紅景天苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝損傷模型小鼠Keap1-Nrf2信號(hào)通路的影響Δ

左瑋，張波，梅丹（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院藥劑科/協(xié)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京100730）

對(duì)乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）又名撲熱息痛，是一種常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，于1893年首次合成，1960年作為非處方藥（OTC），是公認(rèn)推薦劑量安全有效、胃腸道不良反應(yīng)較少的解熱鎮(zhèn)痛藥[1]，但其會(huì)導(dǎo)致肝損傷，這成為限制其臨床應(yīng)用的主要問(wèn)題之一，至今尚未得到解決。紅景天（Rhodiola roseaL.）為景天科多年生草木或灌木植物，藥用歷史悠久。紅景天苷（Salidroside，SALD）是紅景天經(jīng)現(xiàn)代化學(xué)分離提取后的主要活性成分，具有抗疲勞、抗衰老、抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[2-3]。戴博等[4]發(fā)現(xiàn)高山紅景天對(duì)APAP誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制并不清楚。氧化應(yīng)激與肝疾病的發(fā)生息息相關(guān)，APAP代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基、親電體和活性氧自由基（ROS）可以引起脂質(zhì)過(guò)氧化，最終導(dǎo)致肝損傷。無(wú)論是酒精性或者非酒精性脂肪肝疾病，還是藥物或者其他化合物導(dǎo)致的肝損傷中，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）-核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf2）信號(hào)通路在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的過(guò)程中都起到了重要作用[5]。本研究用APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型，觀察SALD抗藥物性肝損傷的作用，并從Keap1-Nrf2信號(hào)通路出發(fā)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討，為闡明SALD對(duì)APAP所致肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BX51型顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；2K16型臺(tái)式低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；DYY-7C型電泳轉(zhuǎn)移裝置（北京六一儀器廠）；TBA-40FR型全自動(dòng)生化分析儀（日本Toshiba公司）。

1.2 藥品與試劑

乙酰半胱氨酸（NAC）標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：1009005，純度：98%）、SALD標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：05410590，純度：99%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；APAP標(biāo)準(zhǔn)品（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：103-90-2，純度：99%）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號(hào)：2014-2401158）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號(hào)：2014-2401157）、堿性磷酸酶（ALP，批號(hào)：2014-2401128）、乳酸脫氫酶（LDH，批號(hào)：2014-2401131）、胞漿胞核蛋白提取試劑盒以及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔/羊抗小鼠二抗均購(gòu)自中生北控生物科技有限公司；Nrf2、Keap1、血紅素氧合酶1（HO-1）、還原型輔酶/醌氧化還原酶1（NQO1）和谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCLC）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、抗增殖性細(xì)胞核抗原（PCAN）抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3 動(dòng)物

C57BL/6小鼠60只，SPF級(jí)，♂，體質(zhì)量23～25 g，由北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（京）2011-0004。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物福利倫理委員會(huì)要求。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為正常組、模型組、陽(yáng)性組（150 mg/kg NAC）[6]和SALD低、中、高劑量組（100、200、300 mg/kg）[7-9]。各組小鼠均給予正常飼料，自由飲水。各給藥組小鼠按10 mL/kg灌胃相應(yīng)藥物，給藥后1 h灌胃500 mg/kg的APAP；正常組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，其中模型組小鼠在給予生理鹽水后1 h灌胃500 mg/kg的APAP。每天給藥1次，連續(xù)給藥5 d。

2.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥后禁食不禁水，9 h后對(duì)小鼠摘除眼球取血，將血樣于室溫下靜置120 min，然后以1 409×g離心10 min，常規(guī)分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定小鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH含量。

2.3 肝組織病理學(xué)觀察

取血后處死小鼠，取肝大葉同一部分組織，以3%蔗糖-多聚甲醛溶液（4%多聚甲醛配制）固定，常規(guī)制備石蠟切片（4 μm），脫蠟，水化。行蘇木精-伊紅（HE）染色，用自來(lái)水和蒸餾水依次洗滌浮色，75%鹽酸乙醇分化并用蒸餾水洗滌，封片，在顯微鏡下拍照觀察各組小鼠肝組織病理學(xué)變化。

2.4 肝組中Keap1-Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)

采用Western blot法檢測(cè)小鼠肝組織中Nrf2、Keap1、NO-1、NQO1和GCLC蛋白表達(dá)。取各組小鼠（每組選4只）肝大葉同一部分組織，稱質(zhì)量，放入預(yù)冷的組織裂解液中裂解30 min，然后將裂解組織收集到1.5 mL EP管中進(jìn)行超聲勻漿，將組織勻漿于4℃條件下以13 400×g離心20 min，取上清（為全蛋白）。按照胞漿胞核蛋白提取試劑盒說(shuō)明分別提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白，二喹啉甲酸法（BCA）進(jìn)行蛋白定量。每組取50 g蛋白樣品上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳對(duì)樣品進(jìn)行分離。分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉，加入相應(yīng)一抗（1∶1 000）后4℃孵育過(guò)夜，棄去一抗；TBST洗膜洗3次，加入二抗（1∶5 000），室溫?fù)u床孵育2 h。加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液，采用成像軟件LAS3000 Image Reader拍照并保存圖像，Quantity one軟件進(jìn)行圖片分析，計(jì)算條帶灰度值，以目的蛋白條帶條帶灰度值與內(nèi)參（細(xì)胞核蛋白測(cè)定以PCAN為內(nèi)參，細(xì)胞質(zhì)蛋白測(cè)定以β-actin為內(nèi)參）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0軟件學(xué)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Turkey’s test法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH含量均不同程度減少，除SALD低劑量組小鼠血清中LDH含量減少不顯著外，其余各給藥組小鼠血清中各指標(biāo)含量均顯著減少（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10，U/L）Tab 1 Content determination of ALT，AST，ALP and LDH in serum of mice in each group（±s，n＝10，U/L）

表1 各組小鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10，U/L）Tab 1 Content determination of ALT，AST，ALP and LDH in serum of mice in each group（±s，n＝10，U/L）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

組別正常組模型組陽(yáng)性組SALD低劑量組SALD中劑量組SALD高劑量組LDH 165.53±109.33 1 453.33±83.64＊＊451.36±85.64##1 241.86±89.32 501.27±94.47##857.13±96.64##ALT 51.33±66.46 649.34±66.46＊＊139.87±55.26##328.54±46.58##119.36±39.26##181.67±27.91##AST 26.52±111.31 800.65±100.42＊＊136.58±98.91##486.11±82.31##135.89±86.46##191.43±79.26##ALP 41.96±29.01 195.87±20.33＊＊84.92±19.05##86.79±23.01##81.46±24.46##124.52±30.61##

3.2 肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀，肝細(xì)胞正常。模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂辨別不清，肝細(xì)胞嗜酸性壞死，在匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞促生小脂肪滴（圖中箭頭所示）。各給藥組小鼠肝組織病理改變均不同程度好轉(zhuǎn)，其中SALD中劑量組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞壞死少見(jiàn)，偶見(jiàn)油滴出現(xiàn)。各組小鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.3 肝組織中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1和GCLC蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中Nrf2（細(xì)胞核內(nèi)）、Keap1（細(xì)胞核內(nèi)）、HO-1（細(xì)胞質(zhì)中）、GCLC（細(xì)胞質(zhì)中）蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，除陽(yáng)性組小鼠肝組織中Nrf2（細(xì)胞核內(nèi)）、Keap1（細(xì)胞核內(nèi)）蛋白表達(dá)水平升高不顯著外，其余各組小鼠的其余各蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組小鼠肝組織中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1和GCLC蛋白表達(dá)測(cè)定的電泳圖見(jiàn)圖2，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果（HE染色，×100）Fig 1 Pathohistological observation of liver tissue of mice in each group（HE staining，×100）

圖2 各組小鼠肝組織中Keap1-Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定的電泳圖Fig 2 Electrophorograms of determination of Keap1-Nrf2 signal pathway related protein in liver tissue of mice in each group

表2 各組小鼠肝組織中Keap1-Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝4）Tab 2 Determination results of Keap1-Nrf2 signal pathway related protein expression level in liver tissue of mice in each group（±s，n＝4）

表2 各組小鼠肝組織中Keap1-Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝4）Tab 2 Determination results of Keap1-Nrf2 signal pathway related protein expression level in liver tissue of mice in each group（±s，n＝4）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組陽(yáng)性組SALD低劑量組SALD中劑量組SALD高劑量組GCLC/β-actin 0.460±0.047 0.234±0.038＊0.497±0.069#0.500±0.065#0.601±0.050##0.500±0.063#Nrf2/PCAN 0.509±0.101 0.363±0.037＊0.362±0.045 0.609±0.039##0.513±0.032#0.562±0.033#Keap1/PCAN 0.530±0.019 0.314±0.037＊0.379±0.029 0.740±0.021##0.707±0.034##0.530±0.030#HO-1/β-actin 0.412±0.059 0.155±0.038＊0.541±0.041#0.770±0.029#1.150±0.021##0.869±0.027#NQO1/β-actin 0.776±0.091 0.772±0.079 1.269±0.093#1.645±0.121##1.162±0.084#1.112±0.087#

4 討論

APAP是臨床應(yīng)用廣泛的乙酰苯胺類解熱鎮(zhèn)痛藥物，是引發(fā)藥物性肝損傷的常見(jiàn)藥物[10]。20世紀(jì)初期APAP開(kāi)始得到普遍應(yīng)用，過(guò)量或者同時(shí)服用2～3種含有該成分的藥品易發(fā)生一系列不良反應(yīng)，其中最不容忽視的就是其對(duì)肝的損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)肝衰竭甚至危及生命[11-12]。因此，APAP誘發(fā)的肝毒性已成為研究藥物所致肝疾病的必要內(nèi)容。

APAP的中毒主要表現(xiàn)為肝小葉中央型肝實(shí)質(zhì)壞死和細(xì)胞網(wǎng)架的塌陷。臨床上，肝壞死表現(xiàn)在中毒后幾小時(shí)比較明顯，伴有AST、ALT、ALP和LDH的大幅度升高[12]，這些指標(biāo)反應(yīng)了肝組織壞死的程度。APAP中毒后可以采取催吐洗胃和導(dǎo)瀉等措施。此外，還可以服用活性炭，吸附腸道內(nèi)APAP，減少其吸收。而臨床最常用的解毒劑是NAC，其可通過(guò)維持肝組織中谷胱甘肽濃度，阻止大分子硫醇基團(tuán)被氧化進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)作用，故本研究以其為陽(yáng)性對(duì)照藥。

SALD是紅景天中最主要的有效成分之一，通常將其含量作為評(píng)價(jià)紅景天藥用價(jià)值的重要指標(biāo)[13]。SALD具有抗缺氧、清除自由基和抗氧化等作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，SALD可以逆轉(zhuǎn)APAP引起的小鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH含量的增加。組織病理結(jié)果提示，SALD還可以改善肝細(xì)胞壞死的情況，但SALD高劑量組效果不如中劑量組。有研究報(bào)道[15-16]，SALD對(duì)免疫系統(tǒng)具有激活作用。因此筆者推測(cè)，高劑量的SALD可能誘發(fā)了炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抵消了其保護(hù)作用，但其具體原因還需進(jìn)一步的研究進(jìn)行驗(yàn)證。

Nrf2是Keap1-Nrf2信號(hào)通路中的一個(gè)重要因子，其通過(guò)與細(xì)胞核內(nèi)的抗氧化反應(yīng)原件（ARE）結(jié)合，上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)以抵抗自由基的氧化作用[17]。生理?xiàng)l件下，Nrf2被Keap1偶聯(lián)，隔離于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；外來(lái)刺激下，Nrf2被激活，從Nrf2-Keap1二聚體釋放轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，繼而通過(guò)與ARE結(jié)合啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，發(fā)揮其抗氧化作用[18]。本研究結(jié)果顯示，APAP損傷小鼠肝組織中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1和GCLC蛋白表達(dá)水平均不同程度降低，而SALD可顯著升高上述蛋白的表達(dá)。而Nrf2入核后，可與ARE結(jié)合啟動(dòng)下游HO-1、NQO1、GCLC基因的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，SALD對(duì)APAP誘導(dǎo)肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)Nrf2和Keap1入核，增強(qiáng)肝組織中HO-1、NQO1和GCLC蛋白的表達(dá)有關(guān)，但其確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1]賴榮陶，謝青.對(duì)乙酰氨基酚所致肝損傷的臨床診治新進(jìn)展[J].肝臟，2011，16（2）：159-161.

[2]PETER G，SHAHEER R，NARAYANAN P，et al.Hepatic artery aneurysm：a rare case of obstructive jaundice with severe hemobilia[J].Ann Gastroenterol，2014，27（3）：288-289.

[3]XIN KY，YEE LS，YONG TT，et al.Obstructive jaundice due to intraductal tumour throbus in recurrent hepatocellular carcinoma：what is the optimal therapeutic approach？ [J].Hepatogastroenterology，2014，61（135）：1863-1866.

[4]戴博，宋妍，王占一，等.高山紅景天對(duì)對(duì)乙酰氨基酚所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（6）：1305-1306.

[5]XUEPING C，CHUNYUAN G，KONG J.Oxidative stress in neurodegenerative disease[J].Neural Regeneration Research，2012，7（5）：376-385.

[6]GAO Y，CHU SF，XIA CY，et al.Rg1 attenuates alcoholic hepatic damage through regulating AMPK and Nrf2 signal pathways[J].J Asian Nat Prod Res，2016，18（8）：765-778.

[7]張立超，王晨宇，曹慧芳，等.紅景天苷對(duì)梗阻性黃疸大鼠的肝保護(hù)作用及機(jī)制探討[J].山東醫(yī)藥，2015，55（46）：32-33.

[8]王曉東，劉永剛，蘇薇薇.紅景天苷對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用[J].中藥材，2004，27（3）：198-199.

[9]張奕，劉永剛.紅景天苷抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥房，2007，18（11）：813-815.

[10]LIN Z，WU F，LIN S，et al.Adiponectin protects against acetaminophen-induced mitochondrial dysfunction and acute liver injury by promoting autophagy in mice[J].J Hepatol，2014，61（4）：825-831.

[11]BERNAL W，WENDON J.Acute liver failure[J].N Engl J Med，2013，369（26）：2525-2534.

[12]GUM SI，CHO MK.Korean red gindeng extract prevents APAP-induced hepatotoxicity through metabolic enzyme regulation：the role of ginsenoside Rg3，a protopanaxadiol[J].Liver Int，2013，33（7）：1071-1084.

[13]董禮.柴胡紅景天化學(xué)成分的研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（12）：2564-2567.

[14]關(guān)鑫.紅景天的臨床功效與藥理作用研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7（32）：14-16.

[15]GUAN S，HE J，GUO W，et al.Adjuvant effects of salidroside from Rhodiola rosea L.on the immune responses to ovalbumin in mice[J].Immunopharmacol Immunotoxicol，2011，33（4）：738-743.

[16]LI HX，SZE SC，TONG Y，et al.Production of Th1-and Th2-dependent cytokines induced by the Chinese medicine herb，Rhodiola algida，on human peripheral blood monocytes[J].J Ethnopharmacol，2009，123（2）：257-266.

[17]XUE H，XIE W，JIANG Z，et al.3，4-Dihydroxyphenylacetic acid，a microbiota-derived metabolite of quercetin，attenuates acetaminophen（APAP）-induced liver injury through activation of Nrf-2[J].Xenobiotica，2016，46（10）：931-939.

[18]TRUSHINA E，MCMURRAY CT.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases[J].Neuroscience，2007，145（4）：1233-1248.