腫瘤酸性微環(huán)境促進(jìn)腎癌細(xì)胞株769-P體外侵襲及其lncRNA表達(dá)譜分析

殷喜豐，孫 浩，陳兵海

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇鎮(zhèn)江 212000)

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性疾病，2012年全球新發(fā)腎癌338 000例，死亡143 000例，分別占惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率的2.4%和1.7%，居惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率第14位和第16位，且呈逐年上升趨勢[1]。腎細(xì)胞癌死亡率相對較高，這一特性可能與其臨床特點(diǎn)密切相關(guān)。早期腎細(xì)胞癌患者通常缺乏典型臨床癥狀，導(dǎo)致病程發(fā)展隱匿，約有30%的患者因病理性骨折等轉(zhuǎn)移癥狀初診，40%～50%的患者在確診腎細(xì)胞癌時已發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。在導(dǎo)致臨床腫瘤患者死亡的眾多影響因素中，腫瘤轉(zhuǎn)移是主因之一。惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移不單與其自身的遺傳特性有關(guān)，更受其所處微環(huán)境影響。后者牽涉到惡性腫瘤細(xì)胞與其胞外酸性微環(huán)境等因素間的彼此作用[3]。研究顯示，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的生理生化過程可概括為：①惡性腫瘤細(xì)胞粘附細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)；②分泌酸及酸相關(guān)蛋白水解酶降解重塑ECM，向周圍組織侵襲；③通過加強(qiáng)自身運(yùn)動性，向周圍組織遷移[4]。由此可見，癌細(xì)胞的侵襲作用有助于其向正常組織遷移，這一步驟是惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的重要環(huán)節(jié)，而腫瘤胞外酸性微環(huán)境恰恰與其有著密切的聯(lián)系[3]。

截至目前，腎癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚無定論，且酸性微環(huán)境在腎癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用也鮮有報道。因此，本研究將通過使用pH6.6的酸性培養(yǎng)基體外模擬腫瘤酸性微環(huán)境并培養(yǎng)腎癌細(xì)胞769-P，觀察腫瘤胞外酸性微環(huán)境對腎癌細(xì)胞769-P侵襲性的調(diào)節(jié)作用，并分析其長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)表達(dá)譜變化。

1 材料與方法

1.1材料腎癌769-P細(xì)胞株購自生工上海細(xì)胞庫；熒光定量PCR相關(guān)引物均購自生工合成部；胎牛血清購自美國BI公司(Cat No.BISH0930)；細(xì)胞凍存培養(yǎng)基(RPMI)及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)均購自美國HyClone公司(Cat No.SH30809.01、Cat No.SH30256.01)；青鏈霉素混合液、L-谷氨酰胺、胰酶均購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司(Cat No.KGY0023、Cat No.KGY0043、Cat No.KGY0012)；哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)和4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)均購自南京奧多福尼生物技術(shù)有限公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司(Cat No.RR037A)；AceQ qPCR SYBER Green Master Mix、RNA快速提取試劑盒均購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司(Cat No.Q111-02、Cat No.RA105-01)；transwell小室(內(nèi)徑6.5 mm，孔徑8.0 μm，已鋪Matrigel基質(zhì)膠)購自美國Coring公司(Cat No.354480)。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)液制備方法 每7.2 mL含10% 胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的RPMI全營養(yǎng)培養(yǎng)基添加0.5 mol/L的PIPES和0.5 mol/L的HEPES各400 μL，配合使用NaOH、HCl調(diào)節(jié)pH值至7.4或6.6，充分混勻后過濾備用[5]。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)方法及實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞用含10% FBS的RPMI全營養(yǎng)培養(yǎng)液(未調(diào)整pH值)，于37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數(shù)生長期細(xì)胞傳代至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，編號1～6號，加入含10% FBS的RPMI全營養(yǎng)培養(yǎng)液2 mL。隔夜培養(yǎng)至細(xì)胞密度均為60%左右，將各孔培養(yǎng)液換成含10% FBS的RPMI全營養(yǎng)培養(yǎng)液(pH值為7.4)1 mL，以此換液時間點(diǎn)為0點(diǎn)，向2～6號孔按時間順序換液加入含10% FBS的RPMI全營養(yǎng)培養(yǎng)液(pH值為6.6)1 mL，形成pH6.6-RPMI培養(yǎng)液作用時間梯度為0、0.5、1、2、4、8 h的6組細(xì)胞。

1.2.3RNA提取、cDNA合成及實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)方法 按RNA快速抽提試劑盒說明書步驟提取各組細(xì)胞RNA，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將上述所得cDNA用于FQ-PCR檢測。根據(jù)AceQ qPCR SYBER Green Master Mix試劑盒說明書加入各組分形成20μL體系，標(biāo)準(zhǔn)兩步法行FQ-PCR。每組GAPDH、Snail及E-cadherin各設(shè)3個復(fù)孔。用-ΔΔCt值表示Snail及E-cadherin基因相對表達(dá)倍數(shù)[6]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4transwell腫瘤細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) 將對照組/實(shí)驗(yàn)組腎癌細(xì)胞于1 mL pH 7.4、pH6.6-RPMI全營養(yǎng)培養(yǎng)液中作用4 h，換液為無血清、無雙抗、無谷氨酰胺的“三無”RPMI培養(yǎng)基1 mL饑餓2 h。制備對照組及實(shí)驗(yàn)組侵襲小室(上室已鋪膠)，下室各加入含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液600 μL。取上述對照組孔或?qū)嶒?yàn)組孔中指數(shù)增殖期細(xì)胞，重懸于“三無”RPMI培養(yǎng)液，多次計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度，在對應(yīng)組別的上室中加入含2×104個細(xì)胞的無血清細(xì)胞懸液200 μL。溫箱培養(yǎng)24 h，棄transwell侵襲小室套件內(nèi)液體，用棉球擦除上室內(nèi)殘留細(xì)胞及基質(zhì)膠，經(jīng)冰預(yù)冷甲醇固定、0.05%結(jié)晶紫著色、PBS清洗染液，光學(xué)顯微鏡下拍照，隨機(jī)觀測5個視野(×10)并進(jìn)行計(jì)數(shù)。將小室套件移至全新的12孔培養(yǎng)板，加入10%乙酸1 mL，室溫靜置30 min，待結(jié)晶紫全部溶解，移液器吹勻，將對照組及實(shí)驗(yàn)組溶解有結(jié)晶紫的乙酸溶液移至96細(xì)胞培養(yǎng)板孔，每組別各設(shè)立5個復(fù)孔，使用酶標(biāo)儀測算各孔560 nm波長處吸光度值并記錄[7]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5lncRNA表達(dá)譜芯片 使用pH7.4-RPMI或pH6.6-RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)腎癌細(xì)胞4 h，抽提實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜檢測。根據(jù)qPCR試劑說明書加入各成分及cDNA(待檢測的lncRNA及內(nèi)參的前后引物預(yù)混液除外)，分別向96孔中加入90種lncRNA及6種內(nèi)參的前后引物預(yù)混液形成20 μL體系，標(biāo)準(zhǔn)兩步法行FQ-PCR，檢測lncRNA表達(dá)[8]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。相關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)處理后使用Morpheus網(wǎng)頁軟件(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)繪制熱圖。

2 結(jié) 果

2.1腫瘤胞外酸性微環(huán)境上調(diào)腎癌細(xì)胞Snail基因表達(dá)水平，其下游E-cadherin基因表達(dá)降低，兩者呈負(fù)相關(guān)。在FQ-PCR實(shí)驗(yàn)中，各組的內(nèi)參GAPDH、Snail及E-cadherin基因均設(shè)立3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示，pH6.6-RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)0、0.5、1、2、4、8 h腎癌細(xì)胞769-P Snail基因的相對表達(dá)倍數(shù)分別為(1±0)、(0.900±0.001)、(0.931±0.303)、(1.354±0.331)、(1.569±0.010)、(1.084±0.363)，其中pH6.6-RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h組，其腎癌細(xì)胞769-P Snail基因表達(dá)較pH6.6-RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)培養(yǎng)0 h組即pH7.4-RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h組明顯增高，下游E-cadherin基因表達(dá)相對倍數(shù)為(1±0)、(0.532±0.131)，呈下降趨勢，兩者負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1酸性微環(huán)境腎癌細(xì)胞Snail及E-cadherin的表達(dá)

A:pH6.6-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)時間梯度Snail基因表達(dá)情況；B:pH6.6-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h E-cadherin基因表達(dá)情況；與pH6.6培養(yǎng)液培養(yǎng)0 h組即pH7.4培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h組比較，*P<0.05。

2.2腫瘤胞外酸性微環(huán)境提高腎癌細(xì)胞的侵襲能力在transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)中，pH6.6-RPMI/pH7.4-RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h組經(jīng)0.05%結(jié)晶紫染色，鏡下拍照隨機(jī)5個視野計(jì)數(shù)，10%乙酸脫色后，取100 μL/孔至96孔板，每組均設(shè)置5個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示，pH6.6-RPMI/pH7.4-RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(398.800±20.067)、(212.400±25.016)，OD 560 nm處吸光度值分別為(0.230±0.039)、(0.121±0.019)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

2.3腫瘤胞外酸性微環(huán)境引起腎癌細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜改變在lncRNA表達(dá)譜芯片篩選實(shí)驗(yàn)中，pH6.6-RPMI、pH7.4-RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h組均各重復(fù)3次。數(shù)據(jù)結(jié)果以pH6.6-4 h組較pH7.4-4h組的lncRNA相對表達(dá)倍數(shù)表示，選擇3倍以上或1/3倍以下為表達(dá)顯著上調(diào)或下調(diào)的lncRNA。其中BC040587、KCNQ1DN、PCAT-43的相對表達(dá)倍數(shù)分別為3.723、4.669、4.074，呈上調(diào)趨勢；CTBP1-AS、MEG3的相對表達(dá)倍數(shù)分別為0.081、0.331，呈下調(diào)趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)，數(shù)據(jù)經(jīng)Morpheus網(wǎng)頁軟件處理，以熱圖呈現(xiàn)。

圖2酸性微環(huán)境腎癌細(xì)胞的侵襲表現(xiàn)(結(jié)晶紫染色，×10)

A:pH7.4-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)鏡下觀；B:pH6.6-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)鏡下觀；C:pH7.4/6.6-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h組侵襲細(xì)胞個數(shù)；D:pH7.4/6.6-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h組560 nm處吸光度值；與pH7.4培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h組比較，*P<0.05。

圖3 酸性微環(huán)境影響腎癌lncRNA表達(dá)

A:pH7.4/6.6-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h組lncRNA表達(dá)譜熱圖；B:pH7.4/6.6-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h組lncRNA相對表達(dá)倍數(shù)；與pH7.4培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h組比較，*P<0.05。

3 討 論

惡性腫瘤早已發(fā)展成為威脅人類健康及生命的重要疾病，其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移更是讓患者徹底失去治愈機(jī)會，使得疾病進(jìn)入終末期，并最終導(dǎo)致患者死亡。探索腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)機(jī)制，對于腫瘤的診治意義非凡。截至目前，相關(guān)研究表明腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移涉及到諸多的生理生化步驟，過程極其復(fù)雜而精密，其不僅與腫瘤自身的遺傳特性息息相關(guān)，更受其所處微環(huán)境的影響。其中，惡性腫瘤胞外特殊的酸性微環(huán)境與其侵襲轉(zhuǎn)移能力之間的聯(lián)系一直是研究的熱門。在早期的探索研究過程中，學(xué)者們證明了正常狀態(tài)下的組織細(xì)胞其胞外環(huán)境的酸堿度跟腫瘤胞外環(huán)境的酸堿度存在較為明顯的差異，前者胞外環(huán)境的pH值通常偏堿性，在7.2～7.4范圍內(nèi)，而后者的胞外環(huán)境往往偏酸性，pH值在6.5～6.9范圍內(nèi)[9]。一方面，腫瘤細(xì)胞因其高葡萄糖攝取量的特點(diǎn)，縱使在氧氣富足的條件下仍可經(jīng)無氧糖酵解產(chǎn)生乳酸，即瓦爾堡效應(yīng)；另一方面，乏氧條件下的癌細(xì)胞可通過一系列反應(yīng)催化二氧化碳和水生成碳酸[10- 11]。以上兩種酸性物質(zhì)在腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)過度生成，可引起胞內(nèi)pH降低，危害腫瘤細(xì)胞本身，但在長期的進(jìn)化過程中，腫瘤細(xì)胞形成了囊泡型H+ATP酶(Vacuolar H+-ATPase，VHA)、鈉氫交換體1(Na+/H+exchanger 1，NHE1)和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(monocarboxylate transporter，MCT) 等pH調(diào)節(jié)蛋白，可將胞內(nèi)生成過多的碳酸及乳酸運(yùn)輸至胞外，這一轉(zhuǎn)運(yùn)過程不單使得腫瘤細(xì)胞的胞外酸性微環(huán)境得以產(chǎn)生，也保持了腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)pH的穩(wěn)定[12]。后續(xù)探索顯示，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的諸多生理生化步驟深受其胞外酸性微環(huán)境的影響。體內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，酸性培養(yǎng)條件下生長的癌細(xì)胞，其侵襲性顯著提高[13]。另一方面，惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移跟其本身的遺傳特點(diǎn)亦息息相關(guān)，如癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)改變。其中，Snail基因在眾多腫瘤組織中的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，其被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因之一。Snail作為鋅指蛋白超家族的第1個成員，最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，定位于人染色體第20號染色體20q12.3上。其影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的可能作用機(jī)制可概括為：①Snail基因通過對黏附分子E鈣黏蛋白的下調(diào)作用，提高腫瘤細(xì)胞侵襲性；②Snail基因可調(diào)節(jié)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞侵襲；③Snail可通過誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，提高腫瘤細(xì)胞侵襲性。而在腎癌中，Snail正是通過調(diào)控黏附分子E鈣黏蛋白的生成，影響腎癌的侵襲能力[14-15]。本研究通過FQ-PCR檢測經(jīng)pH6.6培養(yǎng)液培養(yǎng)不同時間后，Snail基因及其下游E-cadherin基因表達(dá)改變，并結(jié)合transwell腫瘤細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證Snail及E-cadherin基因表達(dá)改變的細(xì)胞組在侵襲能力上的相應(yīng)變化。結(jié)果表明，pH6.6培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h組腎癌細(xì)胞769-P Snail基因的表達(dá)水平較pH6.6培養(yǎng)液培養(yǎng)0 h組即pH7.4培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h組上升趨勢最明顯，其下游E-cadherin基因表達(dá)降低，兩者呈負(fù)相關(guān)，且存在顯著的差異(P<0.05)；transwell腫瘤細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)pH6.6細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h的腎癌細(xì)胞769-P，其侵襲性顯著增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報道，我們可以假設(shè)：腫瘤細(xì)胞酸性微環(huán)境可上調(diào)腎癌細(xì)胞769-P Snail基因表達(dá)水平，引起黏附分子E-cadherin家族相關(guān)蛋白表達(dá)下降，從而增強(qiáng)其侵襲能力。

近些年研究發(fā)現(xiàn)，多種lncRNA的表達(dá)與癌細(xì)胞的形成、進(jìn)展、侵襲密切相關(guān)，且在此過程中扮演著重要的角色[16]。本研究lncRNA表達(dá)譜芯片篩選結(jié)果顯示，相對于pH7.4培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h組，經(jīng)pH6.6培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h后，腎癌細(xì)胞769-P中有BC040587、KCNQ1DN、PCAT-43三種lncRNA表達(dá)水平上調(diào)，CTBP1-AS、MEG3兩種lncRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BC040587定位于染色體3q13.31，該位點(diǎn)含有頻繁的焦點(diǎn)拷貝數(shù)改變(copy number alterations，CNAs)以及雜合性缺失。在原發(fā)性骨肉瘤樣本中，BC040587的表達(dá)缺失與腫瘤患者較差的生存率密切相關(guān)[17]。CHI等[18]發(fā)現(xiàn)，BC040587在乳腺癌樣本中的表達(dá)較對照組樣本低，該趨勢與乳腺癌患者較差的腫瘤分化程度、較低的總體生存率及不良預(yù)后存在顯著相關(guān)性。XIN等[19]發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)離H19 / IGF2區(qū)存在的KCNQ1DN可能與腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。在前列腺癌細(xì)胞中，PCAT通過cell-myc(cMyc)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，其調(diào)控作用有賴于cMyc蛋白的穩(wěn)定性表達(dá)。PCAT-cMyc關(guān)系是通過Myc3′非翻譯區(qū)(Untranslated Region，UTR)的轉(zhuǎn)錄后活性介導(dǎo)的。通過miR-36673p靶向下調(diào)PCAT能夠逆轉(zhuǎn)其對cMyc的穩(wěn)定作用，從而影響前列腺癌細(xì)胞的增殖。PCAT-43作為PCAT家族中的一員，具有相似的作用[20]。在前列腺癌細(xì)胞中，CTBP1-AS促進(jìn)前列腺癌的AR轉(zhuǎn)錄活性和細(xì)胞周期。此外，CTBP1-AS還促進(jìn)激素依賴性和去勢抵抗性腫瘤生長[21]。在甲狀腺癌中，過表達(dá)MEG3可通過負(fù)調(diào)控Rac1蛋白的活化，抑制TPC-1和HTH83甲狀腺癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲，而PC-3細(xì)胞中活化的Rac1蛋白與前列腺癌的遷移侵襲息息相[7，22]。LIN等[23]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中MEG3的表達(dá)水平較癌旁組織低，通過在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)MEG3，發(fā)現(xiàn)MDM2轉(zhuǎn)錄水平降低并激活抑癌基因p53轉(zhuǎn)錄，最終抑制了癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，酸性微環(huán)境可引起腎癌細(xì)胞769-P Snail基因及其下游E-cadherin的表達(dá)改變，從而提高腎癌細(xì)胞的侵襲性。該過程中伴隨著lncRNA BC040587、KCNQ1DN、PCAT-43、CTBP1-AS、MEG3的異常表達(dá)，上述表達(dá)改變的5種lncRNA均有可能作為Snail的上游基因，調(diào)控其表達(dá)增高，最終引起腎癌細(xì)胞769-P侵襲性的增強(qiáng)。例如，本研究中腎癌細(xì)胞769-P經(jīng)pH6.6酸性培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h后，MEG3表達(dá)較pH7.4培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h組降低，低表達(dá)MEG3的腎癌細(xì)胞769-P中可能伴有抑癌基因p53轉(zhuǎn)錄降低，Rac1蛋白表達(dá)增高[22- 23]。p53功能喪失或突變可通過去抑制Snail蛋白質(zhì)表達(dá)和活性來促進(jìn)癌細(xì)胞EMT，最終提高癌細(xì)胞的侵襲性[24]。在前列腺癌細(xì)胞22Rv1中，Snail對細(xì)胞侵襲性的調(diào)控受PI3K/AKT-Rac1途徑傳導(dǎo)。過表達(dá)Snail的前列腺癌細(xì)胞中，Rac1活性增加，癌細(xì)胞侵襲能力提高。使用Rac1抑制劑NSC23766可抑制Snail介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲。同樣，在過表達(dá)Snail的前列腺癌細(xì)胞22Rv1中，PI3K/AKT通路活性增加。使用PI3K/AKT抑制劑LY294002可降低癌細(xì)胞侵襲能力，Rac1活性也顯著降低[25]。由此假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)酸性環(huán)境作用后的腎癌細(xì)胞769-P可能通過MEG3-p53-Snail途徑或MEG3-PI3K/AKT Rac1-Snail途徑調(diào)控癌細(xì)胞侵襲。同理，上述篩選所得的lncRNA均有可能通過影響下游靶基因或者相關(guān)蛋白表達(dá)，從而調(diào)控腎癌細(xì)胞769-P的侵襲性。其中具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，本研究結(jié)果顯示，酸性微環(huán)境可提高腎癌細(xì)胞769-P的侵襲性，其機(jī)制可能與lncRNA BC040587、KCNQ1DN、PCAT-43、CTBP1-AS、MEG3的表達(dá)改變有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

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