APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育、鑒定及評(píng)價(jià)*

譚 龍，李海強(qiáng)，李宜波，劉 偉，龐 偉，蔣與剛△

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津300050；2.天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，天津300070；3.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；4.煙臺(tái)高新技術(shù)開發(fā)區(qū)醫(yī)院，煙臺(tái)264006）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，以進(jìn)行性的記憶和行為障礙為主要臨床表現(xiàn)，與衰老顯著相關(guān)［1］。目前，用于AD研究的動(dòng)物模型主要有以衰老為基礎(chǔ)的動(dòng)物模型、各種因素誘發(fā)的動(dòng)物模型及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。自然衰老模型飼養(yǎng)周期及實(shí)驗(yàn)周期長，動(dòng)物病死率高；快速衰老模型壽命短，不適合長周期實(shí)驗(yàn)；人工誘發(fā)模型不能完全理想地呈現(xiàn)出AD的典型病理特征；而AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可從分子水平模擬AD的發(fā)病，可在較短時(shí)間內(nèi)獲得較多量的模型動(dòng)物［2］。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的AD模型，主要涉及β淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、早老素 1（presenilin，PS1）、早老素 2（presenilin，PS2）、載脂蛋白 E（apolipoprotein E，APOE）、tau蛋白等基因［2，3］，通過轉(zhuǎn)入不同的基因，模型動(dòng)物可以穩(wěn)定地表現(xiàn)出不同的典型特征。研究表明，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能相對(duì)較好地模擬 AD的病理學(xué)變化［4］。

本研究擬對(duì)APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行繁育擴(kuò)種，以獲得滿足實(shí)驗(yàn)需要的動(dòng)物數(shù)量，并通過對(duì)小鼠腦組織病理學(xué)觀察和學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)，評(píng)價(jià)該模型模擬AD的效果，為該模型的應(yīng)用和推廣提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院營養(yǎng)科學(xué)研究所王福弟教授饋贈(zèng)的2對(duì)APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.2 主要試劑、儀器

引物購自上海生工生物有限公司，血液／細(xì)胞／組織基因組 DNA提取試劑盒、ddH2O、2×Taq PCR Masuer Mix、Marker I、6×Loading Buffer、EB、瓊脂糖、5×TBE緩沖液等均購自天根生化科技有限公司。PCR儀（美國 Bio-Rad公司），電泳儀（美國 Bio-Rad公司），WD-9403F紫外分析儀（北京市六一儀器廠），Morris水迷宮（上海欣軟信息科技有限公司），Olympus-BX40生物顯微鏡，HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)（武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司）。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)與繁育

繁育采用雄鼠與雌鼠1∶1合籠配對(duì)的方式。母鼠妊娠期約為20 d左右，小鼠出生20 d后根據(jù)其性別分籠飼養(yǎng)。

1.4 基因型鑒定

新生小鼠飼養(yǎng)至1月齡時(shí)剪尾進(jìn)行基因鑒定。

1.5 DNA提取及定量

鼠尾消毒后，剪下2 mm長尾尖組織，使用DNA提取試劑盒提取DNA。在12μl提取的DNA樣品中加入108μl ddH2O（即稀釋10倍），然后分別測(cè)定260 nm和280 nm處的吸光度，260 nm處吸光度值為1時(shí)其濃度約為50μg／ml雙鏈DNA。

1.6 PCR反應(yīng)

引物序列如下：上游引物序列：5’-AGGACTGACCACTCGACCAG-3’，下 游 引 物 序 列：5’-CGGGGGTCTAGTTCTGCAT-3’，產(chǎn)物大小約 360 bp。采用Mix體系，反應(yīng)體系25μl。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 3 min，94℃變性 15 s，55℃退火 30 s，72℃延伸45 s，10個(gè)循環(huán)。94℃變性 15 s，55℃退火 30 s，72℃延伸45 s，25個(gè)循環(huán)。72℃延伸10min，10℃保溫。

1.7 PCR產(chǎn)物電泳

PCR產(chǎn)物作1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至距凝膠下端1／3處時(shí)停止電泳，紫外分析儀拍片分析，目的基因長度為360 bp。

1.8 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

根據(jù)基因型鑒定結(jié)果，將攜帶目的基因的小鼠分入模型（AD）組，未攜帶目的基因的同批小鼠分入對(duì)照（CT）組。按照參考文獻(xiàn)［5］方法稍作調(diào)整，小鼠7月齡時(shí)，各組隨機(jī)選擇8只小鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，小鼠尋找平臺(tái)時(shí)間為90 s，如果90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引至平臺(tái)并停留15 s，檢測(cè)其空間學(xué)習(xí)記憶能力。

1.9 病理學(xué)觀察

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠麻醉處死，取腦組織置10%福爾馬林溶液中保存。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，腦組織連續(xù)切片，厚度5μm，裱于載玻片上，60℃烤箱烘烤1 h后備用。常規(guī)HE染色，封片，光鏡下觀察腦的形態(tài)學(xué)變化；同時(shí)作剛果紅染色，顯微鏡下觀察海馬、腦皮層部位橘紅色的點(diǎn)片狀及近似圓形的斑塊狀結(jié)構(gòu)，即沉積的淀粉樣斑塊。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與分析。Morris水迷宮小鼠平臺(tái)潛伏時(shí)間及神經(jīng)元計(jì)數(shù)以中位數(shù)M（Q1～Q3）表示，采用兩組獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

2 結(jié)果

2.1 APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因型的鑒定

以從小鼠尾中提取的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后將凝膠在紫外線下曝光，如目的基因在360 bp附近出現(xiàn)明顯條帶（圖1），即可確定為攜帶APP／PS1基因的小鼠。繁育后獲得同批次小鼠31只。經(jīng)鑒定，攜帶APP／PS1基因的小鼠20只，陰性小鼠11只。小鼠編號(hào)后，隨機(jī)選擇（采用隨機(jī)數(shù)字表法）8只APP／PS1陽性小鼠和8只陰性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

Fig.1 The genotype test for APP／PS1 transgenicmice The three bright bands on the left are the samples from APP／PS1 transgenicmice

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.2.1 定向航行實(shí)驗(yàn) 定向航行實(shí)驗(yàn)共持續(xù)4 d。在此期間觀察到，AD組小鼠對(duì)訓(xùn)練的學(xué)習(xí)和空間記憶能力較CT組差，具體表現(xiàn)為AD組小鼠需要花費(fèi)更長時(shí)間才能到達(dá)平臺(tái)，在連續(xù)訓(xùn)練中對(duì)尋找平臺(tái)行為的鞏固效果也明顯劣于CT組。從實(shí)驗(yàn)的第2天開始，AD組小鼠需要較長時(shí)間到達(dá)平臺(tái)，而實(shí)驗(yàn)的第3天和第4天這種表現(xiàn)更明顯，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表 1）

Tab.1 The difference of the latent time in the training phase of acquisition trial between the two groups（n＝8）

定向航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練階段結(jié)束后，將平臺(tái)隱匿，檢測(cè)小鼠對(duì)訓(xùn)練的記憶能力。結(jié)果顯示，AD組小鼠潛伏時(shí)間［60.0（4.7～60.0）s］較 CT組［12.3（4.6～26.7）s］明顯增長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝2.061，P＝0.039，圖 2）。

2.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在平臺(tái)撤除后APP／PS1小鼠并無明顯的搜索平臺(tái)的行為，而是較長時(shí)間在迷宮中無目的地游動(dòng)，運(yùn)動(dòng)軌跡未顯示出小鼠在目標(biāo)象限有明顯的探索傾向（圖2），AD組穿越目標(biāo)象限區(qū)域的次數(shù)為 5（0，8），明顯少于 CT組［11（4，14）］（Z＝2.430，P＝0.015）。

Fig.2 The swimming track ofmice in the probe trial

2.3 病理學(xué)檢查結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，CT組小鼠的CA1區(qū)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊緊密，錐體細(xì)胞核大而圓。CA3區(qū)結(jié)構(gòu)正常，錐體細(xì)胞排列緊密整齊，層次清楚，細(xì)胞核呈圓形，大而規(guī)則，核仁清晰。偶見神經(jīng)元細(xì)胞凋亡（圖3）。而AD組小鼠海馬結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯異常，CA1區(qū)及CA3區(qū)部分神經(jīng)元失去正常結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列疏松紊亂、層數(shù)減少。錐體細(xì)胞大量喪失、數(shù)目減少，細(xì)胞聯(lián)結(jié)松懈，細(xì)胞周圍出現(xiàn)環(huán)狀帶，胞體縮小，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、凋亡（圖3，見彩圖頁Ⅲ）。

剛果紅染色結(jié)果顯示，AD組小鼠皮層區(qū)間質(zhì)可見局灶性剛果紅染色陽性物質(zhì)，呈小團(tuán)狀結(jié)構(gòu)；而CT組小鼠皮層區(qū)未見剛果紅染色陽性表達(dá)（圖4，見彩圖頁Ⅲ）。

3 討論

AD的典型病理改變?yōu)樯窠?jīng)纖維纏結(jié)和老年斑，其中老年斑是由淀粉樣蛋白 Aβ沉積引起的［6］。APPswe／PS1模型小鼠最初是由David Borchelt建立的［7］，他通過兩種質(zhì)粒將 Mo／HuAPP695swe和 PS1-dE9基因分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并分別由各自的小鼠朊蛋白啟動(dòng)子元件（mouse prion protein promoter elements，PrP）控制其表達(dá)。其中，Mo／HuAPP695swe基因攜帶有與家族性AD相關(guān)的K595N／M596L突變的人源Aβ前體蛋白，PS1-dE9基因攜帶有與家族性AD相關(guān)外顯子9刪除的人源PS1變異體，兩個(gè)突變基因片段被轉(zhuǎn)入同一個(gè)基因座，誘導(dǎo)Aβ蛋白的異常表達(dá)和代謝，導(dǎo)致Aβ斑塊沉積［8］。因此，進(jìn)行基因型檢測(cè)時(shí)，目的基因?yàn)橐粋€(gè)條帶。

我們引進(jìn)了APPswe／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠雜合子種鼠4只（2雄2雌）進(jìn)行繁育。由于種鼠為雜合子，根據(jù)遺傳規(guī)律，其后代有1／4的概率為陰性純合子，所以在使用前必須進(jìn)行模型效果評(píng)價(jià)。為此，我們根據(jù)基因型檢測(cè)結(jié)果，以同窩別陰性小鼠（陰性純合子）作為野生型對(duì)照，對(duì)所獲得的陽性AD模型小鼠進(jìn)行病理學(xué)檢查和行為學(xué)評(píng)價(jià)。

該模型小鼠的生長及發(fā)育規(guī)律與普通小鼠基本相似，但隨著其攜帶的突變APP和PS1基因效應(yīng)的累積，在6～7月齡時(shí)，陽性小鼠可在病理學(xué)及學(xué)習(xí)認(rèn)知能力方面出現(xiàn)類似AD的典型特征。為評(píng)價(jià)該特征的穩(wěn)定性，我們對(duì)7月齡小鼠進(jìn)行病理學(xué)及行為學(xué)檢測(cè)。結(jié)果表明，7月齡AD模型小鼠腦組織內(nèi)出現(xiàn)明顯的Aβ斑塊沉積和神經(jīng)元丟失，且Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示該月齡的陽性小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，與AD患者表現(xiàn)出類似的病理學(xué)和行為學(xué)特征，也與同類的 APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠模型相似［9，10］。同時(shí)，對(duì)多只該模型小鼠個(gè)體的重復(fù)實(shí)驗(yàn)和觀察表明，該AD小鼠模型遺傳性狀穩(wěn)定，具有較好的繁育和擴(kuò)種能力，由種鼠繁育的第一代小鼠APP／PS1基因陽性率約為50%，在后續(xù)的擴(kuò)種繁育過程中，當(dāng)傳到第三代時(shí)小鼠APP／PS1基因陽性率已達(dá)70%左右。該小鼠模型不僅在癥狀和體征方面較好地模擬了AD的特點(diǎn)，在細(xì)胞分子水平也表現(xiàn)出類似AD的特征，且該模型轉(zhuǎn)入的突變基因位點(diǎn)誘發(fā)疾病進(jìn)展相對(duì)較慢，發(fā)病時(shí)間也較晚，適宜用于干預(yù)時(shí)間較長的實(shí)驗(yàn)，這為研究AD的發(fā)病機(jī)制，探索防治AD的藥物提供有力的工具。

但是，由于轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合到小鼠的基因組，外源性基因?qū)τ谄渥陨砘蚪M功能的發(fā)揮可能存在干擾，所以該模型小鼠普遍表現(xiàn)出繁殖能力降低，抗病能力差，具體表現(xiàn)為每胎所生小鼠數(shù)量減少，死亡率高于普通小鼠，創(chuàng)傷后的恢復(fù)能力減弱。在模型小鼠的繁育過程中，我們記錄到AD小鼠從出生至7月齡死亡率可達(dá)25%～30%，明顯高于同批次陰性小鼠（＜5%）。關(guān)注這一點(diǎn)對(duì)需要保種、育種以及實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)較長的研究工作尤為重要。

總之，該模型小鼠較好地模擬了AD發(fā)病的病理學(xué)及行為學(xué)特征，在較穩(wěn)定的年齡段出現(xiàn)Aβ斑塊沉積，神經(jīng)元丟失現(xiàn)象明顯，學(xué)習(xí)記憶能力減退，其發(fā)病過程與人類AD病程非常相似，疾病進(jìn)展速度相對(duì)較緩慢，在細(xì)胞、分子水平上也很好地模擬了AD的特點(diǎn)，在AD實(shí)驗(yàn)研究中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。雖然該模型小鼠轉(zhuǎn)入外源突變致病基因后，生殖及抵抗能力出現(xiàn)一定程度的減弱，但這些不足可通過在飼養(yǎng)過程中嚴(yán)格控制飼養(yǎng)條件和環(huán)境加以改善。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的該小鼠模型，可作為研究AD發(fā)病機(jī)制及開發(fā)AD防治藥物的有效實(shí)驗(yàn)工具。

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