釀酒酵母細胞壁誘導體外培養(yǎng)綿羊瘤胃上皮細胞表達SBD-1的研究

田巧珍，金 鑫，張 曼，張召議，王云鶴，楊銀鳳

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，呼和浩特 010018)

隨著經(jīng)濟的轉(zhuǎn)型，畜牧業(yè)正向規(guī)?；?、集約化、高密度的養(yǎng)殖模式過渡。舍飼或半舍飼模式成為我國畜牧業(yè)的主要模式，由此導致畜禽疾病感染率增高。濫用抗生素引起的病原菌耐藥性增強、畜產(chǎn)品抗生素殘留超標等問題愈發(fā)嚴重[1]，如何提高動物機體自身免疫成為獸醫(yī)工作者的新課題。

防御素是一種廣泛存在于生物界中的陽離子抗菌肽，是宿主抵御外來物的基礎(chǔ)[2]。β-防御素廣泛存在于哺乳動物和禽類體內(nèi)，在上皮細胞、白細胞、血漿、尿液及多種組織中均有表達[3-5]。在綿羊體內(nèi)，目前鑒定出2種β-防御素，被命名為綿羊β-防御素-1、-2(Sheep beta-defensin -1、-2，SBD-1、SBD-2)[6]。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，SBD-2 mRNA只表達于舌和遠端回腸，SBD-1 mRNA卻在氣管和整個消化道(從舌～結(jié)腸)廣泛表達[7]。研究表明，綿羊防御素的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要在上皮細胞中發(fā)現(xiàn)，且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含量最多的是瘤胃上皮組織[6]，由此可推斷，β-防御素是綿羊瘤胃上皮內(nèi)發(fā)揮天然免疫作用的重要成員。

動物機體的益生菌群與黏膜免疫系統(tǒng)之間呈積極和諧的關(guān)系，益生菌在預防病原菌定植和維持腸道黏膜免疫中發(fā)揮著無可替代的作用[8]。益生菌黏附、定植于胃腸道上皮細胞是其發(fā)揮益生作用的基礎(chǔ)，因此上皮細胞是益生菌發(fā)揮益生作用的重要媒介[9]。益生性大腸桿菌 Nissle1917的鞭毛蛋白可以誘導人腸上皮細胞Caco-2表達β-防御素-2(hBD-2)[10]。乳酸菌和VSL#3菌能聯(lián)合增加腸道的免疫屏障功能，其作用機制主要涉及炎癥通路，包括NF-κB和AP-1及MAPK誘導上調(diào)hBD-2[11]。黎觀紅等[12]研究結(jié)果顯示，鼠李糖乳酸桿菌LGA能夠促進雞小腸上皮細胞后抗菌肽β-防御素-9的表達。本試驗室研究團隊前期進行了釀酒酵母等益生菌與防御素相關(guān)的研究[13-15]。盡管劉龍海等[16]研究了釀酒酵母菌發(fā)酵液的體外抑菌活性，但益生菌發(fā)揮益生作用的有效成分和機理目前還不是十分清楚。

釀酒酵母在釀酒、制藥、食品等行業(yè)中有著極高的應(yīng)用價值。酵母細胞壁位于酵母細胞最外層與生長外環(huán)境直接接觸，它對維持酵母菌自身形態(tài)構(gòu)造、滲透壓、物質(zhì)代謝、免疫識別等至關(guān)重要[17]。迄今為止，關(guān)于釀酒酵母細胞壁與哺乳動物特別是反芻動物防御素表達的研究尚未見報道。本試驗通過采用釀酒酵母細胞壁刺激綿羊瘤胃上皮細胞，檢測不同濃度、不同時間酵母細胞壁作用綿羊瘤胃上皮細胞的SBD-1 mRNA和蛋白表達的變化，為從菌體表面抗原與上皮細胞抗菌肽表達關(guān)系的角度解析防御素發(fā)揮非特異性免疫的機制提供更多的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

釀酒酵母菌菌株購于中國微生物菌種網(wǎng)(編號：CGMCC 2.614)。瘤胃組織取自內(nèi)蒙古呼和浩特市北亞屠宰場。6月齡的健康蒙古綿羊屠宰后，立刻剪取約10 cm×10 cm大小的瘤胃組織，用無菌的含雙抗和兩性霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗凈后，帶回試驗室備用。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、顯微成像系統(tǒng)(Analytik Jena，German)、多功能酶標儀(SynergyTMH4，Biotek)、超聲波細胞破碎儀(QSONICA Q700 Sonicator)、實時熒光定量PCR儀(Q7，ABI)、激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，German)。

試劑：DEME/F12培養(yǎng)基(GLIBCO)、FAST200總RNA極速抽提試劑盒(飛捷公司)、TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)、Glass beads(425～600 μm，Sigma)、TaKaRa熒光定量PCR酶(RR820A)、綿羊防御素β1(DEFβ1)ELISA試劑盒(ELA06599Sh)、Ms m Ab to Cytokeratin 18[c-04]、Goat anti-mouse IgG-FITC SC-2010(武漢新啟迪生物公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 釀酒酵母菌培養(yǎng)及生長曲線的測定 將活化的菌種接種于麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)48 h，用于發(fā)酵種子。將發(fā)酵液按5%的接種量接種到麥芽汁培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)48 h，每隔3 h取適量菌液測定OD600 nm值，繪制生長曲線。將酵母培養(yǎng)液按5%的接種量接種到麥芽汁培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，在生長剛進入穩(wěn)定期時停止培養(yǎng)，離心收集菌體沉淀，用滅菌的PBS洗滌3次，冷凍干燥，-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 釀酒酵母細胞壁的提取及成分分析 采用玻璃珠和超聲波相結(jié)合的破碎方法，稱取10 g凍干酵母細胞，用滅菌PBS懸浮，在冰浴條件下，進行超聲波細胞破碎(工作2 s/間歇2 s、30 min、功率70 W)，然后4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min，去除上清液，反復超聲破碎2次；破壁完成后,用2% SDS緩沖液沸水浴10 min；室溫離心取沉淀,用PBS反復洗滌沉淀4～5次，直到離心上清透明為止，把沉淀冷凍干燥即為釀酒酵母菌全細胞壁成分，-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩２捎脛P氏定氮法測定細胞壁蛋白質(zhì)含量，酸水解法測定脂肪含量，HPLC測定葡聚糖含量，氣相色譜法測定甘露聚糖，X衍射檢測幾丁質(zhì)含量(送上海復昕檢測公司測樣)。

1.3.3 綿羊瘤胃上皮細胞的培養(yǎng)及鑒定 將瘤胃組織塊鈍性分離去除漿膜、肌層、黏膜下層,置于含1 000 U·mL-1青霉素、1 mg·mL-1鏈霉素、5 μg·mL-1兩性霉素的DPBS溶液中；在超凈工作臺，用含有抗生素的DPBS溶液反復洗滌浸泡30 min后，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶進行時間梯度消化并收集消化液中的細胞，離心、洗滌后，分裝于細胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當原代細胞長到80%以上時傳代，至第3代時，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，用于后續(xù)的細胞誘導表達試驗。采用免疫熒光法鑒定綿羊瘤胃上皮細胞：將無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片培養(yǎng)，細胞生長到50%時，取出蓋玻片，依次經(jīng)過4%多聚甲醛固定—0.25% Triton-100通透—5% BSA封閉后，4 ℃過夜，封閉一抗(CK18)，PBST漂洗，37 ℃避光孵育熒光二抗1 h，PBST漂洗，用DAPI復染4 min，PBST漂洗后，50%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察照相。

1.4 釀酒酵母細胞壁成分對綿羊體外瘤胃上皮細胞的刺激試驗

饑餓處理后的細胞，用DPBS洗滌后，加入釀酒酵母細胞壁不同濃度(0、25、50、100、200、400 μg·mL-1)的無血清無抗生素DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，分別提取各組總RNA，以確定最佳誘導濃度；每孔加入200 μg·mL-1釀酒酵母細胞壁濃度的無血清無抗生素DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)0、2、4、8、12、24 h后，分別提取各組總RNA，以確定最佳誘導時間。

1.4.1 細胞總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR 采用FAST200試劑盒，按其說明提取各試驗組細胞總RNA，將提取的總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)說明書進行操作，得到的cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)SBD-1基因和管家基因β-actin序列用Oligo 6軟件設(shè)計特異性引物，送上海生工公司合成，引物序列見表1。以cDNA為模板進行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)完成后，根據(jù)擴增曲線的Ct值計算SBD-1基因的相對表達量。本研究選用β-actin作內(nèi)參，根據(jù)公式2-ΔΔCt[18]求出不同濃度和時間釀酒酵母細胞壁對綿羊瘤胃上皮細胞SBD-1基因的相對表達量，進行統(tǒng)計分析。

表1 實時熒光定量 PCR 引物序列Table 1 The primer sequences for real time PCR

1.4.2 ELISA檢測共培養(yǎng)上清中SBD-1蛋白的表達及標準曲線的繪制 收集各試驗組瘤胃上皮細胞培養(yǎng)上清，采用綿羊防御素β1(SBD-1)ELISA試劑盒檢測SBD-1蛋白的表達，按其說明進行操作。運用Curve expert 1.4軟件以標準品濃度作橫坐標，OD450 nm值作縱坐標，用平滑線連接各標準品的坐標點，繪制標準曲線得到二次多項式擬合方程(圖略)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)果用“平均值±標準差(Mean±SD)”表示，以P<0.05和P<0.01分別表示差異顯著和極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 釀酒酵母菌的培養(yǎng)和細胞壁提取

2.1.1 釀酒酵母菌培養(yǎng)和生長曲線的繪制 由圖1可見，釀酒酵母菌呈卵圓形具有典型的酵母細胞結(jié)構(gòu)[19](0.1%呂氏美藍染色)，在12 h時酵母菌生長由對數(shù)期到達平臺期，故提取此時的酵母細胞壁作為刺激物。

A.釀酒酵母菌生長曲線；B.平臺期釀酒酵母形態(tài)A.The proliferation curve of S.cerevisiae; B.The morphology of S.cerevisiae during logarithmic phase圖1 釀酒酵母菌培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 The culture of S.cerevisiae

2.1.2 釀酒酵母細胞壁的鑒定 由圖2可知，細胞壁成分中甘露聚糖占的比重最大，其余依次為葡聚糖、蛋白質(zhì)、脂肪等，該釀酒酵母細胞壁的組成成分基本符合酵母細胞壁應(yīng)有的各個組分的比重[19-20]，說明本試驗中所提取的細胞壁成分較純，可以用于后續(xù)試驗。

圖2 釀酒酵母細胞壁成分組成Fig.2 Cell wall ingredients of S.cerevisiae

2.2 綿羊瘤胃上皮細胞培養(yǎng)與鑒定

2.2.1 細胞培養(yǎng) 將原代細胞傳到第3代，可見貼壁細胞界限清晰，呈鵝卵石鋪路狀致密排列，符合試驗要求(圖3A，3B)。用釀酒酵母細胞壁刺激后，綿羊瘤胃上皮細胞形態(tài)和數(shù)量未發(fā)生明顯變化(圖3C，3D)。

2.2.2 細胞鑒定 用免疫熒光法檢測上皮細胞中骨架蛋白CK18的表達結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，細胞內(nèi)CK18的表達呈明顯的陽性反應(yīng)，且分布于整個細胞胞漿，角蛋白染色陽性細胞占80%以上。

2.3 釀酒酵母細胞壁誘導綿羊瘤胃上皮細胞表達SBD-1的研究

2.3.1 不同濃度釀酒酵母細胞壁對綿羊瘤胃上皮細胞SBD-1 mRNA和蛋白相對表達量的影響 如圖5所示，當用不同濃度酵母細胞壁刺激綿羊瘤胃上皮細胞12 h后，200 μg·mL-1組SBD-1 mRNA相對表達量達到最大，極顯著高于其它試驗組(P<0.001，圖5A)；所以200 μg·mL-1用作試驗的最佳濃度。ELISA檢測結(jié)果顯示，SBD-1在蛋白水平的表達趨勢與在mRNA水平的表達趨勢基本一致。200 μg·mL-1濃度組酵母細胞壁刺激瘤胃上皮細胞后，SBD-1蛋白表達量極顯著高于對照組(P<0.001，圖5B)。

2.3.2 釀酒酵母細胞壁誘導不同時間對綿羊瘤胃上皮細胞SBD-1 mRNA和蛋白相對表達量的影響 用相同濃度的酵母細胞壁(200 μg·mL-1)分別刺激綿羊瘤胃上皮細胞0、2、4、8、12、24 h，在各組內(nèi)SBD-1 mRNA的表達量呈時間依賴關(guān)系，當刺激12 h時表達量達到最大，并與對照組和其他時間組相比差異均極顯著(P<0.001，圖6A)。ELISA檢測結(jié)果如圖6B所示，SBD-1的蛋白表達趨勢與mRNA水平的表達趨勢基本一致，12 h時酵母細胞壁刺激瘤胃上皮細胞表達SBD-1蛋白量極顯著高于對照組(P<0.001)。由此確定酵母細胞壁誘導綿羊瘤胃上皮細胞表達SBD-1的最佳濃度為200 μg·mL-1，最佳時間為12 h。

圖4 瘤胃上皮細胞的免疫熒光法檢測結(jié)果 (200×)Fig.4 The immunofluorescent detection of ruminal epithelial cells (200×)

A.RT-qPCR; B.ELISA。*.P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001。下同A.RT-qPCR; B.ELISA.*.P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001.The same as below圖5 不同濃度釀酒酵母細胞壁誘導瘤胃上皮細胞表達SBD-1和蛋白的結(jié)果(12 h)Fig.5 SBD-1 gene and protein expression of different concentrations of cell wall of S. cerevisiae stimulated ruminal epithelial cells (12 h)

圖6 釀酒酵母細胞壁誘導不同時間瘤胃上皮細胞表達SBD-1 mRNA和蛋白的結(jié)果(200 μg·mL-1)Fig.6 SBD-1 mRNA and protein expression of cell wall of S. cerevisiae stimulated ruminal epithelial cells at different times(200 μg·mL-1)

3 討 論

抗菌肽特別是防御素在人類和家畜體內(nèi)的天然免疫屏障中扮演著重要的角色，抗菌肽主要作用于病原微生物的細胞膜，且病原微生物不易對其產(chǎn)生耐藥性，可解決傳統(tǒng)抗生素藥物導致的抗藥性的難題[21-22]，但在家畜體內(nèi)進行的抗菌肽的相關(guān)試驗仍然滯后于人。利用人結(jié)腸癌上皮細胞研究發(fā)現(xiàn)，益生乳酸桿菌及其他益生菌可增加防御素的表達量從而提高機體天然免疫功能，但是利用癌細胞的結(jié)果來解釋正常細胞受限10，18]。此外，活體內(nèi)胃腸道pH環(huán)境、膽汁和各種消化酶等均對益生菌的活力和細胞壁組分的完整性產(chǎn)生影響。因此，本研究利用體外原代培養(yǎng)的正常綿羊瘤胃上皮細胞可以有效避免這些復雜因素的干擾及腸道共生菌相互之間的影響，為研究酵母提取物誘導SBD-1基因的表達提供了更客觀的資料。

酵母細胞壁是彈性很大的結(jié)構(gòu)，具有維持細胞形態(tài)、滲透性休克防護、防止機械應(yīng)力和細胞表面蛋白支架等功能，其生長和形態(tài)均受到高度精密和極化方式的調(diào)節(jié)，這一過程主要受細胞壁的完整性控制信號通路的調(diào)控[23]。本研究利用玻璃珠結(jié)合超聲波的方法很容易將酵母細胞破碎，成功提取純度較高的酵母細胞壁，以用于后續(xù)研究。國外研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛飼養(yǎng)的日糧中添加酵母細胞壁可增強動物抗病力，提高日增重等[24]。酵母細胞壁富含β-葡聚糖和甘露聚糖等多種活性物質(zhì)。酵母細胞壁的β-葡聚糖是非特異性免疫刺激多糖，能特異性結(jié)合機體的免疫細胞受體，刺激T細胞、B細胞、NK細胞產(chǎn)生大量的巨噬細胞，進而調(diào)節(jié)機體免疫[25]。β-葡聚糖是一種重要的消化道黏膜免疫增強劑[26]，飼喂β-葡聚糖可提高荷斯坦犢牛干物質(zhì)的采食量[27]。腸道病原菌的鞭毛或絨毛上的外源凝集素特異性識別宿主上皮細胞膜的受體并與之結(jié)合進而發(fā)生感染，而甘露聚糖可有效的干擾腸道病原體的定植。同時甘露糖可為腸道內(nèi)有益菌(如雙歧桿菌、乳酸桿菌等)提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進有益菌大量繁殖，進一步抑制有害菌生長[28]。戈婷婷等[29]發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖提高了錦江黃牛瘤胃培養(yǎng)液揮發(fā)性脂肪酸和菌體蛋白濃度。

本試驗發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母細胞壁誘導體外綿羊瘤胃上皮細胞SBD-1的表達結(jié)果呈劑量—時間依賴關(guān)系，釀酒酵母細胞壁刺激綿羊瘤胃上皮細胞不同時間后，在12 h時，SBD-1基因表達量達到最大，這種依賴趨勢與黎觀紅的試驗結(jié)果吻合[12]。本研究采用RT-qPCR和ELISA方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SBD-1的mRNA與蛋白的表達趨勢一致，且釀酒酵母細胞壁刺激后的瘤胃上皮細胞SBD-1基因表達量明顯高于對照組，說明SBD-1在轉(zhuǎn)錄水平開始就調(diào)節(jié)蛋白的表達。

綜合本試驗結(jié)果推斷，酵母細胞壁可誘導或促進上皮細胞防御素的表達，對黏膜形成保護，抑制和殺滅有害菌并調(diào)節(jié)有益菌數(shù)量和種類以維持胃腸道微生態(tài)平衡。酵母細胞壁作為廉價的抗生素的天然替代品，可作為飼料補充劑來提高家畜的免疫水平，為解決傳統(tǒng)抗生素藥物導致的抗藥性難題提供新思路，研究如何提高家畜體內(nèi)抗菌肽表達至合理的水平，從而去預防和治療家畜疾病提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平得出了釀酒酵母細胞壁能有效促進瘤胃上皮細胞SBD-1的表達，且釀酒酵母細胞壁以200 μg·mL-1濃度在刺激瘤胃上皮細胞12 h，SBD-1基因的表達量達到最高，釀酒酵母細胞壁刺激瘤胃上皮細胞后SBD-1蛋白可分泌到細胞外發(fā)揮其生物學功能。

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