運(yùn)動(dòng)對肥胖大鼠胰島素抵抗的影響*

劉世強(qiáng)，張 勇，完建永，孫慶艷，華田苗

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蕪湖241000）

肥胖尤其是向心性肥胖是形成胰島素抵抗的主要原因，胰島素抵抗是2型糖尿病等多種代謝疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，90%以上的肥胖患者出現(xiàn)不同程度的胰島素抵抗。據(jù)WHO報(bào)道，預(yù)計(jì)到2025年全世界約有3億人患2型糖尿?。?］。半乳凝素-3（galectin-3，Gal-3）是連接炎癥與胰島素抵抗之間的關(guān)鍵物質(zhì)，研究表明Gal-3與胰島素受體結(jié)合而抑制其下游信號通路。運(yùn)動(dòng)能改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，但其機(jī)制尚不清楚。本研究以高脂膳食飼養(yǎng)大鼠，構(gòu)建肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型。對胰島素抵抗大鼠進(jìn)行急、慢性運(yùn)動(dòng)干預(yù)，觀察運(yùn)動(dòng)干預(yù)對大鼠葡萄糖-胰島素指數(shù)及血液中Gal-3含量的影響，為進(jìn)一步研究運(yùn)動(dòng)改善胰島素抵抗的分子機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7周齡的清潔級健康SD雄性大鼠100只（購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，稱量體重（250.3±24.2）g。飼養(yǎng)條件為：自由飲食、飲水，溫度26～28℃，相對濕度（55±4）%，明暗周期12 h：12 h，每周定時(shí)稱量體重并記錄大鼠的生長狀況。

1.2 胰島素抵抗大鼠模型的建立

大鼠隨機(jī)分為普通膳食安靜組（control，CON組，n＝10），喂食普通飼料；高脂膳食組（high fat diet，HFD組，n＝90），喂食高脂飼料。高脂飼料系在普通飼料的基礎(chǔ)上添加16.9%豬油、14%糖、10.2%酪蛋白、2.2%麥芽糊精、2.1%鹽、微量元素和維生素等。飼料由南京市江寧區(qū)龍泉飼料經(jīng)營部提供。HFD組大鼠在喂食8周后，選取其體重上游1／3的大鼠（n＝30）作為膳食誘導(dǎo)肥胖大鼠進(jìn)行后續(xù)研究；下游1／3的大鼠為肥胖抵抗大鼠，棄之不用；中間1／3的大鼠亦棄之不用。CON組和HFD組大鼠進(jìn)行第一次口服糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素釋放實(shí)驗(yàn)，根據(jù)葡萄糖-胰島素指數(shù)判定胰島素抵抗模型的建立，如表1所示。

Tab.1 Body weight and glucose-insulin index when building the model of insulin resistance rats（，n＝10）

Tab.1 Body weight and glucose-insulin index when building the model of insulin resistance rats（，n＝10）

CON：Control；HFD：High-fat diet**P＜0.01 vs control group

Group Weight（g） AUCg×AUCi（×108）CON 513.6±22.1 4.08±1.09 HFD 603.6±32.1** 8.59±1.25**

1.3 胰島素抵抗大鼠的運(yùn)動(dòng)干預(yù)

將建模成功的HFD組30只大鼠隨機(jī)分為3組（n＝10）：（1）高脂膳食安靜組（HFD-sedentary，HFD-SED）：高脂飼料喂養(yǎng)，安靜不運(yùn)動(dòng)；（2）高脂膳食慢性運(yùn)動(dòng)組（HFD-chronic exercise，HFD-CE）：高脂飼料喂養(yǎng)，并進(jìn)行每天1 h、每周5次的負(fù)重5%體重的游泳運(yùn)動(dòng)；（3）高脂膳食急性運(yùn)動(dòng)組（HFD-acute exercise，HFD-AE）。HFD組繼續(xù)高脂膳食喂養(yǎng)8周，CON組繼續(xù)喂食普通飼料8周，安靜不運(yùn)動(dòng)。8周后，HFD-AE組先進(jìn)行3 h的急性游泳運(yùn)動(dòng)，休息45min，再運(yùn)動(dòng)3 h。

1.4 口服糖耐量和胰島素釋放實(shí)驗(yàn)

運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后，各組進(jìn)行第二次口服糖耐量和胰島素釋放實(shí)驗(yàn)。大鼠空腹12 h，眼眶后靜脈叢取血，以羅氏血糖儀和試紙測定即時(shí)空腹血糖，同時(shí)留取空腹血液0.5 ml。用50%的葡萄糖（2 g／kg體重）灌胃，于糖負(fù)荷后 15、30、90、120 min測定血糖值，并保存每一時(shí)間點(diǎn)的血液0.5 ml。將留取的血液室溫靜置10～20 min，3 000 r／min離心 5 min，分離血清，-20℃保存。繪制葡萄糖曲線，各點(diǎn)的血糖值與時(shí)間的乘積為葡萄糖曲線下面積（area under the curve of glucose，AUCg）。以武漢華美CUSABIO公司提供的大鼠胰島素（Ins）ELISA試劑盒，測定各時(shí)間點(diǎn)的血清胰島素值并繪制胰島素曲線，各點(diǎn)的胰島素值與時(shí)間的乘積為胰島素曲線下面積（area under the curve of insulin，AUCi）。計(jì)算葡萄糖-胰島素指數(shù)（glucose-insulin index）：AUCg×AUCi。

1.5 血樣采集

在急性運(yùn)動(dòng)結(jié)束16 h（含空腹12 h）以及慢性運(yùn)動(dòng)結(jié)束48 h（含空腹 12 h）后，以 10%水合氯醛（400mg／kg體重）麻醉大鼠，腹腔靜脈取血，用于測定Gal-3含量。

1.6 Gal-3的測定

采用 Sigma公司提供的大鼠 Gal-3 ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）試劑盒，測定大鼠血液中Gal-3含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析，多組間差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）中的LSD進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)干預(yù)后各組大鼠體重和葡萄糖-胰島素指數(shù)的變化

如表2所示：HFD-SED組大鼠體重大于CON組，差異顯著（P＜0.01）；HFD-CE組明顯小于 HFD-SED組（P＜0.01），與對照組無明顯差異；HFD-AE組大于CON組，差異顯著（P＜0.01），而與HFD-SED組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HFD-SED組大鼠葡萄糖-胰島素指數(shù)大于CON組，差異顯著（P＜0.01），HFDCE組明顯小于HFD-SED組（P＜0.01），與 CON組無明顯差異；HFD-AE組小于 HFD-SED組，差異顯著（P＜0.01），但仍明顯大于 CON組（P＜0.05）。

Tab.2 Effects of chronic and acute exercise on body weight and glucose-insulin index of rats

2.2 運(yùn)動(dòng)干預(yù)對Gal-3含量的影響

如圖1所示：HFD-SED組大鼠血清Gal-3含量為（2.74±0.52）ng／ml，明顯高于 CON組（1.10±0.18）ng／ml（P＜0.01），HFD-CE組和HFD-AE組大鼠血清Gal-3含量分別為（1.42±0.73）ng／ml和（1.12±0.29）ng／ml，明顯低于 HFD-SED組（P＜0.01），與 CON組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.1 Effectsof chronic and acute exercise on expression ofGal-3（，n＝10）

3 討論

高脂膳食飼養(yǎng)可建立肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗動(dòng)物模型。在胰島素抵抗動(dòng)物模型中，血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）等顯著升高［2］。通常大鼠在高脂膳食飼養(yǎng)2～3周后，其肌肉組織就會產(chǎn)生胰島素抵抗［3］。本研究參照Lauterio等［4］的方法，以高脂飼料喂養(yǎng)大鼠8周，選取體重上游1／3的大鼠作為肥胖大鼠，其體重顯著大于CON組，說明建立了肥胖模型。葡萄糖-胰島素指數(shù)為葡萄糖曲線下面積和胰島素曲線下面積的乘積，數(shù)值越大表明胰島素抵抗程度越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HFD組大鼠的葡萄糖-胰島素指數(shù)顯著大于CON組，表明成功建立了肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型。

運(yùn)動(dòng)能夠提高機(jī)體的糖、脂代謝水平，提高機(jī)體的胰島素敏感性，預(yù)防胰島素抵抗的發(fā)生［5］。慢性運(yùn)動(dòng)和急性運(yùn)動(dòng)對胰島素抵抗都有干預(yù)效應(yīng)。研究表明，慢性和急性運(yùn)動(dòng)均能作用于胰島素的信號通路，降低胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）、c-Jun氨基末端激酶 （c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）的磷酸化表達(dá)，降低大鼠血液中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量［6，7］。本實(shí)驗(yàn)中，8周的慢性游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)顯著降低胰島素抵抗大鼠的體重和葡萄糖-胰島素指數(shù)；6 h的急性運(yùn)動(dòng)雖然對大鼠體重?zé)o明顯影響，但顯著降低葡萄糖-胰島素指數(shù)。

半乳凝素-3又稱為巨噬細(xì)胞表面抗原-2（macrophage sur-face antigen-2，mac-2），是一種由巨噬細(xì)胞分泌的分子量約為30 kD的凝集素，其家族共有14種成員，主要參與細(xì)胞的生長、分化、粘附、炎癥、免疫應(yīng)答、凋亡、心血管疾病形成等過程，以及調(diào)節(jié)免疫T細(xì)胞功能。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，機(jī)體血液中Gal-3含量顯著上升。Yilmaz等［8］研究了前糖尿病患者、糖尿病病人和正常個(gè)體血液中的Gal-3含量，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者組中Gal-3含量最高，其次是前糖尿病組，而正常組最少。肥胖和胰島素抵抗是多囊性卵巢綜合征（PCOS）的主要形成原因，患PCOS女性血液中Gal-3含量顯著高于正常組，且Gal-3含量與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)［9］。給小鼠注射氯膦酸鹽（可特異性抑制巨噬細(xì)胞分泌Gal-3），發(fā)現(xiàn)其可抑制Gal-3的表達(dá)，可以顯著改善肥胖小鼠的胰島素敏感性［10］。

Gal-3是連接炎癥和糖尿病等疾病的一個(gè)關(guān)鍵性蛋白。在肥胖狀態(tài)下，機(jī)體炎性因子TNF-α增多會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞分泌Gal-3。一方面，Gal-3通過正反饋調(diào)節(jié)使巨噬細(xì)胞繼續(xù)分泌Gal-3；另一方面，Gal-3直接與胰島素受體結(jié)合，抑制胰島素受體活性，從而抑制胰島素信號通路下游的糖原合成酶激酶 3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體 4（glucose transporter 4，Glut-4）的表達(dá)［11］。運(yùn)動(dòng)可能對機(jī)體 Gal-3含量有干預(yù)效應(yīng)。Fernandes-silva等提出，運(yùn)動(dòng)能夠顯著增加心力衰竭患者的最大攝氧量（VO2max），同時(shí)Gal-3含量會降至平均值以下［12］。目前尚未見到在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，運(yùn)動(dòng)對Gal-3的干預(yù)效應(yīng)研究。本研究中，兩種運(yùn)動(dòng)結(jié)束后的取材時(shí)間不同，避免了運(yùn)動(dòng)后的急性效應(yīng)，結(jié)果慢性和急性運(yùn)動(dòng)組大鼠血液中Gal-3含量與CON組差異不顯著，且其Gal-3含量明顯低于HFD-SED組，說明急性和慢性游泳運(yùn)動(dòng)對胰島素抵抗大鼠的Gal-3含量均有干預(yù)作用?，F(xiàn)有研究表明，急性運(yùn)動(dòng)的干預(yù)作用維持時(shí)間較短，一般少于24 h，而慢性運(yùn)動(dòng)的干預(yù)作用時(shí)間可延長到72～120 h［13］，且急性運(yùn)動(dòng)對胰島素抵抗大鼠的體重?zé)o明顯減低作用。

綜合比較急、慢性運(yùn)動(dòng)的干預(yù)作用，慢性運(yùn)動(dòng)對肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗作用干預(yù)效果更好。所以建議臨床上采用長期的、規(guī)律的慢性有氧運(yùn)動(dòng)，對肥胖、胰島素抵抗等代謝疾病進(jìn)行干預(yù)。

［1］ Xu Y，Wang L，He J，et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults［J］.JAMA，2013，310（9）：948-959.

［2］ 李艷輝，衣雪潔.有氧運(yùn)動(dòng)對2型糖尿病大鼠骨骼肌ERK1／2活性的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2017，33（1）：33-37.

［3］ Castorena CM，Arias EB，Sharma N，etal.Postexercise improvement in insulin-stimulated glucose uptake occurs concomitant with greater AS160 phosphorylation in muscle from normal and insulin-resistant rats［J］.Diabetes，2014，63（7）：2297-2308.

［4］ Lauterio TJ，DaviesMJ，DeAngeloM，etal.Neuropeptide Y expression and endogenous leptin concentrations in a dietary model of obesity［J］.Obes Res，1999，7（5）：498-505.

［5］ 周慧敏，李博雅，朱 歡，等.健步走運(yùn)動(dòng)對中老年2型糖尿病患者的作用［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2015，31（3）：243-244，248.

［6］ Oliveira AG，Carvalho BM，Tobar N，et al.Physical exercise reduces circulating lipopolysaccharide and TLR4 activation and improves insulin signaling in tissues of DIO rats［J］.Diabetes，2011，60（3）：784-796.

［7］ 孫慶艷，李苗苗，李古州，等.運(yùn)動(dòng)和低脂膳食對胰島素抵抗大鼠腫瘤壞死因子α表達(dá)的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2014，30（2）：180-183.

［8］ Yilmaz H，Cakmak M，Inan O，et al.Increased levels of galectin-3 were associated with prediabetes and diabetes：new risk factor［J］？JEndocrinol Invest，2015，38（5）：527-533.

［9］ Yilmaz H，Celik HT，Ozdemir O，et al.Serum galectin-3 levels in women with PCOS［J］.J Endocrinol Invest，2014，37（2）：181-187.

［10］Li P，Liu S，Lu M，et al.Hematopoietic-derived galectin-3 causes cellular and systemic insulin resistance［J］.Cell，2016，167（4）：973-984.

［11］ Siwicki M，Engblom C，Pittet MJ.Gal3 links inflammation and insulin resistance［J］.Cell Metab，2016，24（5）：655-656.

［12］Fernandes-Silva MM，GuimaraesGV，Rigaud VO，etal.Inflammatory biomarkers and effectof exercise on functional capacity in patients with heart failure：Insights from a randomized clinical trial［J］.Eur J Prev Cardiol，2017，24（8）：808-817.

［13］LIoyd JW，Evans KA，Zerfass KM，et al.Effect of an acute bout of aerobic exercise on chemerin levels in obese adults［J］.DiabetesMetab Syndr，2016，10（1）：37-42.