持續(xù)與間歇重復(fù)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬BDNF基因表達(dá)的影響*

宋淑華，朱瀅桔，董秀娟，馬麗艷，王廷華，孫振武△

（1.云南師范大學(xué)體育學(xué)院 昆明650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，云南 昆明650500）

大量研究證實(shí)［1-2］，運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)大腦的學(xué)習(xí)記憶功能，而學(xué)習(xí)記憶能力與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)有關(guān)。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）作為重要的神經(jīng)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，可增強(qiáng)海馬神經(jīng)元突觸可塑性和長(zhǎng)時(shí)程效應(yīng)，增加CA1區(qū)［3］和DG區(qū)樹突數(shù)量，對(duì)缺血性腦損傷有保護(hù)作用［2］。研究顯示［4］，學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)與持續(xù)訓(xùn)練上調(diào)BDNF表達(dá)有關(guān)。目前，間歇訓(xùn)練對(duì)學(xué)習(xí)記憶影響的研究不多。2007年美國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)會(huì)和心臟學(xué)會(huì)在大量既往研究的基礎(chǔ)上發(fā)布最新的運(yùn)動(dòng)指南，指出每天進(jìn)行3次中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)，鍛煉效果比一次長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)要好。朱蔚莉［5］指出，間歇運(yùn)動(dòng)較持續(xù)運(yùn)動(dòng)能更好地改善心血管健康，提高運(yùn)動(dòng)效果，具有更高的實(shí)際價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察6周跑臺(tái)訓(xùn)練，比較持續(xù)訓(xùn)練與間歇訓(xùn)練對(duì)改善學(xué)習(xí)記憶能力及對(duì)海馬BDNF基因表達(dá)影響的差異，為采取更有效的運(yùn)動(dòng)方式維護(hù)健康提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD大鼠24只，體重180～200 g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，自然光照動(dòng)物房，室內(nèi)溫度（20±5）℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.2 動(dòng)物分組與運(yùn)動(dòng)方式

將大鼠隨機(jī)分為3組（n＝8）：空白對(duì)照組（sedentary control group，SC）、持續(xù)訓(xùn)練組（continuous training group，CT）和間歇訓(xùn)練組（interval training group，IT）?？瞻讓?duì)照組不運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)組適應(yīng)性訓(xùn)練7 d，第1天大鼠以坡度0°、跑臺(tái)速度10 m／min，進(jìn)行跑臺(tái)（ZH-PT型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）訓(xùn)練15min，第2～3天速度增加到18m／min，訓(xùn)練15 min；第4～6天跑臺(tái)速度增加到24 m／min，訓(xùn)練15 min；第7天休息。適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后，運(yùn)動(dòng)組按表1進(jìn)行6周跑臺(tái)訓(xùn)練。

Tab.1 Animal group and training program（n＝8）

1.3 水迷宮測(cè)試

Morris水迷宮為一直徑160 cm、高50 cm的圓形水池，水池內(nèi)壁涂為黑色，池內(nèi)水深31 cm，水溫（22±2）℃，光照恒定，無(wú)光線直射在水池內(nèi)。環(huán)繞池壁以4個(gè)等距點(diǎn)將水池均分為4個(gè)象限，在目標(biāo)象限中央放置一個(gè)直徑12 cm、高21 cm的圓形黑色站臺(tái)［6］。迷宮上方安置攝像機(jī)，同步記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。測(cè)試前一天，所有大鼠分別放入池中自由游泳5min，熟悉水環(huán)境。水迷宮測(cè)試包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，分別用于測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力。定位航行實(shí)驗(yàn)持續(xù)4 d，分別從Morris水迷宮各象限固定位置將大鼠頭部朝向池壁放入水池中，大鼠找到平臺(tái)并在平臺(tái)上穩(wěn)定5 s定為找到平臺(tái)，該次實(shí)驗(yàn)結(jié)束，否則繼續(xù)記錄軌跡。如果大鼠到60 s時(shí)還未找到平臺(tái)，潛伏期記錄為60 s，并由實(shí)驗(yàn)人員將大鼠引導(dǎo)到平臺(tái)休息10～30 s。實(shí)驗(yàn)第5天時(shí)撤除平臺(tái)，對(duì)各組大鼠進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)測(cè)試，時(shí)間為2 min，選擇在離靶象限（即黑色站臺(tái)所在象限）最遠(yuǎn)的象限放入大鼠，記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 樣品獲取

腹腔注射3.6%水合氯醛（1 ml／100 g體重）麻醉大鼠。剪開頭皮，打開顱骨取出全腦，從腦中分離出海馬并放入無(wú)菌EP管中，-80℃保存。

1.5 基因測(cè)試

提取海馬組織細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，QT-PCR檢測(cè)BDNFmRNA表達(dá)水平，實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的每一循環(huán)的系統(tǒng)熒光強(qiáng)度。引物序列見(jiàn)表2。

Tab.2Primer sequence

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，統(tǒng)計(jì)處理用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），并用LSD進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

表3顯示，與SC組相比，CT、IT組定位航行潛伏時(shí)間明顯縮短（P＜0.01，P＜0.01），CT與 IT兩個(gè)訓(xùn)練組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；CT組和IT組靶象限外周圍時(shí)間和路程數(shù)據(jù)均明顯短于 SC組（P＜0.05，P＜0.01），而 CT和 IT之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Tab.3 The spatial learning ability of the three groupsmeasured by Morriswatermaze test（，n＝8）

Tab.3 The spatial learning ability of the three groupsmeasured by Morriswatermaze test（，n＝8）

SC：Sedentary control group；CT：Continuous training group；IT：Interval training group*P＜0.05，**P＜0.01 vs SC group

Group Escape latency（s）Time spent around the target（s）Distance around the target（mm）SC 56.7±44.3 29.1±20.3 3410±1496 CT 21.2±8.3** 5.8±4.4* 1680±855*IT 13.7±3.5** 2.5±1.8** 519±240**

2.2 空間探索

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，撤除站臺(tái)后，各組大鼠入水后均積極搜索，表現(xiàn)出對(duì)原有站臺(tái)的記憶。與SC組相比，CT組和 IT組的站臺(tái)中心路程明顯增加（P＜0.05，P＜0.05），周圍路程明顯減少（P＜0.05，P＜0.05），兩個(gè)訓(xùn)練組 CT與 IT之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表4）；與SC組和CT組比較，IT組潛伏期與站臺(tái)周圍時(shí)間兩項(xiàng)指標(biāo)明顯縮短（P＜0.05），而SC和CT兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 海馬BDNFmRNA表達(dá)水平的變化

大鼠海馬BDNFmRNA表達(dá)的相對(duì)值為：SC組0.00068±0.00027、CT組 0.00070±0.00018、IT組 0.00235±0.0010，可見(jiàn)IT組大鼠海馬BDNFmRNA表達(dá)水平較SC組和CT組明顯升高（P＜0.05，表5），而CT組與SC組相比無(wú)明顯的變化。

Tab.4 Cognitive performance of the three groups evaluated by Morriswatermaze test（，n＝8）

Tab.4 Cognitive performance of the three groups evaluated by Morriswatermaze test（，n＝8）

SC：Sedentary control group；CT：Continuous training group；IT：Interval training group*P＜0.05 vs SC group；＃P＜0.05 vs CT group

Group Center distance（mm）Distance around the target（mm）Escape latency（s）Time spent in platform（s ）SC 11080±4506 12786±5334 120.0±3.5 60.0±25.2 CT 13608±5680* 10682±5210* 117.3±3.6 55.2±20.3 IT 15032±5893* 9638±5838* 82.6±22.3*＃ 41.3±10.4*＃

Tab.5The expression of BDNFmRNA of the three groups

3 討論

大量研究證實(shí)，各種形式的有規(guī)律的適宜運(yùn)動(dòng)如游泳［7］、跑臺(tái)［8］，均有改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用，實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)多以持續(xù)運(yùn)動(dòng)為主［8］，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投嘁詣?dòng)物居多［9，10，11］。韓國(guó)學(xué)者Koo JH等［1］對(duì)阿茲海默病模型大鼠施加持續(xù)跑臺(tái)訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)持續(xù)訓(xùn)練可以促進(jìn)大腦的學(xué)習(xí)記憶功能。Zsolt R等［12］觀察大鼠游泳訓(xùn)練9周后，其短時(shí)與長(zhǎng)時(shí)記憶能力均得到明顯提高，該結(jié)果與王澤軍等［2］研究結(jié)果基本一致。關(guān)于間歇訓(xùn)練的研究，其研究方案和目的則呈多樣化。王紅雨等［13］以24名肥胖大學(xué)生為研究對(duì)象，以80%～90%最大心率強(qiáng)度訓(xùn)練2min，50%最大心率強(qiáng)度進(jìn)行間歇調(diào)整，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化間歇訓(xùn)練改善心肺耐力的效果優(yōu)于持續(xù)訓(xùn)練。喬秀芳等［14］先以坡度 10°，26.8 m／min的跑速讓大鼠運(yùn)動(dòng) 1 min，后以坡度0°，5m／min的跑速休息3 min，每天連續(xù)重復(fù)20次的間歇方案研究骨骼肌、心肌和肝臟的自由基代謝。這種間歇方案實(shí)質(zhì)上是在高低運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度之間進(jìn)行變換，即在間歇期內(nèi)并不是完全停止運(yùn)動(dòng)而是從事低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)。謝順成等［15］采用將運(yùn)動(dòng)分3次，每次不低于10 min，每?jī)纱伍g隔30 min的運(yùn)動(dòng)方案，研究不同強(qiáng)度間歇跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)生長(zhǎng)期大鼠骨量、骨密度的影響。本研究方案設(shè)計(jì)與謝順成等的方案類似，運(yùn)動(dòng)應(yīng)激在打破與重建轉(zhuǎn)換中不斷增強(qiáng)，從而增加有利因素的產(chǎn)生。

Morris水迷宮是通過(guò)讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)在水中尋找隱藏平臺(tái)并通過(guò)分析其尋找平臺(tái)所用時(shí)間和所走路徑測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置覺(jué)和方向覺(jué)（空間定位）的學(xué)習(xí)記憶能力，進(jìn)而判斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物記憶功能好壞。本文大鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)6周的跑臺(tái)訓(xùn)練后，兩訓(xùn)練組大鼠對(duì)尋找平臺(tái)的記憶能力優(yōu)于安靜對(duì)照組。值得注意的是，與SC組及CT組相比，IT組潛伏期、站臺(tái)周圍時(shí)間均顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示IT組大鼠能經(jīng)過(guò)更短的搜索時(shí)間找到平臺(tái)，對(duì)平臺(tái)的搜索帶有一定的使命性和方向性，反映出經(jīng)過(guò)間歇跑臺(tái)訓(xùn)練的大鼠其記憶能力優(yōu)于持續(xù)訓(xùn)練組。

基因檢測(cè)表明，與SC組和CT組比較，IT組BDNFmRNA表達(dá)顯著增高，提示間歇訓(xùn)練提高學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制可能與海馬BDNF基因高表達(dá)有關(guān)。徐波［9］研究表明，8周遞增跑臺(tái)訓(xùn)練可增強(qiáng)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，與海馬BDNF基因表達(dá)增加有關(guān)。César RS［16］連續(xù)觀察 28 d跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)癲癇小鼠空間記憶和成熟BDNF表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)（癲癇+運(yùn)動(dòng)）組小鼠海馬的成熟BDNF表達(dá)較癲癇組顯著增加。Sartori CR［17］也證實(shí)，運(yùn)動(dòng)可使海馬BDNFmRNA的表達(dá)量增加。本研究與以上學(xué)者研究結(jié)果基本一致。綜上所述，間歇重復(fù)訓(xùn)練組的記憶能力優(yōu)于持續(xù)訓(xùn)練組，這可能與間歇重復(fù)運(yùn)動(dòng)較持續(xù)運(yùn)動(dòng)更有利于促進(jìn)海馬BDNF基因的高表達(dá)有關(guān)。

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