過表達擬南芥AtCIPK23、AtAKT1和AtCBL1基因棉花苗期耐低鉀的差異及機制研究

張斌，劉記，張朝軍，孔德培，王鵬，楊召恩，李付廣，張雪妍

（中國農業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

鉀是植物生命活動中必需的一種大量元素，占整個植物干物質質量的2%～10%，對提高作物產量、品質和適應外界不良環(huán)境具有重要作用[1]；鉀元素通過調節(jié)細胞的膨壓、維持細胞中電荷平衡、調節(jié)相關酶的活性以及一些蛋白質的合成來參與植物體內的生理生化過程[2]。棉花是需鉀較多的經濟作物，而且對鉀敏感、易缺鉀。在生產上，鉀營養(yǎng)的缺失是棉花早衰和枯、黃萎病發(fā)生的重要原因[3]。我國鉀資源匱乏，國內缺鉀耕地面積高達60%，鉀肥長期依賴進口，土壤鉀素不足己成為制約棉花生產的重要因素[4]。因此，闡明植物鉀營養(yǎng)機制，通過基因工程手段將鉀高效基因轉入棉花，提高其自身的鉀利用效率、選育耐低鉀的棉花品種，是緩解我國鉀素資源短缺、促進棉花產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一條有效途徑。

研究表明，在擬南芥根細胞中存在響應低鉀脅迫的分子調控通路，該通路至少由鈣感受器（Calcineurin B-like protein 1/9，CBL 1/9）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 （CBL-interacting serine/threonine-protein kinase 23，CIPK23）和鉀離子通道（Arabidopsis K+Transporter 1， AKT 1）3 個成員組成。當擬南芥根部感受到外界的低鉀脅迫后，CIPK 23被誘導表達，并通過其蛋白結構上的FISL （F for Phenylalanine、I for Isoleucine、S for Serine、L for Leucine）結構域與錨定在細胞質膜上的CBL 1/CBL 9結合，使得原本存在于細胞質的CIPK 23被帶到細胞質膜附近，并與細胞質膜定位的鉀離子通道AKT 1結合，隨之AKT 1被CIPK 23磷酸化，導致AKT 1作為鉀離子通道的活性被激活，從而介導胞外鉀離子向細胞內流動，最終提升了植物的耐低鉀能力[5-7]。

由于大部分土壤中的鉀元素的濃度低于作物生長所需要的濃度，故適宜的過表達鉀通道蛋白基因（例如AKT1）或者上游調控基因（例如AtCIPK23、AtCBL1 或AtCBL9），則可能有助于作物在低鉀條件下吸收較多的鉀離子，使植物具有更強的耐脅迫能力。Xu等在擬南芥中過表達AtAKT1基因并不能提高擬南芥本身的鉀利用效率，過表達AtCIPK23、AtCBL1或AtCBL9卻可以顯著提高低鉀情況下擬南芥對鉀離子的吸收能力，可能是因為擬南芥自身的鉀離子通道已經飽和[7]。但是，將水稻中的同源基因OsAKT1[5-6,8]、棉花中的GhAKT1[9]以及星星草中的PuAKT1[10]在擬南芥中過表達后，擬南芥的耐低鉀能力顯著提升。將擬南芥基因AtCIPK23、AtCBL9和AtAKT1在甘蔗中過表達，也能提升其對低鉀的耐受力，并提高產量和品質[11]；擬南芥AtCIPK23基因在煙草[12]和馬鈴薯[13]中過表達，均可以提高兩種植物在低鉀下的耐受能力。由此可見，利用轉基因技術，過表達外源的鉀通道及相關調控基因，可以不同程度提升植物的耐低鉀能力。

為了培育鉀高效棉花材料，本實驗通過轉基因技術，將在陸地棉中過表達擬南芥低鉀信號通路中的關鍵基因AtCIPK23，AtAKT1和AtCBL1經過多代篩選，目前已獲得T4純合轉基因株系。本研究通過水培法鑒定和評價轉基因棉花的耐低鉀能力，為轉基因棉花的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗用陸地棉材料為中棉所24（CCRI24）[14]及T4轉基因棉花（以CCRI24為受體，過表達擬南芥AtCIPK23 （AT1G30270）、AtAKT1（AT2G26650）和AtCBL1（AT4G17615）基因）由本實驗室提供。CCRI 24作為對照，ddH2O為陰性對照，重組質粒為陽性對照。水培試驗于2017年7月份在中國農業(yè)科學院棉花研究所光照培養(yǎng)室進行。過表達載體由中國農業(yè)大學武維華實驗室王毅博士提供，過表達棉花材料由本實驗室“棉花組織培養(yǎng)性狀純化及外源基因功能驗證平臺”張朝軍研究員創(chuàng)制。種子經濃硫酸脫絨、蒸餾水清洗后晾干，精選備用。

1.2 實驗方法

1.2.1材料的PCR檢測、種植及實驗設計。提取T3轉基因棉花離體葉片的DNA，以此為模板進行PCR擴增，之后對產物進行凝膠電泳，選取陽性苗（具有陽性條帶）的種子（T4）用于本次試驗的材料。種子用30%的次氯酸鈉消毒5 min并且用無菌水洗滌5次，之后用去離子水浸種催芽至露白，隨后用浸透水的海綿包裹垂直育苗，3 d后選取表型一致的幼苗轉移至2.5 L的水培槽中；采用1/4改良的Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，配方如下：21.26mmol·L－1Ca（NO3）2、0.25mmol·L－1NH4H2PO4、0.5 mmol·L－1MgSO4、2×10－2mmol·L－1H3BO3、1×10－3mmol·L－1ZnSO4、2×10－4mmol·L－1Cu-SO4、1×10－3mmol×MnSO4、5×10－6mmol·L－1（NH4）6Mo7O24、5×10－2mmol·L－1EDTA Fe Na。設 置 低 鉀 （0.03 mmol·L－1KCl） 和 適 鉀 （2.5 mmol·L－1KCl）兩個處理，每個處理 6 次重復，每個重復3株幼苗。水培槽置于光照（LED燈）培養(yǎng)室內，光照強度為450 lx，光照14 h/黑暗10 h，光照溫度為（28±2）℃，黑暗溫度為（21±2）℃，營養(yǎng)液每3 d更換1次，用氣泵24 h充氧。

1.2.2干物質質量和鉀含量測定。水培30 d（四葉期）后，幼苗根、莖、葉分別取樣，105℃殺青30 min，80℃下烘干48 h后稱干物質質量；烘干的組織經粉碎，用原子吸收分光光度計（SpectAA-50/55，Varian，Australia）測定鉀含量。具體的方法是：稱取0.4 g組織粉末，用濃硫酸完全碳化，緩慢加雙氧水至溶液清涼，過濾后定容至50 mL，使用原子吸收分光光度計測定濾液鉀含量。

1.2.3脯氨酸、相對含水量及滲透勢測定。水培30 d（四葉期）后，取第1和第2片真葉，鮮樣混合后用脯氨酸含量測定試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）測定脯氨酸含量；采用稱重法測相對含水量；取相同位置相同質量葉片，用滲透勢儀測定滲透勢，滲透勢Ψ（MPa）=－iCRT，其中i=1，C、R和T分別為滲透濃度、氣體常數和卡爾文溫度。

1.2.4根系形態(tài)測定。根系經根系掃描儀（EPSON-G780B，Tokyo，Japan）掃描，用根系圖像分析軟件 WinRHIZO 4.0 b（Regent Instruments Inc.，Quebec City，Canada）分析根長、根表面積和根體積。

1.2.5數據分析。鉀積累量＝鉀濃度×干物質質量；鉀利用指數（KUI）＝全株干物質質量/全株鉀濃度；葉片鉀占有比＝葉片鉀積累量/全株鉀積累量。實驗數據采用Microsoft Excel 2010進行均值和標準差的計算及制圖，使用SAS 9.2進行方差分析（ANOVA）與多重比較數據分析。

2 結果與分析

2.1 T3轉基因棉花的PCR鑒定

生物信息學分析并且設計了3個基因各自的引物 （表 1）：AtAKT1 （2574 bp）、AtCIPK23（1449 bp）、AtCBL1（642 bp）。 PCR 分析結果顯示不同轉基因棉花的條帶大小不同，陰性對照（ddH2O）和對照（CCRI 24）均無條帶，而轉基因棉花和陽性對照（重組質粒）有相同條帶，表明擴增出和陽性對照一樣條帶的為陽性轉基因棉花，選該材料的種子作為下一步實驗的研究材料（圖 1）。

表1 不同基因的PCR引物Table 1 The PCR premier sequence of different genes

2.2 鉀對轉基因棉花表型和干物重的影響

在不同鉀濃度處理下，轉基因棉花和對照（CCRI 24）生長差異明顯，說明本次處理有利于轉基因棉花耐低鉀能力的鑒定和評價。從植株四葉期表型上看，在適鉀條件下，轉基因棉花和對照均能正常生長，各材料間的長勢并無顯著差異（圖2A）。低鉀處理時，轉基因棉花和對照生長受到抑制，與適鉀處理相比，葉色偏黃、植株較矮（圖2B）。從干物質積累上看，適鉀處理下，各材料的根、莖、葉及整株干物質質量間無顯著差異（表2）。但在低鉀處理下，轉AtAKT1基因棉花具有最大的干物質質量，其根、莖、葉各部位干物質質量分別比對照增加了72.1%、81.5%、57.7%，整株干物質質量是對照的1.66倍。表明，轉AtAKT1基因棉花與轉AtCIPK23基因、AtCBL1基因棉花相比，具有較好的耐低鉀能力。

2.3 過表達不同基因對棉花各部位鉀濃度和鉀累積量的影響

鉀是生命活動不可或缺的元素，適鉀條件下，轉基因棉花和對照的根、莖、葉均可吸收和儲藏大量的鉀，各材料間的鉀濃度和鉀積累量無顯著差異，但是其各部位的鉀濃度和鉀累積量是低鉀處理時的5～10倍 （表3）。在低鉀處理下，轉At-CIPK23基因和AtCBL1基因棉花各部位鉀濃度、鉀積累量均與對照相當，無顯著差異。與其他材料相比，轉AtAKT1基因棉花葉片鉀濃度較低，但鉀積累量差異不顯著，可能與其葉片較大有關；除此之外，其根、莖及整株鉀濃度和鉀積累量顯著高于對照和其他2個轉基因棉花（表3），進一步說明轉AtAKT1基因棉花具有較好的鉀吸收能力，從而表現出較好的耐低鉀能力。

圖1 轉基因棉花PCR檢測結果Fig.1 The PCR results of transgenic plants

圖2 不同鉀處理下各材料四葉期幼苗表型Fig.2 The phenotype of four-leaves seedling under different K treatments

2.4 鉀對轉基因棉花根系發(fā)育的影響

根系與植株吸鉀能力密切相關，在不同鉀處理下，根系形態(tài)的差異可表征植株耐低鉀脅迫能力的強弱[15]。鉀能顯著地促進棉花根系的生長，如表4所示，不論是轉基因棉花還是對照，在適鉀條件下其總根長、總根表面積及總根體積是低鉀處理的2～5倍。在2種鉀處理下，轉AtCBL1基因棉花根系與對照基本相同，總根長、總根表面積和總根體積等根系指標也無顯著差異；而轉AtAKT1基因和轉AtCIPK23基因棉花根系更為發(fā)達，總根表面積和根體積在適鉀情況下和對照無顯著差異,低鉀處理下差異表現顯著。在低鉀條件下，轉AtCIPK23和AtAKT1基因棉花總根長、總根表面積和總根體積）約為對照的3倍。表明過表達AtAKT1和AtCIPK23能顯著改善低鉀脅迫下轉基因棉花的根系形態(tài)。

表2 不同鉀處理下的幼苗干物質積累變化Table 2 The dry weight of seedling under different K treatments

表3 不同鉀處理下幼苗各器官鉀濃度及鉀積累量Table 3 K concentration and accumulation in the organs of seedling under different K treatments

2.5 轉基因棉花鉀利用指數分析

鉀利用指數（KUI），指單位鉀濃度所形成的生物產量，綜合反映生物量和利用效率之間的差異，通過比較KUI能夠比較客觀地反映不同材料間的鉀利用能力[16]。在適鉀條件下，轉基因棉花和對照鉀利用能力都較低，鉀利用指數在0.056 0～0.071 9 g2·mg－1之間，明顯小于低鉀處理，并且轉基因棉花和對照KUI無顯著差異（圖3）。低鉀處理時，轉AtCIPK23和AtCBL1基因棉花KUI分別為 0.269 9 g2·mg－1和 0.257 3 g2·mg－1， 與對照（0.216 4g2·mg－1）基本一致；而轉AtAKT1 基因棉花鉀利用指數較高，達到 0.3367g2·mg－1，是對照的1.56倍（圖3）。由此說明，棉花苗期耐低鉀脅迫能力的高低，與整體的鉀利用能力相關，過表達AtAKT1基因能顯著提高低鉀脅迫下轉基因棉花的鉀利用指數，而AtCIPK23和AtCBL1基因不能。

表4 不同鉀處理下的幼苗總根長、總根表面積和總根體積比較Table 4 The root length,surface area and volume of seedling under different K treatments

圖3 鉀利用指數Fig.3 Potassium utilization index(KUI)

2.6 轉基因棉花鉀轉運能力比較

植物中的鉀主要在葉片中富集，用于各種大分子物質的合成，因此轉運到葉片中的鉀較多有利于植物的生長發(fā)育[17]，為了探究轉基因棉花間鉀轉運能力對于其耐低鉀能力的影響，比較了不同材料間葉片鉀占比。在適鉀環(huán)境中，轉基因棉花和對照（間的葉片鉀占比均為41%左右，各材料間沒有顯著差異（圖4）。

然而，在低鉀條件下，各材料的葉片鉀占比明顯升高，說明植株將有限的鉀優(yōu)先用于葉片的生長發(fā)育。其中，轉AtCIPK23基因棉花和對照葉片鉀占比上升最明顯，達到60.2%；轉AtCBL1基因次之，為48.4%；而轉AtAKT1基因棉花的葉片鉀占比增幅最小，為16.4%，明顯低于其他材料（圖4）。葉片鉀占比升高可以看作是低鉀脅迫下的一種應答現象，轉AtAKT1基因棉花葉片鉀量占比變幅較小，說明其對低鉀脅迫敏感程度較低，具有較好的耐低鉀能力。

圖4 葉片鉀占比Fig.4 Rate of leaf K accumulation

2.7 鉀對轉基因棉花滲透勢、相對含水量和脯氨酸含量的影響

從表5看出，在適鉀條件下，各轉基因棉花和對照間的葉片滲透式勢、相對含水量和脯氨酸含量無顯著差異。但是在低鉀脅迫處理下，各材料葉片的滲透勢下降了一半左右，相對含水量無顯著變化，說明植物沒有受到滲透脅迫；而脯氨酸含量明顯升高，對照升高了73.2%，轉AtCIPK23和AtCBL1基因棉花分別增加了57.6%和67.2%，而轉AtAKT1基因棉花僅增加了43.9%，脯氨酸的積累客觀上反應了植物受到脅迫時的響應程度[18]。低鉀下滲透勢下降是植株對低鉀脅迫的正常應答，這可能是由于合成大分子物質受阻導致小分子物質積累不足引起的；但相對含水量變化不顯著，說明滲透勢的下降并未引發(fā)滲透脅迫。本實驗中轉AtAKT1基因棉花低鉀時脯氨酸含量上升幅度最小，表明所受脅迫小，對耐低鉀的耐受能力最佳。

表5 不同鉀處理下的幼苗葉片滲透勢、相對含水量和脯氨酸（鮮物質質量）含量Table 5 Leaf osmotic potential,relative water content and proline content(quality of fresh materials)of plantsseedling under different K treatments

3 討論

AtCIPK23、AtAKT1和AtCBL1是擬南芥低鉀脅迫信號途徑中的關鍵基因，它們在擬南芥、煙草、水稻和馬鈴薯等作物中過表達后，能不同程度增強植株的耐低鉀能力[5-6,12-13]。為了培育鉀高效棉花材料，本實驗室在陸地棉中過表達AtCIPK23、AtAKT1和AtCBL1基因，經過多代篩選獲得T4純合轉基因株系。本研究通過水培法評價了各轉基因棉花的耐低鉀能力，為轉基因棉花的應用提供理論依據。

3.1 轉基因棉花根系發(fā)育情況的比較

棉花生長周期長，且大田條件不易控制，因此田曉莉等建立了室內水培法篩選棉花耐低鉀材料的體系[19]?；谠摲椒?，華含白等比較了遼棉18和新棉99B苗期耐低鉀能力的差異，并從鉀的吸收、運轉、利用等方面予以解釋[16]；王曉茹等從6個棉花供試品種中篩選得到兩個鉀高效品種和兩個鉀低效品種[20]，證明苗期室內水培法篩選耐低鉀材料具有可行性。為了快速鑒定和評價本實驗室鉀通道相關轉基因棉花材料的耐低鉀能力，本研究設置了低鉀（0.03 mmol·L－1）和適鉀（2.5mmol·L－1）兩個處理，通過測定比較植株長勢、干物質質量、鉀濃度和鉀積累量等指標，與轉At-CIPK23和AtCBL1基因棉花相比，轉AtAKT1基因棉花生長勢強（圖2），干物質質量（表2）、鉀濃度和鉀積累量 （表3）也明顯較高，說明轉AtAKT 1基因能提高棉花自身的耐低鉀能力。

根系的生長狀況不僅直接影響植株對水分和養(yǎng)分的吸收能力，還制約著植物地上部的生長發(fā)育。在養(yǎng)分脅迫下，良好的根系形態(tài)對棉花鉀素的吸收利用有重要作用[13]。郝艷淑等研究表明，鉀高效棉花基因型103在低鉀時總根長、總根表面積和總根體積顯著增加，是對低鉀脅迫的適應性變化[21]。Jiang等也發(fā)現，棉花鉀高效品種A-cala GC 510在開花期后，根部發(fā)育情況以及吸鉀量都高于鉀的敏感品種Acala SJ-2[22]。本實驗同樣發(fā)現，在棉花中過表達AtCIPK23、AtAKT1基因后，轉基因棉花根系更發(fā)達，總根長、總根表面積和總根體積指標明顯優(yōu)于轉AtCBL1基因材料和對照（表 4），說明AtCIPK23、AtAKT1 基因可以促進根的發(fā)育，與以往的報道是相吻合[6,23-24]。雖然轉AtCIPK23基因棉花根系發(fā)達，但是其耐低鉀能力并未顯著提高，這可能與根部細胞細胞質膜上鉀離子通道蛋白的密度以及鉀在植株體內的利用能力有關，前者可能直接影響著根對鉀離子的吸收情況，后者是指通過光合作用、韌皮部的裝載運輸以及相關蛋白質和酶的合成和激活，影響著體內鉀離子的利用情況[24]，通過比較鉀利用指數能夠比較客觀地反映不同材料間的鉀利用能力。在適鉀條件下，轉基因棉花和對照、鉀利用指數都較低；但低鉀處理時，轉AtAKT1基因棉花有更高的鉀利用效率，鉀利用指數顯著高于其他材料（圖3）。因此，棉花耐低鉀脅迫能力的高低，除了與根系生長有關外，還與整體的鉀利用能力和根部對鉀離子的吸收能力相關。

3.2 轉基因棉花間鉀利用能力的比較

植物體內鉀利用能力的高低與鉀生理功能的強弱密切相關，包括膨壓、滲透調節(jié)、光合作用、韌皮部的裝載和蛋白質的合成等[19]。在低鉀條件下，棉花幼苗的滲透勢下降了一半左右（與適鉀相比），在很大程度上可能是大分子物質合成受抑，導致單糖、游離氨基酸等小分子物質積累不足的反映，但高、低鉀條件下葉片相對含水量相同，說明小分子物質的積累并未引起細胞內質液濃度的改變，未產生滲透脅迫，表明滲透勢并不表征幼苗受到滲透脅迫的程度。脯氨酸已經被證實是一種能客觀反映植物對外界脅迫 （高鹽、高溫、低溫、低營養(yǎng)、酸、堿重金屬、干旱等）應答響應的媒介，也是一種可以平衡細胞內外滲透壓但不影響細胞正常代謝的相容性溶質[18]。低鉀條件下，脯氨酸含量上升，是棉花幼苗受到脅迫的一種反映，與其他材料相比，轉AtAKT1基因棉花在低鉀時脯氨酸含量升高相對較少，說明其受低鉀脅迫程度較低（表5）；同時，葉片鉀占有比增幅也最小，推測過表達擬南芥AtAKT1基因可能降低了棉花幼苗對低鉀響應的閾值，使得在該低鉀的環(huán)境中也能較正常地生長，至于具體的生理機制，由于比較復雜，所以需要進一步深入的研究。而AtAKT1表達的蛋白是被普遍認可的鉀離子通道蛋白[25]，也是鉀吸收通路中的關鍵性蛋白，CIPK 23、CBL 1/9所表達蛋白作為AKT1基因的上游激活因子，在擬南芥響應外界低鉀信號途徑中具有重要作用，大量的實驗結果表明過量表達AKT1基因及增強因子CIPK 23、CBL 1/9等可顯著增強植物在低鉀條件下的鉀吸收能力[6-7,11-13,25]。本研究結果表明：過表達擬南芥基因AtAKT1可以顯著提升棉花耐低鉀的能力，而過表達AtCIPK23和AtCBL1基因棉花苗期對低鉀脅迫依然敏感。這或許是因為植物體內從在對內源基因表達量的調控機制，往往存在閾值。對比之前將基因AtAKT1在擬南芥本身中過表達未能提升其耐低鉀能力的情況，本試驗的結果支持這一推測。此外，還可能是因為AtAKT1所表達蛋白的作用更為直接，而AtCIPK23和AtCBL1基因所表達蛋白只是該信號通路中的上游調節(jié)因子，單純的過表達調控因子并不能顯著提升鉀通道的吸鉀能力，具體的分子機制較為復雜，需要進一步研究。

4 結論

利用轉基因手段，成功將外源的擬南芥低鉀脅迫信號途徑中的關鍵基因AtCIPK23、AtAKT1和AtCBL1轉入棉花，并獲得了T4純合轉基因株系。本實驗通過室內水培法，測定比較了轉基因棉花長勢、干物質質量、鉀含量和鉀累積量等指標，表明過表達AtAKT1基因能提高顯著棉花幼苗的耐低鉀能力，并從根系形態(tài)、鉀利用指數、鉀轉運能力和受脅迫程度等方面綜合分析了其可能的生理機制，表明發(fā)達的根系和較強的鉀利用指數是其耐低鉀性強的關鍵原因。但是，還需要進行田間全生育期的耐低鉀實驗，全面深入研究轉基因棉花耐低鉀分子機制。

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