4種功能紅曲相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中洛伐他汀含量測定方法的比較

李志強，劉 穎，林 風(fēng)，吳麗云*

（福建省微生物研究所 福建省新藥（微生物）篩選重點實驗室，福建 福州 350007）

紅曲是用紅曲菌（Monascussp.）發(fā)酵米飯制成的一種紫紅色曲米，在我國已有超過1 000年的歷史，被廣泛應(yīng)用于食品著色，醋、酒釀造，生物催化及傳統(tǒng)中醫(yī)藥等領(lǐng)域，是極為珍貴的藥食兩用原料，具有極高的開發(fā)價值。福建省古田縣為紅曲發(fā)源地，該地所產(chǎn)紅曲最為著名[1]。紅曲產(chǎn)品種類多樣，其中以大米為原料，用純培養(yǎng)的紅曲菌發(fā)酵生成的含發(fā)酵自然產(chǎn)生的莫納可林K（又稱洛伐他汀）等生物活性物質(zhì)的紅曲為功能紅曲[2]。20世紀(jì)70年代末，ENDO A[3]從紅曲產(chǎn)物中分離到莫納可林K，該物質(zhì)與土曲霉（Aspergillus terreus）產(chǎn)的洛伐他汀（lovastatin，又稱為mevinolin）為同一物質(zhì)[4]，是目前臨床上廣泛應(yīng)用的降膽固醇藥物之一，用于治療高血脂。洛伐他汀是紅曲菌所產(chǎn)生的聚酮類化合物之一[5]，其通過抑制膽固醇合成關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶的活性來阻斷膽固醇的從頭合成[4，6]。最近20多年的研究發(fā)現(xiàn)，紅曲菌在代謝中除了可產(chǎn)生洛伐他汀以外，還可產(chǎn)生色素、γ-氨基丁酸、麥角甾醇、多不飽和脂肪酸、黃酮、多酚等多種生物活性物質(zhì)，具有降血脂、降血壓、降血糖、抑菌、抗癌和提高免疫力等多種功效[7-10]。

功能紅曲是通過固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的，除烘干外并未經(jīng)過其他復(fù)雜的后續(xù)處理步驟，可直接服用，存在酸式和內(nèi)酯式兩種構(gòu)型的洛伐他汀。內(nèi)酯式洛伐他汀作為前體藥物，需在人體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)樗崾铰宸ニ〔拍鼙晃詹l(fā)揮作用[4]。在肝臟中，內(nèi)酯式洛伐他汀在細(xì)胞色素P450 3A4酶的作用下被水解成酸式洛伐他汀[11]。研究表明，酸式構(gòu)型的洛伐他汀功效是內(nèi)酯式構(gòu)型的2倍[6]，但前者的穩(wěn)定性不如后者。內(nèi)酯式洛伐他汀的不良藥物反應(yīng)包括肌病和肝功能異常[12]，如果不給予治療會產(chǎn)生嚴(yán)重問題。因此，酸式洛伐他汀的比例應(yīng)是衡量功能紅曲安全性能和產(chǎn)品質(zhì)量的指標(biāo)之一。我國功能紅曲產(chǎn)品及其現(xiàn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)見表1。4種標(biāo)準(zhǔn)均規(guī)定了洛伐他汀的含量，但只有《浙江省中藥炮制規(guī)范》2015年版中規(guī)定了酸式洛伐他汀的比例。

表1 我國功能紅曲產(chǎn)品及其相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Functional red koji products and related standards in China

高效液相色譜法具有高準(zhǔn)確度、高靈敏度的優(yōu)點，是功能紅曲標(biāo)準(zhǔn)中洛伐他汀含量測定最常用的方法。依據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)，萃取溶劑種類有可能不同，在溶劑種類相同的情況下溶劑的濃度、萃取時間、高效液相色譜所采用的流動相均可能存在差異，因此這些標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的洛伐他汀含量測定的方法并不完全相同。顯然，按照這些標(biāo)準(zhǔn)檢測同一個產(chǎn)品的洛伐他汀含量，可能會得到不同的數(shù)據(jù)，但這些數(shù)據(jù)之間的差異到底有多大并沒有相關(guān)報道。本研究選取5份功能紅曲，分別按照我國現(xiàn)行的4個功能紅曲標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行洛伐他汀含量和酸式洛伐他汀比例的測定，比較4種檢測方法之間的差異，以期為功能紅曲產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供更好的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

功能紅曲樣品：自制，由本研究所“古田紅曲生產(chǎn)菌種庫”的優(yōu)良紅曲菌接種于米飯后經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制成，固態(tài)發(fā)酵條件參照文獻(xiàn)[16]。

洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品（批號100600-201003，含量為99.4%）：中國食品藥品檢定研究院；甲醇和乙腈（色譜純）：德國Merck公司；磷酸（色譜純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其他試劑均為分析純，超純水用Milli-Q制備。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀：美國Agilent公司；XA105型電子分析天平（雙量程，d=0.01mg/0.1mg）和pH計（FE20）：梅特勒-托利多公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 功能紅曲樣品預(yù)處理

將固態(tài)發(fā)酵后經(jīng)過60℃干燥24 h的紅曲米粉碎（60目，粉狀）并充分混合均勻。分別按QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》（以下簡稱方法1）[2]、《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》2015年版（以下簡稱方法2）[13]、《浙江省中藥炮制規(guī)范》2015年版（以下簡稱方法3）[14]和《中國藥典》2015年版（以下簡稱方法4）[15]等標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定精密稱取相應(yīng)質(zhì)量的紅曲粉，并按規(guī)定方法提取紅曲粉中的洛伐他汀。進(jìn)行高效液相色譜分析之前，所有樣品均經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜過濾。每個樣品進(jìn)行3次平行測定。

1.3.2 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品4份，每份10 mg，分別用4種方法中規(guī)定的溶劑溶解并定容至10 mL，作為儲備液，于-20℃避光保存，臨用前進(jìn)行系列稀釋。

定性用酸式洛伐他汀的制備參照QB/T2847—2007《功能性紅曲米（粉）》[2]，略作改動。精密稱取內(nèi)酯式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品4 mg，以少量乙腈溶解后用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液超聲轉(zhuǎn)化60 min，放置到室溫后定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，待用。

1.3.3 高效液相色譜條件

色譜柱：反相C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫：28℃（方法1中的柱溫為25℃）；檢測波長：238 nm；檢測器：二極管陣列檢測器；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：1 mL/min。根據(jù)保留時間定性化合物，使用外標(biāo)法根據(jù)峰面積定量。

方法1的流動相為甲醇-水-磷酸（385∶115∶0.14），方法2和方法3的流動相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（55∶5∶40），方法4的流動相為甲醇-水（75∶25）。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)4種方法，分別用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇、體積分?jǐn)?shù)75%的丙酮、乙腈和甲醇稀釋1.3.2中配制的內(nèi)酯式洛伐他汀儲備液至質(zhì)量濃度分別為1μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、75 μg/mL、150 μg/mL、300 μg/mL的洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.3.3的條件進(jìn)行高效液相色譜分析，以洛伐他汀的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）作圖，進(jìn)樣線性回歸分析。相關(guān)系數(shù)R2＞0.999時，進(jìn)行后續(xù)樣品測定。

1.3.5 加標(biāo)回收實驗

為了研究4種方法中不同的提取條件對樣品提取的效果，另取自制同一批紅曲粉，精密稱量，按低、中、高濃度分別加入400 μg、800 μg、1 600 μg的內(nèi)酯式洛伐他汀，按1.3.1的方法進(jìn)行樣品的預(yù)處理后，按1.3.3的高效液相色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

功能紅曲樣品中洛伐他汀總含量為酸式和內(nèi)酯式洛伐他汀含量之和。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（standarddeviation，SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和加標(biāo)回收實驗

4種方法的回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)（R2）和線性范圍見表2，4種方法的內(nèi)酯式洛伐他汀加標(biāo)回收率實驗結(jié)果見表3。

表2 洛伐他汀的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及洛伐他汀兩種構(gòu)型的保留時間和線性范圍Table 2 Linear regression equation and correlation coefficient of lovastatin and retention time and linear range of two configurations of lovastatin

由表2可知，內(nèi)酯式洛伐他汀在1～300 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。酸式洛伐他汀在除方法4外的其他3種方法中保留時間均穩(wěn)定，在方法1中的保留時間最長；而內(nèi)酯式洛伐他汀在4種方法中的保留時間均穩(wěn)定，在方法2中的保留時間最長。酸式和內(nèi)酯式洛伐他汀在方法2和方法3中的保留時間分別接近，兩者保留時間之差值＞5min。

表3 4種方法的內(nèi)酯式洛伐他汀加標(biāo)回收率實驗結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rates experiments of lactone forms of lovastatin of four methods

由表3可知，4種方法的平均加標(biāo)回收率均＞99%，表明4種方法的檢測準(zhǔn)確度較高。

2.2 《中國藥典》2015年版洛伐他汀含量測定方法存在的問題

通過實驗發(fā)現(xiàn)，《中國藥典》2015年版規(guī)定的高效液相色譜方法測定酸式洛伐他汀含量時存在兩個問題：（1）峰形不對稱，變形嚴(yán)重；（2）保留時間漂移幅度很大，導(dǎo)致酸式洛伐他汀和樣品中其他成分的峰有可能沒有完全分開，這會直接影響到酸式洛伐他汀檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。由圖1（B）可知，5個樣品的酸式洛伐他汀保留時間的變動已經(jīng)超出正常范圍，而內(nèi)酯式洛伐他汀的保留時間正常、峰形對稱。作者曾嘗試過更換多種品牌和型號的色譜柱，但并不能穩(wěn)定酸式洛伐他汀的保留時間，改善其峰形。因此在方法4中只給出了內(nèi)酯式洛伐他汀含量，其他數(shù)據(jù)并沒有提供。

圖1 酸式洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品(A)和5個樣品(B)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of acid forms of lovastatin standard(A)and five samples(B)

2.3 4種方法的檢測結(jié)果

1號樣品采用4種方法的高效液相色譜圖見圖2（其他4個樣品的高效液相色譜圖與1號樣品類似，因此未予列出）。由圖2可知，在方法1、方法2和方法3中酸式洛伐他汀和內(nèi)酯式洛伐他汀與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5，能滿足樣品檢測的要求。酸式洛伐他汀和內(nèi)酯式洛伐他汀均能在20 min內(nèi)出峰，所用的分析時間較短，能滿足樣品快速分析的要求。方法1所采用的流動相使酸式洛伐他汀和內(nèi)酯式洛伐他汀的色譜峰相鄰，但能完全分開（分離度＞1.5）；方法2和方法3所采用的流動相使酸式洛伐他汀和內(nèi)酯式洛伐他汀的色譜峰相距較遠(yuǎn)，分離度較高。

5個紅曲樣品分別采用4種方法進(jìn)行洛伐他汀兩種構(gòu)型的含量及比例的測定，結(jié)果見表4。由表4可知，5個樣品洛伐他汀總含量測定值的范圍為2.45～15.55 mg/g，酸式洛伐他汀比例的測定值范圍為47.53%～86.43%。同一個樣品洛伐他汀總含量根據(jù)所采用的方法不同會有較大差異，但5個樣品洛伐他汀總含量的測定值均表現(xiàn)出相同的趨勢，方法2＞方法3＞方法1（表4和表5）。同一份樣品采用不同方法測定的酸式洛伐他汀的比例較接近，如樣品1中酸式洛伐他汀的比例分別為64.91%（方法1）、66.33%（方法2）、66.87%（方法3）。

圖2 不同方法測定1號樣品中的洛伐他汀高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of lovastatin contents in sample 1 by different methods

表4 5個紅曲樣品的洛伐他汀總含量和酸式洛伐他汀的比例（n=3）Table 4 Total lovastatin contents and the proportions of acid forms of lovastatin of five samples（n=3）

表5 不同方法測定的5個紅曲樣品中洛伐他汀總含量的相對比例Table 5 Relative proportions of total lovastatin contents of five red kojic samples with different methods

分別以方法2測定的5個樣品的洛伐他汀總含量為參考值，計算方法1和3測定的樣品中洛伐他汀總含量相對于方法2測定結(jié)果的相對比例，結(jié)果見表5。由表5可知，同一樣品采用不同方法測定的結(jié)果有差異，其中測得洛伐他汀總含量為方法2＞方法3＞方法1。

3 結(jié)論

用《中國藥典》2015年版中的高效液相色譜方法進(jìn)行洛伐他汀含量測定時，其酸式構(gòu)型保留時間異常、峰形不對稱，導(dǎo)致其含量測定結(jié)果不準(zhǔn)確，重復(fù)性不好；而內(nèi)酯式構(gòu)型的含量測定則不存在以上問題。

方法1中酸式和內(nèi)酯式洛伐他汀的出峰時間均避免了溶劑和雜質(zhì)峰的干擾，但兩者的出峰時間很近。在實際樣品檢測中，由于功能紅曲樣品成分多樣、系統(tǒng)輕微波動等因素的影響，可能會使色譜峰發(fā)生拖尾或前沿現(xiàn)象，兩峰有可能無法完全分開。而方法2和方法3中內(nèi)酯式洛伐他汀的出峰時間得到明顯延長，從而與酸式洛伐他汀得到很好的分離，兩者的出峰時間同樣避免了溶劑和雜質(zhì)峰的干擾。

采用不同的方法（主要是洛伐他汀的提取條件和高效液相色譜條件），對同一份樣品的檢測結(jié)果有較大差異，采用方法2測定的洛伐他汀總含量最高。同一份樣品，采用3個標(biāo)準(zhǔn)測定的酸式洛伐他汀的比例很接近。從樣品提取方法來看，方法1、方法2和方法3中的樣品提取簡便快捷，而方法4中樣品提取相對復(fù)雜繁瑣，可能會導(dǎo)致提取效率偏低。由于溶劑不可能從紅曲粉中把洛伐他汀萃取完全，4種方法洛伐他汀含量測定值之間的差異可能主要是受萃取溶劑提取效率的影響，有可能方法2提取率相對最高。綜合以上分析，在4種方法中《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》2015年版相對最好，但其他方法也不能完全否認(rèn)。功能紅曲中的洛伐他汀同時具有酸式和內(nèi)酯式兩種構(gòu)型，建議未規(guī)定酸式洛伐他汀比例的標(biāo)準(zhǔn)可在今后的標(biāo)準(zhǔn)修訂中對酸式洛伐他汀比例的檢測進(jìn)行規(guī)定。

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