEC細胞系中HER2/CEP-17值為1.2,結合ddPCR的技術原理,本研究中對標本樣本暫定為:當HER2、CEP-17其中之一拷貝數(shù)≥20000時,須降低上樣量重測;在此基礎上,當樣本HER2/CEP-17值≥2.1時為HER2擴增陽性,當樣本2.1>HER2/CEP-17值≥1.2時為HER2臨界陽性,當樣本HER2/CEP-17值<1.2時為HER2擴增陰性。

    2.5 FISH檢測結果

    參照ASCO/CAP公布的2013版HER2檢測指南,本研究根據(jù)FISH檢測對HER2CNV的評判標準如下:①當HER2/CEP-17比值≥2.0時,為HER2陽性;HER2/CEP-17比值<2.0,但平均拷貝數(shù)/細胞≥6.0時也為HER2陽性;②若眾多信號連接成簇時可不計算,視為基因擴增;③HER2/CEP-17比值<2.0且平均拷貝數(shù)/細胞<4.0時為HER2陰性;④HER2/CEP-17比值<2.0且平均拷貝數(shù)/細胞≥4.0但<6.0,F(xiàn)ISH不確定;⑤HER2/CEP-17比值≥2.0,但平均拷貝數(shù)/細胞<4.0的病例是否該視為陽性,目前存在一定爭議。本研究所取樣本的FISH結果均為>2.0的樣本為陽性,<2.0的樣本為陰性。關鍵樣本FISH結果如圖3,F(xiàn)ISH染色后,用奧林帕斯顯微鏡BX53觀測(目鏡10×,油鏡100×),攝像頭DP70拍照。

    2.6 ddPCR、IHC、FISH結果比較

    將同一樣品3種檢測平臺所得結果統(tǒng)一比較(表2)。在14例IHC檢測為“++”、FISH檢測小于2.0的樣品中,13例ddPCR檢測陰性,1例(2#)臨界陽性,但該例樣本的FISH檢測結果為1.96,接近FISH的陽性判斷標準。在3例IHC檢測為“+++”、FISH檢測為陽性的樣本中,2例ddPCR檢測為陽性,1例(17#)檢測臨界陽性。還有2例IHC檢測為“++”的樣品,F(xiàn)ISH檢測為陽性,但ddPCR檢測為陰性。

    圖1 典型CEP-17(A)和HER2(B)ddPCR結果圖

    圖2 293T細胞DNA單通道(A)和雙通道(B)檢測結果及HER2/CEP-17值

    圖3 典型FISH陰性(A)和陽性(B)結果

    表2 IHC、FISH及ddPCR結果比較

    3 討論

    ddPCR與實時定量PCR技術原理相同,通過酶、引物、探針等對靶基因進行擴增并轉化成可用于定量的數(shù)值。與實時定量PCR“一鍋反應”不同的是,ddPCR主要通過微滴生成或芯片將反應體系分成 1×104~2×104個微滴,以形成一個個微小的獨立反應器,數(shù)據(jù)分析時直接給出每個樣品中靶基因的拷貝數(shù),對于微量拷貝數(shù)的定量更為準確。ddPCR與所有PCR實驗一樣,在實驗過程中須嚴格操作,保證環(huán)境、樣品不被氣溶膠污染。在ddPCR的引物篩選及條件優(yōu)化中,我們常選擇陰性、陽性微滴信號分布相對集中且間隔較大情況下對應的體系及程序。同時,數(shù)據(jù)分析中,需要用陰性對照劃閾值線判定陰、陽性微滴,與實時定量PCR不同的是,ddPCR可結合分析批中陰性對照設置的數(shù)量及檢測的結果通過軟件計算出分析批的陽性Cut-off值,只有大于Cut-off值的樣品才真正含有靶基因,小于Cut-off值的樣品為弱陽性/假陽性,陽性微滴的產(chǎn)生可能源于污染或系統(tǒng)誤差等,可選擇重測(主要看實驗者如何設計實驗)。但還需要同時考察樣品陽性微滴所在的信號范圍,如果僅是在閾值線的上方,遠達不到陽性對照樣品中陽性微滴的信號值,則須更加科學地分析這些微滴是否是真的“陽性”。

    為對樣品前處理回收率、ddPCR檢測上樣量進行歸一,我們以HER2同一染色體上的CEP-17為對照,采用HER2/CEP-17的形式進行報告,排除切片質量、提取回收效率等因素的干擾。雖然HER2/CEP-17是FISH中HER2檢測的金標準,但我們不能僅依靠CEP-17來判斷17號染色體的數(shù)目[8,18-20]。在檢測樣品時,應盡量保證相同的切片數(shù)量、處理方法、ddPCR體系和程序,在分析結果的過程中關注CEP-17和HER2各自的拷貝數(shù),及時發(fā)現(xiàn)異常,科學地分析數(shù)據(jù)。本研究ddPCR分析結果表明,在切片數(shù)量和DNA上樣量一致的前提下,CEP-17拷貝數(shù)變化范圍為幾百至幾千拷貝,說明存在樣本核酸片段化差異顯著情況或者異常擴增的情況。該現(xiàn)象提示我們,ddPCR檢測應用于臨床前需要對FFPE樣品保存和樣本前處理進一步優(yōu)化,甚至可用新鮮凍存樣本。此外,ddPCR可能需要參比多個內參基因排除CEP-17異常擴增的問題。

    本研究中我們檢測了21例樣品,初步得到用ddPCR法檢測HER2CNV(HER2/CEP-17比值)的Cut-off值范圍,并且與FISH陰性樣品的一致性為13/14,陽性結果完全一致性為2/7(其他5例FISH陽性的樣本中,3例ddPCR檢測為臨界陽性,2例為陰性,其FISH檢測結果分別為2.1、2.3)。從上述結果比對中可見,腫瘤的異質性可能導致FISH或ddPCR取樣或結果判讀存在一定的主觀因素,特別是對臨界陽性的樣本。我們仍須繼續(xù)增加樣本量,并盡量追蹤FISH檢測與ddPCR檢測不一致的個體的其他檢測結果,甚至后期疾病進展情況,以建立ddPCR從FFPE切片樣品中檢測HER2CNV與IHC進程的參數(shù),成為輔助IHC、FISH用于臨床研究及診斷的檢測手段。

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