薺菜雌蕊調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SPT基因的克隆與擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

張莉芳，楊正修，張學(xué)文，龍炎杏，趙 燕

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

植物雌蕊發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)及其調(diào)控研究是植物發(fā)育生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近年來(lái)，通過(guò)Ac／Ds、T－DNA插入等方法獲得的擬南芥雌蕊發(fā)育異常突變體不斷增加，為雌蕊發(fā)育過(guò)程及其調(diào)控的研究提供了豐富的材料，并取得了一些重要的研究成果［1］。雌蕊的發(fā)育最初是心皮的形成，ABCDE模型中相關(guān)C與E類基因共同作用是心皮發(fā)育必要的條件，而這些基因編碼的產(chǎn)物絕大多數(shù)都存在MADS保守區(qū)域，同時(shí)具有調(diào)控其他基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的能力。Alvarez等［2］發(fā)現(xiàn)，擬南芥心皮發(fā)育主要受SPATULA（SPT），CRABS CLAW（CRC）及AGAMOUS（AG）基因的控制。

在植物花器官發(fā)育的過(guò)程中，SPATULA是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)并起重要作用的基因，其編碼一個(gè)bHLH的轉(zhuǎn)錄因子。Alvarez等［2］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥spt突變體與野生型比較其心皮變窄變短。Heisler等通過(guò)原位雜交技術(shù)證實(shí)SPT在花的分生組織頂部開(kāi)始表達(dá)，其分生組織隨后發(fā)育成雌蕊原基，SPT的表達(dá)也達(dá)到最高［3］。隨著進(jìn)一步發(fā)育成隔膜、柱頭、花柱和輸送管直至開(kāi)花前，均可在隔膜、柱頭上檢測(cè)到SPT的表達(dá)，甚至在角果瓣上仍有表達(dá)［4］。Alvarez等［2］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)SPT功能的缺少會(huì)導(dǎo)致隔膜及頂端心皮融合缺陷，影響柱頭組織的發(fā)育及傳輸束的喪失，說(shuō)明SPT在植物整個(gè)雌蕊發(fā)育過(guò)程中是必不可少的。

薺菜（Capsella bursa－pastoris）與擬南芥（Arabidopsis thaliana）同為十字花科植物，兩者的生長(zhǎng)習(xí)性與植株形態(tài)具有很大的相似性，但它們?cè)谛钠ば螒B(tài)上存在顯著差異，薺菜為三角形的短角果（silicle），而擬南芥為長(zhǎng)柱形的長(zhǎng)角果（silique）。為研究薺菜雌蕊（心皮）形態(tài)建成的分子特異性，趙燕等從擬南芥、薺菜中克隆了心皮發(fā)育相關(guān)基因CRABS CLAW（CRC）CRC，對(duì)擬南芥和薺菜進(jìn)行了交互轉(zhuǎn)化［5，6］，但薺菜SPT基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)同源克隆法從野生型薺菜花蕾中克隆了薺菜的SPT基因，經(jīng)序列分析，同源比對(duì)，構(gòu)建了表達(dá)載體pWM101－35S：：CbSPT，轉(zhuǎn)化擬南芥，從篩選的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中觀察到了大量的心皮形態(tài)變異，為揭示十字花科植物心皮的形態(tài)建成及與關(guān)鍵基因SPT的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）為 Columbia生態(tài)型；薺菜（Capsella bursa－posteris）為野生型。載體pMD18T－vector（TAKARA公司），大腸桿菌DH5α菌株，農(nóng)桿菌GV3101，Ti質(zhì)粒pWM101，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 薺菜CbSPT基因的克隆

取薺菜植株主花序上的幼嫩花蕾置4℃低溫處理后，采用TAKARA公司RNA提取試劑盒分離總RNA，以總 RNA為模板，用 RT－PCR試劑盒（TAKARA公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank收錄的擬南芥SPATULA（SPT）基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物：F：5＇－TGTAATGATATCACAGAGAGAAGA－3＇；R：5＇－TCAAGTAATTCGATCTTTTAGGTC－3＇（引物由華大基因合成）。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1.5 min，26個(gè)循環(huán)后72℃終延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段大小，將回收的擴(kuò)增片段克隆到pMD18－T載體，獲得pMD18－CbSPT，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，在含有 IPTG，X－gal的 LB／Amp平板上篩選白色菌落，對(duì)重組子進(jìn)行菌落PCR及酶切鑒定，序列送華大基因測(cè)序。

1.2.2 薺菜CbSPT基因的序列分析

序列比對(duì)在ClustalX軟件上進(jìn)行，ORF查找及其ORF翻譯，GenBank BLAST和核酸序列的CDD搜索在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行，并將獲得的基因命名為薺菜心皮發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CbSPT（GenBank：KY210219.1）。氨基酸的比對(duì)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，親疏水性的檢測(cè)等在DNAMAN軟件上進(jìn)行。

1.2.3 植物表達(dá)載體pWM101－35S：：CbSPT的構(gòu)建及工程農(nóng)桿菌制備

利用植物表達(dá)載體pWM101所帶有的CaMV35S啟動(dòng)子及啟動(dòng)子下游的BamHI和SalI等多克隆位點(diǎn)，采用BamHI和SalI雙酶切質(zhì)粒pMD18－CbSPT和植物表達(dá)載體pWM101。試劑盒分別回收、純化獲得CbSPT的cDNA及其載體片段，將兩片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含Kan的LB培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化菌落，通過(guò)菌落PCR及酶切檢測(cè)，證實(shí)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pWM101－35S：：CbSPT的正確性，并通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法1800 V 5 ms電擊轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，制備工程農(nóng)桿菌。

1.2.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的篩選鑒定

采用擬南芥浸花序法轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，選用盛花前期的植株為浸染材料，將整枝后的擬南芥花序浸入制備的浸染液（50 mL過(guò)夜培養(yǎng)的工程農(nóng)桿菌OD600為1.0左右，懸浮在100 mL含5 g蔗糖，20μL Silwet－77的MS中）浸染50～60 s，薄膜覆蓋，暗培養(yǎng)24 h，保持水分充足，開(kāi)花期共侵染2～3次。待種子成熟后收種，并讓其充分干燥，4℃春化處理一周，經(jīng)1%升汞消毒8 min，無(wú)菌水充分沖洗后，接種到篩選培養(yǎng)基（1／2MS＋10%蔗糖＋0.8%瓊脂＋30 mg／L潮霉素）上進(jìn)行發(fā)芽篩選，每瓶培養(yǎng)基中鋪加約1000粒種子。對(duì)經(jīng)潮霉素篩選獲得的抗性擬南芥進(jìn)行插入基因片段（CbSPT）下游序列和載體上的35S啟動(dòng)子上游序列PCR聯(lián)合檢測(cè)，分離單株擬南芥基因組DNA，上下游檢測(cè)引物分別為 p35S：5＇－CTCCACTGACGTAAGGGATGAC－3＇，pR：5＇－TCAAGTAATTCGATCTTTTAGGTC－3＇，PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 90 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃保溫延伸7 min。轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株P(guān)CR產(chǎn)物大小約為1200 bp。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的心皮形態(tài)顯微觀察

在體視顯微鏡（OLYMPUS SZX10）下觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥心皮形態(tài)，并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 薺菜CbSPT基因的克隆及序列分析

采用TAKARA公司試劑盒提取薺菜花蕾RNA，以設(shè)計(jì)的F，R為引物從RNA反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA上PCR擴(kuò)增SPT基因，電泳檢測(cè)顯示（圖1），條帶特異性高，與預(yù)期大小相符。

將測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI在線BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其與擬南芥AtSPT轉(zhuǎn)錄因子基因覆蓋率達(dá)95%，相似性達(dá)87%。通過(guò)NCBI的ORF finder進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析并翻譯，該基因序列全長(zhǎng)1047 bp，共編碼348個(gè)氨基酸（圖2），與擬南芥AtSPT基因的核酸序列和氨基酸序列的同源性分別達(dá)到98%和93%左右，說(shuō)明同源克隆所獲得的薺菜CbSPT序列是正確的。

圖1 薺菜CbSPT基因PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR amplification of CbSPT gene from Capsella bursa-pastoris

圖2 薺菜CbSPT序列測(cè)序結(jié)果及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列CbSPT共1047 bp，編碼348個(gè)氨基酸。Fig.2 Sequence results and corresponding amino acid sequences of CbSPT sequence from Capsella bursa-pastoris

利用ProtScale軟件進(jìn)行親疏水性預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在第113位具有最高分值1.325，122位達(dá)1.218，這2個(gè)位點(diǎn)疏水性較強(qiáng)，在第10位具有最低分－3.812，其親水性最強(qiáng)，而在第140，210位都具有較低分－2.765，－2.963。整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，無(wú)明顯疏水區(qū)域，故推測(cè)該蛋白為一種親水蛋白。

2.2 薺菜CbSPT基因氨基酸同源性分析

以擬南芥（Arabidopsis thaliana丨AEE86720丨），亞麻薺（Camelina sativa丨 XP＿010437251丨），歐洲油菜（Brassica napus丨 XP＿013723019丨），甘藍(lán)（Brassica oleraceavar.capitata丨 AHK05707丨），蕪菁（Brassica rapa丨 XP＿009109363丨），梅（Prunus mume丨 XP＿008241481丨），醉碟花（Tarenaya hassleriana丨XP＿010531245丨）氨基酸殘基序列與薺菜CbSPT基因氨基酸序列進(jìn)行氨基酸同源性分析，結(jié)果如圖3所示。薺菜CbSPT氨基酸序列與近源物種擬南芥、亞麻薺、歐洲油菜、甘藍(lán)、蕪菁、梅、醉蝶花相似性分別為 98%，89%，83%，83%，79%，73%，68%。

圖3 薺菜SPT與其他物種SPT的氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Comparison of am ino acid sequences of CbSPT and SPT with other species

通過(guò)MEGA 6.0軟件選取以上物種的SPT氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)育樹(shù)顯示薺菜與擬南芥在同一分支，其余6種為同一分支（圖4）。從氨基酸同源性對(duì)比結(jié)果來(lái)看，薺菜CbSPT與擬南芥同源性最高，為98%。亞麻薺、歐洲油菜、甘藍(lán)、蕪菁、梅、醉蝶花雖與薺菜、擬南芥不在一個(gè)分支，但薺菜CbSPT與亞麻薺、歐洲油菜、甘藍(lán)同源性皆在80%以上。因此，該基因在不同的物種間具有很強(qiáng)的保守性，他們對(duì)應(yīng)的蛋白應(yīng)屬同一家族。

圖4 7個(gè)物種基于SPT氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of seven species based on SPT amino acid sequences

2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

以Ti質(zhì)粒pWM101為基礎(chǔ)，將CbSPT基因的cDNA片段插入到多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建一個(gè)含潮霉素抗性選擇標(biāo)記和CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控的薺菜CbSPT基因 cDNA植物表達(dá)載體 pWM101－35S：：CbSPT，對(duì)重組分子進(jìn)行酶切檢測(cè)，確定構(gòu)建重組分子結(jié)構(gòu)的正確性（圖6A、B）。

采用浸花序法轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，將收獲的T0代種子在篩選培養(yǎng)基上經(jīng)40 mg／mL潮霉素篩選，7 d后，陰性苗葉片萎蔫，無(wú)根，而后慢慢黃化，白化至死亡。而陽(yáng)性苗則和野生型植株一樣正常生長(zhǎng)（圖5）。當(dāng)抗性苗蓮座葉長(zhǎng)出后，移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中，待植株生長(zhǎng)10 d左右，取單株葉片采用CTAB法提取基因組DNA，用P35S、PR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示（圖6C），隨機(jī)挑選的10株轉(zhuǎn)化擬南芥植株中有7株均在在1200 bp處擴(kuò)增出目的基因條帶（11號(hào)孔為陽(yáng)性對(duì)照，12號(hào)孔為野生型擬南芥陰性對(duì)照，第1、4、7號(hào)孔為假陽(yáng)性植株）。

圖5 潮霉素平板篩選CbSPT抗性植株（Bars=10 mm）Fig.5 CbSPT-resistant plants were screened by Hygromycin plates（Bars=10 mm）

圖6 薺菜CbSPT植物表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.6 Construction of CbSPT plant expression vector of Capsella bursa-pastoris

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥心皮形態(tài)的觀察與分析

對(duì)分子檢測(cè)后的轉(zhuǎn)基因植株成熟角果進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察（圖7），發(fā)現(xiàn)其角果形態(tài)較野生型有明顯變化。隨機(jī)統(tǒng)計(jì)100個(gè)角果，其變異率達(dá)78%，其典型的變異趨勢(shì)為徑相變窄、軸向變短；局部彎曲；整個(gè)心皮形態(tài)相對(duì)于正常擬南芥心皮變小，軸向變短了。但是，薺菜CbSPT在擬南芥中的過(guò)表達(dá)并沒(méi)有從根本上改變其角果的形態(tài)。這可能具有兩方面的原因：一是擬南芥內(nèi)源的SPT基因與薺菜SPT基因相重疊，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥植株心皮形態(tài)的復(fù)雜性；二是心皮的形態(tài)發(fā)育不是由SPT基因單基因決定，而可能與決定雌蕊發(fā)育的C類基因交互作用有關(guān)。

圖7 CbSPT轉(zhuǎn)基因植株角果觀察Fig.7 The silique shape of CbSPT transgenic plants

3 討論

十字花科心皮發(fā)育基因有特別高的保守率［7］，本試驗(yàn)對(duì)7個(gè)物種的SPT氨基酸序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析與此相符。Groszmann等［8］在擬南芥的心皮和果實(shí)發(fā)育研究中表明，SPT除了bHLH區(qū)域外包括另兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：一個(gè)兩性螺旋和一個(gè)酸性區(qū)域。其中酸性域?qū)τ赟PT心皮功能是必不可少的，并且兩性螺旋也支持它的心皮功能。當(dāng)缺失SPT功能時(shí)會(huì)導(dǎo)致隔膜和心皮的內(nèi)部傳輸遭到嚴(yán)重破壞，以及兩個(gè)心皮在頂端區(qū)域無(wú)法融合。在Girin等［9］的研究中，SPT是擬南芥受精前雌蕊中心皮邊緣再生組織發(fā)育所必須的，與另外一種在擬南芥果實(shí)成熟時(shí)所必須的bHLH轉(zhuǎn)錄因子IND相互作用并通過(guò)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)接觸介導(dǎo)雌蕊發(fā)育和果夾的開(kāi)裂，IND直接正向調(diào)節(jié)SPT的表達(dá)。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)薺菜CbSPT的序列分析，發(fā)現(xiàn)其與擬南芥SPT序列相似度極高，并編碼bHLH蛋白，通過(guò)親疏水性軟件預(yù)測(cè)也與擬南芥SPT具有兩性螺旋相符。但通過(guò)轉(zhuǎn)化植株的心皮表型觀察分析，薺菜CbSPT在擬南芥心皮中過(guò)表達(dá)后形態(tài)較野生型有較大的差異，心皮明顯變小、果莢軸向變短，部分典型變異果莢徑向變窄部分彎曲，這與趙燕等研究的CbCRC基因?qū)π钠ぐl(fā)育的影響作用相似，在Girin等的研究中也證實(shí)了35：：AtSPT轉(zhuǎn)基因植株中心皮和果實(shí)會(huì)有缺陷，在一定程度上也說(shuō)明薺菜CbSPT與擬南芥At-SPT基因在功能上有部分相似之處。

Groszmann等［10］研究了SPATULA和ALCATRAZ部分冗余對(duì)于擬南芥的雌蕊和果實(shí)發(fā)育的影響，表明SPT支持隔膜和柱頭的發(fā)育，而ALC參與裂果的發(fā)育和早期雌蕊的發(fā)育；spt－alc雙突變體會(huì)表現(xiàn)出早期雌蕊群的嚴(yán)重破壞和后期瓣膜邊緣缺陷。Nahar等［11］研究了SPT控制擬南芥心皮邊緣發(fā)育的機(jī)制，表明SPT促進(jìn)心皮融合成雌蕊是通過(guò)CUPSHAPED COTYLEDON1（CUC1）和CUC2的負(fù)調(diào)控表達(dá)。Pires等［12］也在相關(guān)研究中表明，SPT通過(guò)負(fù)調(diào)控CUC1和CUC2表達(dá)來(lái)指導(dǎo)心皮融合，并且SPT與CUC1、CUC2三種基因共同促進(jìn)基底區(qū)域中邊緣衍生結(jié)構(gòu)的形成。本研究中薺菜CbSPT在擬南芥心皮中過(guò)表達(dá)后沒(méi)有引起心皮融合和柱頭發(fā)育異常，說(shuō)明AtSPT和CbSPT在調(diào)控心皮融合中功能相似。Schuster等［13］在 2015年的研究中發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子HEC1、HEC2、HEC3，在生殖器官發(fā)育中影響生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的反應(yīng)，HEC1與SPT相互作用來(lái)控制心皮的融合，它們都限制細(xì)胞分裂素在雌蕊中的作用。2017年，Reyes－Olalde等［14，15］研究了SPT使細(xì)胞分裂素傳導(dǎo)，并在雌蕊的內(nèi)側(cè)區(qū)域激活與生長(zhǎng)素有關(guān)的生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因。研究表明，SPT是雌蕊在內(nèi)側(cè)域的細(xì)胞分裂素信號(hào)輸出所必需的，細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的增值需要SPT和B型ARR，SPT調(diào)節(jié)B型ARR表達(dá)，細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)依賴SPT激活生長(zhǎng)素生物合成基因，生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN3由細(xì)胞分裂素和SPT協(xié)同激活。在本研究中CbSPT在擬南芥心皮中過(guò)表達(dá)最典型的變異是引起了擬南芥長(zhǎng)角果的變短，這或許是CbSPT在調(diào)控上述細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中與At-SPT的調(diào)控模式存在差異。

植物的心皮形態(tài)發(fā)育不僅僅是由單基因調(diào)控，可能是多個(gè)基因形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，上下協(xié)同作用，或是多基因的重疊作用導(dǎo)致心皮形態(tài)的差異，也正是由于花器官發(fā)育調(diào)控機(jī)理的復(fù)雜性，亦或是同源基因之間表達(dá)模式的差異造成了心皮形態(tài)的差異。隨著人們對(duì)花器官發(fā)育的分子機(jī)制以及系統(tǒng)發(fā)育研究的進(jìn)一步深入，對(duì)花器官形態(tài)建成的機(jī)理將會(huì)有更加清楚的了解。

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