自噬抑制劑氯喹對(duì)急性酒精誘導(dǎo)小鼠肝損傷的影響*

桑文華，曾美純，陳 莎，陳 然，范小芳，龔永生，張海鄰，張宏宇，孔曉霞Δ

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院低氧醫(yī)學(xué)研究所，2.溫州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，3.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州325035）

酗酒已成為肝臟疾病致死的主要原因之一［1］。一次飲酒過(guò)量或長(zhǎng)期大量飲酒均可造成不同程度的肝損害，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康［2］。飲酒相關(guān)的健康問(wèn)題如酒精肝已成為我國(guó)的一大社會(huì)問(wèn)題。酒精肝的致病因素單一，但其發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未完全清楚。有研究指出，炎癥是酒精肝形成過(guò)程中的重要階段，所以抑制炎癥可能是治療酒精肝的一種有效的策略［3］。

細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴的降解產(chǎn)物再利用過(guò)程，是維持細(xì)胞能量平衡必不可少的途徑［4］。迄今為止已證實(shí)，自噬與衰老、免疫、細(xì)胞死亡和分化有關(guān)，在退行性疾病和癌癥等惡性疾病的發(fā)展中也有重要意義［5，6］。一般而言，在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，一方面，自噬作為一種適應(yīng)性機(jī)制，在疾病發(fā)展的早期清除了受損的細(xì)胞器和蛋白，產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量用于恢復(fù)組織的穩(wěn)態(tài)；另一方面，過(guò)度激活的自噬過(guò)程導(dǎo)致的細(xì)胞死亡即自噬性細(xì)胞死亡，則加速疾病的發(fā)展和惡化［7-9］。細(xì)胞自噬的分子機(jī)制十分復(fù)雜。有研究表明，抑制自噬可增加體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞中的TG水平，增強(qiáng)自噬可減少肝臟脂肪的過(guò)度積聚［10］，但自噬在急性酒精中毒中的具體作用及機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)使用氯喹抑制自噬，在動(dòng)物模型中觀察自噬在急性酒精中毒中的作用及對(duì)炎癥的影響，為臨床應(yīng)用誘導(dǎo)自噬藥治療酒精中毒提供根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

抗 nuclear factorκB（NF-κB）p65、LC3、Lamin A和β-actin單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司。油紅O及HE染色相關(guān)試劑購(gòu)自Sigma公司；甘油三酯（TG）試劑盒、ALT、AST試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因有限公司；TNF-α、IL-6試劑盒購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究。

1.2 動(dòng)物模型構(gòu)建

取20～25 g雄性C57BL／6小鼠，購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。21只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)（普通飼料）1周后隨機(jī)分為3組（n＝7）：對(duì)照組，酒精組，氯喹干預(yù)組。根據(jù)文獻(xiàn)［11］，酒精組按 4.5 g／kg劑量給予33%（V／V）酒精灌胃一次，每?jī)芍唤o藥間隔20 min。對(duì)照組給予等體積飲用水。氯喹干預(yù)組腹腔注射氯喹60mg／kg，30min后酒精灌胃，劑量同酒精組［12］。酒精處理后18 h實(shí)驗(yàn)結(jié)束，乙醚麻醉小鼠，眶后靜脈叢取血分離血清，-80℃保存；剖腹取肝臟，稱重后取部分置液氮中凍存，其余部分以4%多聚甲醛固定。

1.3 肝組織病理學(xué)檢查和血清生化指標(biāo)檢測(cè)

肝組織石蠟切片，行常規(guī)HE染色。小鼠肝組織冰凍切片，行常規(guī)油紅O染色。光鏡下觀察油紅O及HE切片，評(píng)估肝臟脂肪變性情況。利用組織TG試劑盒，酶法測(cè)定肝組織TG含量。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清AST、ALT活性。

1.4 炎癥因子檢測(cè)

以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)血清中炎癥因子TNF-α、IL-6水平，實(shí)驗(yàn)按說(shuō)明書(shū)完成。

1.5 免疫熒光染色

肝組織石蠟切片經(jīng)常規(guī)烤片，脫蠟。微波爐高火加熱檸檬酸抗原修復(fù)液1 min，將組織切片浸入，再次高火加熱1min，取出切片，PBS洗滌3次。5%BSA室溫封閉20 min，加入特異性抗 LC3抗體（1∶100稀釋?zhuān)?°C孵育過(guò)夜。次日，PBST洗 3次，加入熒光素標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1∶500稀釋?zhuān)?，室溫孵?0 min，PBST洗 3次，加入 DAPI（1∶500稀釋?zhuān)┓跤?10 min，封片，共聚焦顯微鏡拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測(cè)

將肝組織剪碎置勻漿器中勻漿，裂解30 min后，將裂解液移至 1.5 ml離心管中，4℃、12 000 r／min離心 15 min。取上清置-20℃保存。應(yīng)用 BIORAD法測(cè)定蛋白含量。取50μg組織蛋白做SDSPAGE電泳，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。取出膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗3次，分別加入特異性抗 NF-κB p65、抗 TNF-α和抗 IL-6抗體，4°C孵育過(guò)夜。次日，PBST洗3次，加入髓過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，置脫色搖床上搖1 h，PBST洗3次。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照分析，以β-actin為內(nèi)參蛋白。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用SPSS 15.0軟件處理。多組間的比較采用單因素方差分析，組間差異比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 氯喹對(duì)急性酒精誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性的影響

HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)脂肪空泡；酒精組小鼠肝組織有明顯的脂肪空泡產(chǎn)生，提示酒精引起脂肪堆積；與酒精組相比，氯喹作用后，肝組織充滿大量大小不一的脂肪空泡（圖1A）。油紅O染色結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠肝組織中未見(jiàn)明顯的紅色脂滴；酒精組小鼠可見(jiàn)中等量的紅色脂滴，呈小顆粒狀，進(jìn)一步證實(shí)酒精引起脂肪變性；與酒精組相比，氯喹組小鼠肝組織可見(jiàn)大量紅色脂滴，呈較大顆粒狀（圖1B，圖1見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅱ）。

2.2 氯喹對(duì)肝組織TG含量及血清AST和ALT活性的影響

酒精組肝組織TG含量、血清AST與ALT活性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），氯喹 +酒精組上述指標(biāo)均分別明顯高于酒精組（P＜0.05，表1）。

2.3 氯喹對(duì)肝組織中LC3蛋白表達(dá)的影響

自噬相關(guān)蛋白LC3是自噬過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白之一，是自噬體形成雙層膜結(jié)構(gòu)的主要組成部分，已廣泛用于衡量細(xì)胞自噬激活水平。肝組織LC3免疫熒光染色結(jié)果表明：對(duì)照組肝組織LC3蛋白熒光表達(dá)很弱，平均熒光強(qiáng)度為（58.63±4.58）%。與對(duì)照組相比，酒精組LC3蛋白的熒光表達(dá)顯著增加，平均熒光強(qiáng)度為（134.15±6.76）%，提示酒精增加了肝細(xì)胞的自噬水平；而氯喹干預(yù)組LC3蛋白的熒光表達(dá)進(jìn)一步增加，平均熒光強(qiáng)度為（241.94±8.17）%（圖 2A）。Western blot蛋白檢測(cè)結(jié)果表明：對(duì)照組 LC3-Ⅱ蛋白為 0.89±0.32，LC3-Ⅱ／LC3-I比值為1.02±0.14。與對(duì)照組比較，酒精組 LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增加至 1.63±0.17（P＜0.05），LC3-Ⅱ／LC3-I比值增加至 1.89±0.26（P＜0.05）；與酒精組相比，氯喹干預(yù)組 LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)增至 1.98±0.32（P＜0.05），LC3-Ⅱ／LC3-I比值增至 3.26±0.11（P＜0.05，圖 2B、2C，圖 2見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅱ），這表明自噬抑制劑氯喹明顯增加酒精誘導(dǎo)的自噬標(biāo)志性蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)，提示細(xì)胞自噬體與溶酶體融合和降解過(guò)程被顯著抑制。

Tab.1 The changes in TG amount of hepatic tissue and serum AST and ALT activities in each group（，n＝7）

Tab.1 The changes in TG amount of hepatic tissue and serum AST and ALT activities in each group（，n＝7）

TG：Triglyceride；AST：Serum aspartate aminotransferase；ALT：Alanine aminotransferase*P＜0.05；**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05 vs ethanol group

Group TG（mg／g） AST（U／L） ALT（U／L）Control 34.5±4.1 82.4±18.2 67.3±15.7 Ethanol 68.2±3.9*200.3±16.8**145.6±8.1**CQ+Ethanol 87.5±2.6＃ 284.1±33.8＃ 201.8±17.3＃

2.4 氯喹對(duì)肝組織中炎性因子表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明：與對(duì)照組NF-κB p65表達(dá)（1.08±0.21）%相比，酒精組 NF-κB p65的表達(dá)顯著增加至（1.96%±0.23）%（P＜0.05）；氯喹干預(yù)組 NF-κB p65的表達(dá)進(jìn)一步增加至（3.43% ±0.45）% （P＜0.05）。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明：與對(duì)照組小鼠血清 TNF-α水平（68.66±12.47）pg／ml相比，酒精組血清 TNF-α顯著增加至（408.14±39.61）pg／ml（P＜0.01）；氯喹干預(yù)組血清 TNF-α進(jìn)一步增加至（652.27±28.39）pg／ml（P＜0.05）。與正常組小鼠血清 IL-6水平（44.34±6.39）pg／ml相比，酒精組血清 IL-6水平顯著增加至（171.68±22.34）pg／ml（P＜0.01）；與酒精組相比，氯喹干預(yù)組血清 IL-6水平顯著增加至（251.32±10.83）pg／ml（P＜0.05，表2）。

3 討論

適度飲酒有益于人體健康，但過(guò)量飲酒可使肝細(xì)胞的脂肪代謝紊亂，造成肝內(nèi)脂肪積聚，逐漸形成酒精性脂肪肝，導(dǎo)致組織細(xì)胞缺氧，嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體健康［13］。有研究表明，線粒體損傷、ROS生成、炎癥反應(yīng)和脂肪變性等是促成酒精性肝損害過(guò)程的重要因素［14，15］，因此，清除這些損害物質(zhì)可起到保護(hù)作用。炎癥反應(yīng)是酒精性肝損傷發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，有研究表明，NF-κB作為重要的促炎轉(zhuǎn)錄因子參與酒精誘導(dǎo)的肝損傷［16］。長(zhǎng)期攝入酒精明顯增加肝組織中NF-κB p65的磷酸化水平，促進(jìn)促炎因子 TNF-α和IL-1β的釋放［17］。因此，抑制炎癥反應(yīng)在酒精性肝損傷防治中具有重要意義。自噬是細(xì)胞通過(guò)溶酶體降解途徑調(diào)控的細(xì)胞器和蛋白循環(huán)過(guò)程，由雙層膜結(jié)構(gòu)包裹的自噬體或自噬空泡的大量堆積是自噬激活的主要特征［18］。目前研究表明，急性酒精暴露明顯增加自噬體形成，并啟動(dòng)自噬過(guò)程清除損傷線粒體和肝脂肪滴，抑制自噬將增加酒精毒性和脂肪肝形成［12］。在酒精性肝損傷動(dòng)物模型中，雷帕霉素誘導(dǎo)自噬，抑制了與酒精誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)相關(guān)的炎癥反應(yīng)及炎性因子的釋放［19］。推測(cè)自噬在減輕酒精誘導(dǎo)肝損傷中起關(guān)鍵作用。

Tab.2 The levels of NF-κB p65，serum TNF-αand IL-6（，n＝7）

Tab.2 The levels of NF-κB p65，serum TNF-αand IL-6（，n＝7）

TNF-α：Tumor necrosis factor-α；IL-6：Interleukin-6*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； ＃P＜0.05 vs ethanol group

Group NF-κB p65（%） TNF-α（pg／ml） IL-6（pg／ml ）Control 1.08±0.21 68.66±12.47 44.34±6.39 Ethanol 1.96±0.23* 408.14±39.61**171.68±22.34**CQ+Ethanol 3.43±0.45＃ 652.27±28.39＃ 251.32±10.83＃

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酒精灌胃18 h，成功建立急性酒精肝損傷小鼠模型，小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的大小不等的脂滴，肝組織中TG含量和血清AST、ALT活性呈現(xiàn)不同程度的升高。研究還發(fā)現(xiàn)，急性酒精攝入增加肝組織NF-κB p65蛋白水平，同時(shí)增加促炎因子TNF-α和IL-6的釋放。上述結(jié)果這表明，一次大量攝入酒精可引起明顯的肝臟脂肪變性及肝臟炎性反應(yīng)癥信號(hào)激活。

LC3是自噬標(biāo)志性蛋白。免疫熒光染色結(jié)果表明，一次大量攝入酒精明顯增加肝自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)。Western blot結(jié)果也表明，酒精顯著增強(qiáng)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，與LC3染色結(jié)果一致，提示自噬在急性酒精中毒中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。但自噬在急性酒精中毒中的具體作用機(jī)理尚不清楚。氯喹是一種常用的自噬抑制劑，通過(guò)改變?nèi)苊阁w功能可阻斷自噬相關(guān)的溶酶體融合和代謝過(guò)程。有研究表明，自噬在酒精誘導(dǎo)的急、慢性肝損傷中都有明顯保護(hù)作用，使用氯喹抑制自噬將加重酒精誘導(dǎo)的肝損傷［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致：使用氯喹抑制自噬體與溶酶體的融合，即抑制自噬溶酶體功能從而抑制降解過(guò)程，增加酒精誘導(dǎo)的LC3表達(dá)從而抑制自噬的進(jìn)程，卻增加酒精誘導(dǎo)的脂滴形成、TG含量及血清AST、ALT活性，從而加重酒精誘導(dǎo)的肝損傷。這說(shuō)明自噬在酒精性肝損傷中具有一定的保護(hù)作用。炎癥是酒精性肝損傷主要的病理變化之一，有研究表明，氯喹抑制自噬加重LPS誘導(dǎo)的小鼠肝組織脂滴積累和炎癥反應(yīng)［21］，提示自噬對(duì)炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氯喹抑制自噬加重酒精誘導(dǎo)的肝損傷及炎癥反應(yīng)，與炎癥相關(guān)蛋白NF-κBP65的表達(dá)增加及血清促炎因子TNF-α和IL-6釋放增加有關(guān)。

綜上所述，推測(cè)在急性酒精肝損傷過(guò)程中，自噬可能作為一種適應(yīng)性機(jī)制，通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)損傷的細(xì)胞器等及循環(huán)再利用來(lái)提供能量，發(fā)揮保護(hù)作用；自噬抑制劑氯喹通過(guò)影響溶酶體功能及自噬清除損傷細(xì)胞器的功能，加重酒精誘導(dǎo)的肝脂肪變性及炎癥，相關(guān)機(jī)理尚有待于深入探討。炎癥在酒精性肝損傷發(fā)病中有重要作用，自噬對(duì)酒精性肝損傷炎癥反應(yīng)具有一定抑制作用。因此，臨床上治療酒精肝在常規(guī)戒酒護(hù)肝等治療的基礎(chǔ)上，嘗試應(yīng)用誘導(dǎo)自噬藥物如雷帕霉素等可能具有一定的價(jià)值。

［1］ Pan JH，Lim YJ，Kim JH，etal.Rootbark of Ulmus davidiana var.japonica restrains acute alcohol-induced hepatic steatosisonset in mice by inhibiting ROS accumulation［J］.PLoSOne，2017，12（11）：e0188381.

［2］ Tilg H，Moschen AR，Szabo G.Interleukin-1 and inflammasomes in alcoholic liver disease／acute alcoholic hepatitis and nonalcoholic fatty liver disease／nonalcoholic steatohepatitis［J］.Hepatology，2016，64（3）：955-965.

［3］ Ju C，Mandrekar P.Macrophages and alcohol-related liver inflammation［J］.Alcohol Res，2015，37（2）：251-262.

［4］ Dunn WA Jr.Autophagy and related mechanisms of lysosome-mediated protein degradation［J］.Trends Cell Biol，1994，4（4）：139-143.

［5］ Glick D，Barth S，Macleod KF.Autophagy：cellular and molecularmechanisms［J］.JPathol，2010，221（1）：3-12.

［6］ 朱煥勉，陳 然，薛 峰，等.自噬抑制劑氯奎對(duì)低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2014，30（1）：8-12.

［7］ Hetz C.Apoptosis，necrosis and autophagy：from mechanisms to biomedical applications［J］.Curr MolMed，2008，8（2）：76-77.

［8］ Mariйo G，Lópezotín C.Autophagy：molecularmechanisms，physiological functions and relevance in human pathology［J］.CellMol Life Sci，2004，61（12）：1439-1454.

［9］ 何云凌，吳麗穎，黃 欣，等.自噬對(duì)不同低氧條件下PC12細(xì)胞存活的影響［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2013，29（3）：193-196.

［10］ Ding WX，Manley S，Ni HM.The emerging role of autophagy in alcoholic liver disease［J］.Exp Biol Med，2011，236（5）：546-556.

［11］NiHM，Du K，You M，etal.Critical role of FoxO3a in alcohol-induced autophagy and hepatotoxicity［J］.Am J Pathol，2013，183（6）：1815-1825.

［12］Ding WX，Li M，Chen X，et al.Autophagy reduces acute ethanol-induced hepatotoxicity and steatosis in mice［J］.Gastroenterology，2010，139（5）：1740-1752.

［13］Han JJ，PlaweckiMH，Doerschuk PC，et al.Ordinary differential equation models for ethanol pharmacokinetic based on anatomy and physiology［C］／／Engineer Med Biol Society，2006.International Conference of the IEEE.IEEE，2006：5033-5036.

［14］Lieber CS.Alcoholic fatty liver：its pathogenesis andmechanism of progression to inflammation and fibrosis［J］.Alcohol，2004，34（1）：9-19.

［15］Lu Y，Cederbaum AI.CYP2E1 and oxidative liver injury by alcohol［J］.Free Radic Biol Med，2008，44（5）：723-738.

［16］Tak PP，F(xiàn)irestein GS.NF-kappa B：a key role in inflammatory diseases［J］.JClin Invest，2001，107（1）：7-11.

［17］da silva BS，Rodrigues GB，Rocha SW，et al.Inhibition of NF-κB activation by diethylcarbamazine prevents alcohol-induced liver injury in C57BL／6 mice［J］.Tissue Cell，2014，46（5）：363-371.

［18］ Mizushima N，Yoshimori T，Levine B.Methods in mammalian autophagy research［J］.Cell，2010，140（3）：313-326.

［19］Kong X，Yang Y，Ren L，etal.Activation of autophagy attenuates EtOH-LPS-induced hepatic steatosis and injury through MD2 associated TLR4 signaling［J］.Scient Rep，2017，7（1）：9292-9304.

［20］Cho HI，Choi JW，Lee SM.Impairment of autophagosomelysosome fusion contributes to chronic ethanol-induced liver injury［J］.Alcohol，2014，48（7）：717-725.

［21］ Chung KW，Kim KM，Choi YJ，et al.The critical role played by endotoxin-induced liver autophagy in the maintenance of lipid metabolism during sepsis［J］.Autophagy，2017，13（7）：1113-1129.