Kindlin-2在前列腺癌中的表達及其與臨床病理特征和預后的關系

任小強，張 鵬，張建國

(河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南科技大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南洛陽 471003)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是發(fā)生于前列腺的一組上皮性惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率分別居男性惡性腫瘤的第二位和第六位，嚴重威脅男性身體健康和生命安全[1-2]。然而影響前列腺癌疾病進展和預后的機制尚不完全明確，因此，探究前列腺癌發(fā)展的相關機制，以改善患者預后成為目前研究的熱點。黏著斑蛋白-2(Kindlin-2)參與整合素的活化過程，影響細胞增殖、凋亡及遷移[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2在肝細胞癌中高表達，與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，且影響肝細胞癌患者的預后[4]。YANG等[5]發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2能促進前列腺癌細胞的侵襲作用，表明Kindlin-2可能參與前列腺癌疾病的發(fā)生、發(fā)展。因此本研究通過檢測Kindlin-2在前列腺癌和良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)組織中的表達情況，探討Kindlin-2表達與前列腺癌臨床病理特征及預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2011年1月至2014年1月在本院確診并行根治性前列腺切除術的前列腺癌標本109例為研究對象(PCa組)，術后經(jīng)組織病理學檢查確認均為前列腺癌患者，平均年齡為(65.49±12.37)歲，Gleason評分：2～4分49例，5～7分39例，8～10分21例；臨床分期(T分期)：≤T2a期33例，T2b期25例，≥T2c期51例；前列腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)水平：<10 ng/mL為53例，10～20 ng/mL為39例，>20 ng/mL為17例；危險因素分級：低危14例，中危43例，高危52例。對所有前列腺癌患者進行為期3年的隨訪，隨訪日期截止2017年1月31日。前列腺癌組納入標準：①首次確診為前列腺癌患者；②經(jīng)前列腺電切或前列腺穿刺病理確診為前列腺癌患者；③明確前列腺癌TNM(tumor node metastasis)分期及危險因素分級患者；④臨床及隨訪資料完整；⑤行根治性前列腺切除術治療。排除標準：①排除非首次前列腺癌患者；②排除其他惡性腫瘤；③排除合并糖尿病、高血壓、冠心病等其他疾病患者；④排除術前行放化療患者；⑤排除臨床或隨訪資料不完整患者。選取同期經(jīng)前列腺穿刺或前列腺電切確診為BPH標本93例作為對照(BPH組)，平均年齡為(63.95±13.51)歲，且排除合并糖尿病、高血壓、冠心病及其他惡性腫瘤的可能。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過，標本的采集和研究過程均符合赫爾辛基宣言。所有入選研究對象均被告知研究目的后自愿加入研究，并簽訂知情同意書。

1.2主要試劑與儀器一抗(anti-Kindlin-2)、二抗、免疫組化SP試劑盒及蘇木素染色劑，購自福建邁新生物公司；鏈霉素抗生物蛋白-過氧化物酶溶液，購自福州邁新生物技術開發(fā)公司；普通光學顯微鏡，購自日本Olympus公司；組織芯片制作儀、石蠟切片機購自德國MICROM公司。

1.3實驗方法組織標本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，切片4 μm/片，在典型位置處做好標記后，在供體蠟塊對應部位作為取材位置。采用微陣列儀在空白受體蠟塊相應位置打孔(直徑0.1 cm，間距0.1 cm，深度0.2～0.3 cm)，采用組織芯片制作儀在供體蠟塊對應位置采集前列腺組織切片(直徑1.5 mm，采樣長度0.8 cm)，并置于空白受體蠟塊對應小孔中，記錄各組織樣本所在微陣，每例前列腺組織采集1～2個位點，重復以上操作。將帶有組織芯片的蠟塊置于55 ℃恒溫銅板，保持30 min，將其嵌入另一蠟塊，待完全融合后，重復以上操作。共制作3個蠟塊，包括109例前列腺癌組織和93例良性前列腺增生組織，分別記作1、2、3，蠟塊凝固后切片。嚴格按照免疫組化二步法操作說明進行實驗：常規(guī)脫蠟、水化處理，0.3%H2O2孵育20 min；高溫組織修復，加入一抗(Anti- Kindlin-2，1∶50)，4 ℃過夜；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗3次，10 min/次；加入帶有生物素標記的二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育40 min；加入鏈霉素抗生物蛋白-過氧化物酶溶液，37 ℃孵育35 min；加入二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)試劑，顯色4 min；蘇木素染色劑復染；梯度脫水、透明、中性膠封片。置于光學顯微鏡下分析染色結果。

1.4結果判定Kindlin-2陽性染色表現(xiàn)為細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒。每張切片隨機選取10個高倍鏡視野(×200)進行觀察，參照文獻中方法對細胞染色情況及陽性細胞比例進行評分[6]：①按細胞的染色情況評分：未染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；②按陽性細胞比例評分：≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。采用積分法，即最終得分=染色得分×陽性細胞比例得分，對染色結果進行判定：0～6分，為低表達；7～12分，為高表達。

2 結 果

2.1前列腺癌患者中Kindlin-2蛋白的表達水平免疫組化結果顯示，Kindlin-2蛋白主要定位于細胞質(zhì)，陽性細胞呈棕黃色(圖1)。前列腺癌組織Kindlin-2蛋白高表達率為72.48%，明顯高于良性前列腺增生組織Kindlin-2蛋白高表達率30.11%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表1)。

表1 不同前列腺組織中Kindlin-2蛋白表達水平比較 (例)

圖1不同前列腺組織中Kindlin-2蛋白的表達(免疫化學染色法，×200)

A：前列腺癌組織；B：良性前列腺增生組織。

2.2Kindlin-2蛋白表達與前列腺癌患者臨床參數(shù)之間的關系前列腺癌患者癌組織中Kindlin-2蛋白表達水平與患者T分期、淋巴結轉(zhuǎn)移情況、遠處轉(zhuǎn)移情況、PSA水平、Gleason評分及危險程度有關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與患者年齡、吸煙情況無關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

2.3前列腺癌組織中Kindlin-2表達與患者生存率之間的關系前列腺癌患者中Kindlin-2高表達者3年存活率為69.62%(55/79)，明顯低于Kindlin-2低表達者3年存活率90.00%(27/30)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

表2 Kindlin-2蛋白表達與患者臨床參數(shù)之間的關系 [例(%)]

2.4影響前列腺癌患者預后的Cox回歸分析本研究將患者Kindlin-2表達、年齡分層、吸煙情況、PSA水平、Gleason評分、臨床分期(T)、淋巴結轉(zhuǎn)移情況(N)、遠處轉(zhuǎn)移情況(M)、危險因素分級等因素，納入影響前列腺癌患者預后的Cox回歸分析模型。單因素分析結果表明，Kindlin-2表達、PSA水平、Gleason評分、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和危險因素分級均是影響患者預后的危險因素。多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2表達、PSA水平、Gleason評分、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、危險因素分級是影響患者預后的獨立危險因素。見表3。

表3影響前列腺患者預后單因素和多因素Cox回歸分析結果

變量單因素HR95%置信區(qū)間P值多因素HR95%置信區(qū)間P值年齡1.3490.367～4.9590.247---吸煙情況1.7560.481～6.4110.129---Kindlin-2表達4.1341.768～9.6660.0002.3471.168～4.7160.000PSA水平1.9871.073～3.6800.0051.2171.097～1.3500.009Gleason評分2.9761.175～7.5380.0001.7341.076～2.7940.000臨床分期1.4461.067～1.9600.0081.1391.057～1.2270.009淋巴結轉(zhuǎn)移1.5261.094～2.1290.0071.2251.108～1.3540.008遠處轉(zhuǎn)移1.6071.278～2.0210.0071.1371.067～1.2120.009危險因素分級3.2791.437～7.4820.0002.1581.130～4.1210.000

圖2前列腺癌組織中Kindlin-2表達與患者生存率之間的關系

3 討 論

前列腺癌具有典型的異質(zhì)性:一些前列腺癌早期癥狀不明顯，且疾病發(fā)展較慢；另一些則發(fā)展迅速，甚至出現(xiàn)骨及其他組織器官轉(zhuǎn)移，導致死亡。雖然前列腺癌的診治技術已取得一定完善和進步，但前列腺癌仍然是嚴重威脅男性生命健康的惡性腫瘤之一。2015年，國家癌癥中心公布，我國約有6.03萬例前列腺癌患者，其中死亡2.66萬例，死亡率高達44.11%[7]。探索前列腺癌的發(fā)病機制，尋找有效生物分子標記，可為前列腺癌的臨床診斷和治療提供新思路。

黏著斑蛋白-2(Kindlin-2)又名絲裂誘導基因(mitogen-inducible gene-2，MIG-2)，屬于黏著斑蛋白家族，存在于多種細胞、組織中，參與整合素的活化過程，還可與黏附結構蛋白相互作用，參與調(diào)解細胞增殖、凋亡、遷移等生理過程[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2在乳腺癌[10]、直腸癌[11]、肝細胞癌[12]等多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，促進腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。劉冬等[13]發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2在肝癌組織中的表達顯著升高，且與腫瘤直徑、門靜脈侵犯及腫瘤微血管生成相關。XUE等[14]發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2的表達與乳腺癌患者乳腺結節(jié)的膠原強度和最大彈性呈正相關，且Kindlin-2表達與乳腺癌淋巴結轉(zhuǎn)移有關。YOSHIDA等[15]發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2在胰腺癌組織中高表達，參與胰腺癌疾病的發(fā)展。SHEN等[16]發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且其表達與患者的TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、腫瘤細胞侵襲、生存率等有關。YANG等[5]利用RNAi技術發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Kindlin-2表達可有效抑制前列腺癌細胞系的侵襲能力，過表達Kindlin-2可促進前列腺癌細胞系的侵襲能力，推測Kindlin-2具有促進腫瘤細胞侵襲的作用。本研究對109例前列腺癌患者前列腺組織標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者Kindlin-2高表達率顯著增高，與Kindlin-2在乳腺癌、胰腺癌、胃癌等惡性腫瘤中的表達模式一致，提示Kindlin-2高表達可能參與前列腺癌的發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，臨床分期T3～T4期、有淋巴結轉(zhuǎn)移、有遠處轉(zhuǎn)移患者Kindlin-2高表達率明顯高于T1～T2期、無淋巴結轉(zhuǎn)移、無遠處轉(zhuǎn)移患者；Kindlin-2在腫瘤組織中高表達率隨患者血清PSA水平、Gleason評分及危險因素級別的升高而升高，表明Kindlin-2表達與患者血清PSA水平、Gleason評分、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、危險因素分級有關。提示Kindlin-2參與前列腺癌疾病的發(fā)展，與疾病的病理分化有關。

近年來，對于前列腺癌的診斷和治療方法已取得很大進步，然而其死亡率依然很高[17]，因此，亟需尋找有效生物標志物來判斷前列腺癌患者預后情況。MAHAWITHITWONG等[18]發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2陽性表達的胰腺癌患者生存率明顯低于陰性表達患者，是不良預后的獨立影響因素。YAN等[19]發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2高表達與透明細胞腎細胞癌患者的血液轉(zhuǎn)移和不良預后密切相關。WU等[20]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者中Kindlin-2高表達者的生存時間明顯短于Kindlin-2低表達者，是導致不良預后的獨立因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者Kindlin-2高表達者的3年存活率明顯低于Kindlin-2低表達者。進一步對影響患者3年生存率的相關因素進行分析，單因素分析結果表明，Kindlin-2表達、PSA水平、Gleason評分、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和危險因素分級是影響患者預后的危險因素。多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2表達、PSA水平、Gleason評分、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、危險因素分級是影響患者預后的獨立危險因素。本研究發(fā)現(xiàn)Kindlin-2高表達可降低前列腺癌患者3年生存率，影響前列腺癌患者生存情況。推測Kindlin-2表達情況可用于診斷前列腺癌及預測患者預后情況。

綜上所述，Kindlin-2在前列腺癌患者中高表達，與前列腺癌患者血清PSA水平、Gleason評分、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、危險因素分級有關，且影響患者3年生存情況，推測Kindlin-2可作為診斷前列腺癌及判斷患者預后的有效生物標志物。

參考文獻：

[1] 逄城，朱剛.原發(fā)灶減瘤根治性前列腺切除術治療前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的研究進展[J].中華泌尿外科雜志，2016，37(1):73-75.

[2] 楊羅，李響，魏強.前列腺癌PSA篩查的價值和爭議[J].中華泌尿外科雜志，2013，34(2):150-151.

[3] CALDERWOOD DA,CAMPBELL ID,CRITCHLEY DR.Talins and kindlins：partners in integrin-mediated adhesion[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2013，14(8)：503-517.

[4] GE YS，LIU D，JIA WD，et al.Kindlin-2：a novel prognostic biomarker for patients with hepatocellular carcinoma[J].Pathol Res Pract，2015，211(3)：198-202.

[5] YANG J，PAN T，YANG H，et al.Kindlin-2 promotes invasiveness of prostate cancer cells via NF-κ-dependent upregulation of matrix metalloproteinases[J].Gene，2016，576(1 Pt 3)：571-576.

[6] 許良中，楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準[J].中國癌癥雜志，1996，6(4):229-231.

[7] WILSON KM，GIOVANNUCCI EL，MUCCI LA.Lifestyle and dietary factors in the prevention of lethal prostate cancer[J].Asian J Androl.2012，14(3):365-374.

[8] HIRBAWI J，BIALKOWSKA K，BLEDZKA KM，et al.The extreme C-terminal region of kindlin-2 is critical to its regulation of integrin activation[J].J Biol Chem，2017，292(34)：14258-14269.

[9] ROGNONI E，RUPPERT R，F(xiàn)SSLER R.The kindlin family：functions，signaling properties and implications for human disease[J].J Cell Sci，2016，129(1)：17-27.

[10] SOSSEY-ALAOUI K，PLUSKOTA E，BIALKOWSKA K，et al.Kindlin-2 regulates the growth of breast cancer tumors by activating csf-1-mediated macrophage infiltration[J].Cancer Res，2017，77(18)：5129-5141.

[11] REN Y，JIN H，XUE Z，et al.Kindlin-2 inhibited the growth and migration of colorectal cancer cells[J].Tumour Biol，2015，36(6)：4107-4114.

[12] LIN J，LIN W，YE Y，et al.Kindlin-2 promotes hepatocellular carcinoma invasion and metastasis by increasing Wnt/β-catenin signaling[J].J Exp Clin Cancer Res，2017，36(1)：134-141.

[13] 劉冬，葛勇勝，許戈良,等.Kindlin-2在肝細胞癌中的表達及其與腫瘤血管生成的關系[J].安徽醫(yī)科大學學報，2014，17(2):206-209.

[14] XUE X，LI J，WAN W，SHI X，ZHENG Y.Kindlin-2 could influence breast nodule elasticity and improve lymph node metastasis in invasive breast cancer[J].Sci Repor,2017,7(1):6753-6765.

[15] YOSHIDA N，MASAMUNE A，HAMADA S，et al.Kindlin-2 in pancreatic stellate cells promotes the progression of pancreatic cancer[J].Cancer Lett，2017，390(5)：103-114.

[16] SHEN Z，YE Y，DONG L，et al.Kindlin-2：a novel adhesion protein related to tumor invasion，lymph node metastasis，and patient outcome in gastric cancer[J].Am J Surg，2012，203(2)：222-229.

[17] 殷長軍，邵鵬飛，秦超.經(jīng)腹腔途徑腹腔鏡前列腺癌根治術并發(fā)癥的預防及處理[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志，2013，18(5):421-424.

[18] MAHAWITHITWONG P，OHUCHIDA K，IKENAGA N，et al.Kindlin-2 expression in peritumoral stroma is associated with poor prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Pancreas，2013，42(4)：663-669.

[19] YAN M，ZHANG L,WU Y，et al.Increased expression of kindlin-2 is correlated with hematogenous metastasis and poor prognosis in patients with clear cell renal cell carcinoma[J].FEBS Open Bio，2016，6(7)：660-665.

[20] WU J，YU C，CAI L，et al.Effects of increased Kindlin-2 expression in bladder cancer stromal fibroblasts[J].Oncotarget，2017，8(31)：50692-50703.