DNA甲基化在腎癌中的研究進(jìn)展

陳 翔 綜述，郭劍明 審校

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科，上海 200032)

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%～3%，以腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)最常見，其中約25%的患者在初診時(shí)已有轉(zhuǎn)移[1]。腎癌的發(fā)病原因尚不清楚，可能與基因改變有關(guān)。盡管局限性腎癌可通過手術(shù)根治，但30%的患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。腎癌對放化療高度抵抗，目前對轉(zhuǎn)移性腎癌仍缺乏根治手段，通常采用靶向藥物治療以延長生存期[3]。

表觀遺傳學(xué)主要研究影響基因表型但不涉及DNA序列改變的遺傳調(diào)控機(jī)制，包括但不限于DNA、mRNA和組蛋白的各類共價(jià)修飾以及非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。和遺傳學(xué)改變類似，表觀遺傳改變在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中也起到重要作用，其中以DNA甲基化的研究最為深入。DNA甲基化是指在CpG雙核苷酸的胞嘧啶環(huán)5位碳原子上連接甲基，是一種可遺傳、可逆的共價(jià)修飾，主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶引發(fā)并維持。啟動子和增強(qiáng)子區(qū)域的甲基化可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄活性降低，下調(diào)蛋白表達(dá)水平[4]。目前已有不少DNA甲基化與腫瘤發(fā)生、診斷、預(yù)后、耐藥和治療相關(guān)的報(bào)道，現(xiàn)對DNA甲基化在腎癌中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 DNA甲基化與腎癌的發(fā)生和進(jìn)展

腎癌的發(fā)生與多種基因的突變、激活和抑制有關(guān)；這些基因同時(shí)受遺傳和表觀遺傳調(diào)控，兩種調(diào)控機(jī)制在不同基因中的重要性不一。既往研究已發(fā)現(xiàn)，絕大部分家族性ccRCC和70%的散發(fā)性ccRCC病例中存在von Hippel-Lindau (VHL)基因失活和低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)累積，促進(jìn)腎癌發(fā)生和血管生成[5]。VHL基因的失活可由基因突變或啟動子甲基化造成，其中僅7%的VHL失活由啟動子甲基化造成，且與基因突變互斥，說明表觀遺傳改變并非VHL失活的主要原因[6]。腎癌存在遺傳異質(zhì)性，在VHL/HIF通路外，也存在其他基因的啟動子甲基化失活，這可能與VHL/HIF通路靶向藥物耐藥有關(guān)[7]。

RICKETTS等[8]發(fā)現(xiàn)40%的腎癌腫瘤組織中存在OVOL1基因啟動子甲基化；該基因的產(chǎn)物可抑制轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的表達(dá)，其甲基化則增加c-Myc表達(dá)，激活多種癌基因，促進(jìn)腎癌的發(fā)生。抑制轉(zhuǎn)化生長因子β( transforming growth factor β，TGFβ)信號通路的SMAD6基因也在腎癌中被發(fā)現(xiàn)存在高甲基化，可激活TGFβ通路并促進(jìn)腫瘤增殖[9]。TEZVAL等[10]發(fā)現(xiàn)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放結(jié)合蛋白基因(corticotropin releasing hormone-binding protein，CRHBP)甲基化可促進(jìn)腎癌的轉(zhuǎn)移，提示腎上腺軸激素在腎癌的進(jìn)展中可能起到一定的作用。CHD5這一抑癌基因的表達(dá)產(chǎn)物可抑制腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤干細(xì)胞的產(chǎn)生。腎癌中CHD5幾乎不發(fā)生突變，但在44%的腎癌組織中因啟動子甲基化而處于沉默狀態(tài)，使腫瘤易于遷移和侵襲[11]。NELL1和NELL2蛋白分別與骨和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)。NAKAMURA等[12]發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞系和組織中這兩個(gè)基因存在啟動子甲基化，蛋白表達(dá)低于正常腎組織；而去甲基化藥物處理可增加其表達(dá)，增加癌細(xì)胞的粘附性，抑制其遷移，這提示NELL1/2甲基化可能在腎癌的進(jìn)展中發(fā)揮作用。

含胱天蛋白酶募集域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡；該基因在腎癌組織和細(xì)胞系中因啟動子甲基化而低表達(dá)，且甲基化水平與Fuhrman分級相關(guān)。去甲基化藥物可在體外實(shí)驗(yàn)中增加其表達(dá)，抑制腎癌細(xì)胞生長和侵襲，促進(jìn)其凋亡，并激活抑癌基因p53；敲除該基因則促進(jìn)癌細(xì)胞生長，減少凋亡，說明其甲基化可促進(jìn)腎癌的進(jìn)展[13]。骨形態(tài)生成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)與細(xì)胞分化、增殖和凋亡相關(guān)。在腎癌細(xì)胞系和組織中，BMP2基因啟動子處于甲基化狀態(tài)，上調(diào)BMP2的表達(dá)，可抑制腎癌細(xì)胞侵襲和遷移，并增加其凋亡，因此推測其與腎癌的發(fā)生有關(guān)[14]。

由上可知，在腎癌中，高甲基化所致的基因沉默影響各種抑癌基因表達(dá)，使腫瘤易于增大和進(jìn)展。不同的抑癌基因中，甲基化和基因突變所起到的抑制表達(dá)作用不同。此外，從整體角度看，基因組的甲基化也與腎癌相關(guān)：大樣本的病例對照研究發(fā)現(xiàn)基因組的整體低甲基化水平可增加腎癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，該結(jié)論和其它腫瘤組織中的研究結(jié)果相符[15]。其原因可能是低甲基化使基因組的穩(wěn)定性降低，易于發(fā)生重組、突變、轉(zhuǎn)座子重激活和癌基因激活，促進(jìn)正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

2 DNA甲基化與腎癌的診斷

腎癌的臨床診斷依賴于影像學(xué)初診和病理學(xué)確診，目前尚無特異性腫瘤標(biāo)志物可進(jìn)行早期診斷和篩查，因此近年來對特定DNA序列甲基化在腎癌診斷中的應(yīng)用進(jìn)行了探索。

HAUSER等[16]對55份腎癌血清總游離DNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)患者血清中APC、GSTP1、p14、p16、RAR-B、RASSF1A、TIMP3和PTGS2基因甲基化水平均高于對照組。單個(gè)基因甲基化用于腎癌診斷敏感性太低，聯(lián)合使用APC、PTGS2和GSTP1進(jìn)行診斷增加了準(zhǔn)確性(靈敏度62.9%，特異度87%)，但仍難以滿足臨床要求。DE MARTINO等[17]也發(fā)現(xiàn)ccRCC患者(尤其是轉(zhuǎn)移或壞死性腎癌)和對照組間RASSF1A和VHL基因甲基化存在顯著差異，可能有診斷意義，但未對進(jìn)行診斷效能評估和驗(yàn)證。XIN等[18]對尿標(biāo)本中轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TCF)21基因(TCF21)進(jìn)行了分析，認(rèn)為其甲基化水平可區(qū)分腎癌患者，但在腫瘤組織中驗(yàn)證卻發(fā)現(xiàn)和尿液結(jié)果不一致?？傊?，目前基于體液標(biāo)本的基因甲基化檢測尚不能實(shí)現(xiàn)對腎癌的診斷。

3 DNA甲基化與腎癌的預(yù)后

年齡、TNM分期、病理類型、Fuhrman分級等是經(jīng)典的腎癌生存預(yù)測因素，但隨著基礎(chǔ)研究深入，發(fā)現(xiàn)腎癌具有異質(zhì)性，不同的遺傳改變及分子標(biāo)記也影響預(yù)后。表觀遺傳修飾，尤其是DNA甲基化，也被單獨(dú)或聯(lián)合經(jīng)典因素用于預(yù)測腎癌生存期。

Ras-GTP酶激活蛋白DAB2IP編碼基因在腎癌中常處于表觀沉默狀態(tài)，其沉默使HIF累積，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并導(dǎo)致靶向藥物耐藥[19]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)DAB2IP基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游的CpG1甲基化導(dǎo)致了其表達(dá)降低，并在多個(gè)隊(duì)列中驗(yàn)證了DAB2IP CpG1甲基化是ccRCC患者總生存期的獨(dú)立預(yù)測因素[20]。RASSF1(Ras相關(guān)家族成員)基因可編碼RASSF1A和RASSF1C蛋白參與細(xì)胞內(nèi)信號傳遞。KLACZ等[21]的研究發(fā)現(xiàn)RASSF1A的蛋白表達(dá)水平及啟動子甲基化水平與腎癌患者總生存期相關(guān)，該蛋白可能有抑制腫瘤的作用；而RASSF1C則與腎癌進(jìn)展和預(yù)后無關(guān)。UQCRH基因編碼一種線粒體鉸鏈蛋白，被認(rèn)為是抑癌基因，在36%的ccRCC標(biāo)本中呈現(xiàn)高甲基化，且其甲基化頻率與腫瘤分期和分級相關(guān)[6]，在蛋白水平已證明其與早期腎癌的復(fù)發(fā)和死亡存在關(guān)聯(lián)[22]。MCT4蛋白由SLC16A3基因編碼，可跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)乳酸，維持糖酵解和胞內(nèi)pH平衡，對以糖酵解為主要能量來源的腫瘤細(xì)胞十分重要。FISEL等[23]發(fā)現(xiàn)MCT4蛋白在腎癌組織中表達(dá)增加，與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)；SLC16A3基因啟動子甲基化則與生存時(shí)間呈正相關(guān)，說明SLC16A基因的甲基化及MCT4蛋白表達(dá)可判斷腎癌患者的預(yù)后。

腎癌的異質(zhì)性使單基因甲基化預(yù)測腎癌結(jié)局存在局限，故進(jìn)行了多因素預(yù)測模型研究。VAN VLODROP等[24]篩選出了GREM1、NEURL、LAD1和NEFH四種與腎發(fā)育和血管生成、Notch信號通路調(diào)控、細(xì)胞膜穩(wěn)定和細(xì)胞骨架合成相關(guān)的基因，根據(jù)啟動子甲基化基因的數(shù)目，建立ccRCC生存預(yù)測模型，具有較好的重復(fù)性。WEI等[25]通過檢測腎癌組織中與FOXE3、PITX1、RIN1、TWF2和EHBP1L1基因相關(guān)的CpG甲基化位點(diǎn)建立了預(yù)測模型，在多隊(duì)列驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)其具有較高準(zhǔn)確性，且受腫瘤內(nèi)異質(zhì)性影響較小。半胱氨酸雙加氧酶1(cysteine dioxygenas 1，CDO1)與細(xì)胞抗氧化能力相關(guān)，并通過合成?；撬衢g接參與腎血流調(diào)控，在38.3%腎癌腫瘤組織中存在該基因啟動子的甲基化。DECKERS等[26]在基于經(jīng)典預(yù)測因素的模型中增加CDO1啟動子甲基化這一變量，提高了新模型對腎癌生存預(yù)測的準(zhǔn)確性。鑒于遺傳背景的復(fù)雜性，現(xiàn)尚未建立預(yù)測準(zhǔn)確且能廣泛應(yīng)用的模型，DNA甲基化用于腎癌生存預(yù)測仍處于初步研究中。

4 DNA甲基化與腎癌的耐藥與治療

Cx32蛋白可以抑制多藥耐藥基因1的表達(dá)，增強(qiáng)長春花堿對腫瘤細(xì)胞的毒性，但在腎癌細(xì)胞中Cx32基因啟動子因高甲基化而沉默，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥[27]。SATO等[27]發(fā)現(xiàn)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯預(yù)處理腎癌細(xì)胞可恢復(fù)Cx32表達(dá)，降低腎癌的耐藥性，但結(jié)論仍有待體內(nèi)驗(yàn)證。腎癌對奧沙利鉑的耐藥主要是由于腫瘤中有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2(organic cation transporters2，OCT2)表達(dá)較少，使藥物難以進(jìn)入細(xì)胞[28]。LIU等[28]發(fā)現(xiàn)，這一效應(yīng)主要是由于OCT2基因啟動子的高甲基化使轉(zhuǎn)錄因子無法結(jié)合造成的，而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱可在體內(nèi)和體外逆轉(zhuǎn)腎癌對奧沙利鉑的耐藥。

高水平DNA甲基化除促進(jìn)腎癌對化療藥物耐藥外，也能逃避免疫系統(tǒng)對腎癌細(xì)胞的識別和殺傷。部分研究者對甲基化抑制劑單獨(dú)或聯(lián)合用于腎癌治療進(jìn)行了探索。CORAL等[29]使用毒性較小的甲基化抑制劑SGI-110在細(xì)胞水平對腎癌等腫瘤進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)它能增強(qiáng)腫瘤抗原的表達(dá)，但未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。AMATO等[30]則使用甲基化抑制劑MG98聯(lián)合干擾素治療腎癌患者，報(bào)道有一定的療效，但該研究并非隨機(jī)對照設(shè)計(jì)，還有待驗(yàn)證?，F(xiàn)階段研究已發(fā)現(xiàn)腎癌耐藥與某些基因甲基化有關(guān)，甲基化抑制劑干預(yù)也有一定效果，但相應(yīng)藥物的安全性及有效性仍需進(jìn)一步評估。

5 展 望

近年來隨表觀遺傳學(xué)研究的深入，腎癌的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，尤其是DNA甲基化，已被逐漸闡明(見表1)，但尚未形成系統(tǒng)的理論。因正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞本身存在較大的基因差異，基于血標(biāo)本DNA甲基化診斷腎癌準(zhǔn)確性較差。循環(huán)血腫瘤細(xì)胞分離提取技術(shù)使單獨(dú)檢測腫瘤細(xì)胞遺傳特性成為可能，將有助于解決這一問題。腎癌的發(fā)生過程有多種因素參與，很難單獨(dú)通過基因甲基化檢測預(yù)測患者生存期，還需與經(jīng)典臨床因素進(jìn)行整合，并在不同人群中進(jìn)行驗(yàn)證。目前已發(fā)現(xiàn)一些與腎癌發(fā)生、進(jìn)展及耐藥相關(guān)的表觀遺傳靶點(diǎn)，但現(xiàn)有的甲基化抑制劑對作用基因無靶向選擇性，其安全性存疑，難以用于臨床。因此，甲基化抑制劑的靶向化，將成為相應(yīng)藥物研發(fā)的關(guān)鍵。

表1腎癌中甲基化沉默的基因及其功能

甲基化基因?qū)δI癌影響VHL增加血管生成OVOL1,SMAD6,ASC,DAB2IP促進(jìn)細(xì)胞增殖CHD5,NELL1/2,ASC,BMP2增強(qiáng)遷移和侵襲能力CRHBP促進(jìn)轉(zhuǎn)移DAB2IP,Cx32,OCT2誘導(dǎo)耐藥

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