外源24-表油菜素內(nèi)酯對低溫脅迫下棉花幼苗光合生理的影響

李淑葉，馬慧娟，張思平，劉紹東，沈倩，陳靜，葛常偉，龐朝友，趙新華

(中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室,河南安陽455000)

棉花是喜溫作物，對低溫比較敏感。棉花出苗期及苗期易遭受倒春寒，嚴重影響植株的生長發(fā)育和產(chǎn)量形成[1-2]。光合作用對低溫脅迫非常敏感，尤其是PSⅡ反應(yīng)中心，可以作為反映植物受到低溫傷害程度的指標[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫導(dǎo)致葉綠素降解，破壞光合機構(gòu)，影響光能的吸收、捕獲、轉(zhuǎn)化及分配，阻礙光合電子傳遞，最終導(dǎo)致光合能力下降[5-7]?？焖偃~綠素熒光誘導(dǎo)動力學曲線（OJIP）可以反映PSⅡ復(fù)合體的生理狀態(tài)，分析逆境脅迫影響光合作用的部位，已經(jīng)成為研究植物耐逆性的方便、快速、無損傷的重要手段之一[8-10]。

油菜素甾醇(Brassinosteroids,BRs)是一類廣泛存在于植物界和植物器官的生理活性極強的天然甾醇植物激素，參與廣泛的生理代謝和生長發(fā)育過程，被稱為第六大植物激素[11]。目前，大量研究發(fā)現(xiàn)外源BRs可以緩解多種生物、非生物脅迫對植物造成的傷害，其中24-表油菜素內(nèi)酯和高表油菜素內(nèi)酯生理活性最強[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)外源BRs可以緩解低溫脅迫下辣椒、茄子的葉綠素降解、降低最大光化學效率和PSⅡ量子產(chǎn)額下降的幅度，維持較高的光合速率[14-15]。Yu等研究發(fā)現(xiàn)EBR通過平衡電子分配、維持羧化作用和氧化還原平衡促進黃瓜光合機構(gòu)在低溫脅迫后的恢復(fù)[16]。

目前關(guān)于外源BRs對低溫脅迫下棉花光合機構(gòu)影響的研究鮮有報道。因此，我們以快速葉綠素熒光誘導(dǎo)動力學曲線（OJIP）為手段研究了外源24-表油菜素內(nèi)酯對低溫脅迫下棉花幼苗光合機構(gòu)的影響，旨在為24-表油菜素內(nèi)酯作為生長調(diào)節(jié)劑提高棉花的耐冷能力提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2017年3―4月在中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所試驗農(nóng)場東場（河南省安陽縣，36°7′N，114°22′N)進行。以中棉所 60、魯棉研 28 和泗棉 3號為供試材料，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)。于3月26日提前播種并用雙層地膜覆蓋，4月5日出苗后及時放苗。4月9日降溫前一天葉面噴施蒸餾水 （CK）、0.1 mg·L－1（T1） 和 0.2 mg·L－1（T2）24-表油菜素內(nèi)酯（EBR）。 3 d 后測定子葉的快速葉綠素熒光誘導(dǎo)動力學曲線和生理指標。

從田間試驗站獲得試驗田氣象資料，4月5號至8號平均氣溫15.3℃，日照時間合計為12.1 h。4月9號至11號平均氣溫11.3℃，日照時間合計7.3 h。4月5―15日平均氣溫見圖1。

圖1 2017年4月5-15日日平均氣溫變化Fig.1 Daily average temperature change from April 5 to 15,2017

1.2 相對電導(dǎo)率和葉綠素含量的測定

相對電導(dǎo)率 （Relactive electric conductivity,REC）采用METTLER TOLEDO型電導(dǎo)率儀測定。棉花子葉先用蒸餾水沖洗3次，然后用濾紙吸干表面水分，避開主脈將葉片剪成均勻的長條，稱取0.1 g置于試管中，加入10 mL去離子水室溫下浸泡12 h，用電導(dǎo)儀測定提取液的電導(dǎo)率（R1），然后沸水浴 30 min，冷卻至室溫搖勻再次測定提取液的電導(dǎo)率（R2）。 REC=R1/R2×100%。

葉綠素含量的測定采用丙酮乙醇混合液法[17]。

1.3 快速葉綠素熒光誘導(dǎo)動力學曲線測量和OJIP參數(shù)計算

采用便捷式植物效率分析儀Handy-PEA（Han satech,英國）測量快速葉綠素熒光誘導(dǎo)動力學曲線。測量之前棉花子葉用暗適應(yīng)夾暗適應(yīng)30 min， 采用 3 000 μmol·m－2·s－1紅光誘導(dǎo)葉綠素熒光，測定時間為1 s。本文利用的基礎(chǔ)熒光參數(shù)為：20 μs 時初始熒光強度（Initial Fluorescence,F0）、2 ms 時 J 相 熒 光 強 度 （J-step Fluorescence,FJ）、30 ms 時 I相熒光強度 （I-step Fluorescence,FI）、最大熒光（Maximum Fluorescence,FM）、最大光化學效率（FV/FM,FV/FM=（FM－F0）/FM）、時間t的相對可變熒光（Vt,Vt=（Ft－F0）/（FM－F0））。 PSⅡ性能指數(shù)（Performance Indexes,PI）等其它熒光參數(shù)參照Strasser&Drivastava計算[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源EBR對低溫脅迫下棉花幼苗葉片相對電導(dǎo)率的影響

由圖2可知，低溫脅迫下，與噴施蒸餾水相比，噴施外源EBR棉花幼苗葉片的相對電導(dǎo)率顯著降低。中棉所60和魯棉研28不同濃度EBR處理沒有顯著差異，泗棉3號用0.2 mg·L－1EBR較0.1 mg·L－1EBR處理，葉片相對電導(dǎo)率顯著降低。 噴施外源 0.1 mg·L－1和 0.2 mg·L－1EBR，中棉所60、魯棉28、泗棉3號相對電導(dǎo)率分別降低32.8%和19.9%、17.7%和23.2%、17.0%和32.3%。以上結(jié)果表明外源EBR可以降低低溫脅迫下棉花幼苗葉片細胞膜的透性，緩解低溫對棉花幼苗細胞膜的傷害，而且EBR的作用效果與其濃度相關(guān)。

圖2 低溫脅迫下不同處理對棉花的相對電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effects of different treatments on relative conductivity of cotton under low temperature

2.2 外源EBR對低溫脅迫下棉花幼苗葉綠素含量的影響

低溫脅迫下與對照相比，外源EBR顯著提高棉花幼苗葉片總?cè)~綠素含量，除泗棉3號外，其他兩個品種不同濃度的EBR之間差異不顯著，總?cè)~綠素含量提高6.7%～18.1%（表1）。與對照相比，適宜濃度的EBR可以提高棉花幼苗葉綠素 a（Chl a）和葉綠素 b（Chl b）的含量。中棉所60在0.1 mg·L－1EBR處理后Chl a和Chl b提高幅度最大分別為9.7%和9.3%，魯棉研28和泗棉3號在0.2 mg·L－1EBR處理后Chl a分別提高32.6%和18.9%，Chl b分別提高15.3%和15.0%。以上結(jié)果表明外源EBR可以提高低溫脅迫下棉花幼苗葉綠素含量，且作用效果與EBR的濃度相關(guān)。

2.3 外源EBR對低溫脅迫下棉花幼苗OJIP曲線的影響

低溫脅迫下，外源噴施EBR棉花幼苗葉片的快速葉綠素熒光誘導(dǎo)動力學曲線（OJIP）與對照之間存在顯著差異（圖3）。外源噴施EBR對中棉所 60和魯棉研28影響的趨勢相同，2 ms（J相）和30 ms（I相）時的瞬時葉綠素熒光和最大葉綠素熒光（P相）明顯提高，但不同濃度的EBR之間差異不顯著。泗棉3號的J相顯著降低，I相和P 相顯著升高，且 0.2 mg·L－1EBR 較 0.1 mg·L－1EBR處理后的變化幅度更大。分析J相可變熒光（VJ,VJ=（FJ－F0）/（FM－F0））發(fā)現(xiàn) EBR 處理后 VJ顯著降低，下降幅度為7%～29%。同時，最大光化學效率（FV/FM）顯著提高。以上結(jié)果表明外源EBR可以緩解低溫對棉花幼苗葉片PSⅡ受體側(cè)電子從原初電子受體質(zhì)體醌A（Plastoquinone,QA）向次級電子受體質(zhì)體醌B（Plastoquinone,QB）傳遞的阻礙作用以及提高質(zhì)體庫（Plastoquinone,PQ）接受電子的能力，提高最大光化學效率，而且外源EBR對不同品種的作用效果存在差異。

表1 外源EBR對棉花幼苗葉綠素含量的影響Table1 Effects of exogenous EBR on chlorophyll content in cotton seedlings

2.4 外源EBR對低溫脅迫下棉花幼苗PSⅡ性能指數(shù)的影響

圖3 不同處理對棉花幼苗葉片動力學曲線和基礎(chǔ)熒光參數(shù)的影響Fig.3 Effects of different treatments on chlorophyll-a fluorescence kinetics curves(OJIP)and basic fluorescence parameters of cotton seedling leaves

PSⅡ基于吸收光能的性能指數(shù)PIABS包含3個獨立參數(shù)，可以準確反映光合機構(gòu)的狀態(tài)，更好地反映脅迫對PSⅡ結(jié)構(gòu)和功能的影響。由圖4可知，與對照相比，外源EBR顯著提高低溫脅迫下棉花幼苗基于吸收光能的性能指數(shù)。不同濃度的外源EBR對PIABS提高幅度的影響差異顯著。中棉所60在0.1 mg·L－1EBR處理后 PIABS提高幅度最大為75.6%，魯棉研28和泗棉3號噴施0.2 mg·L－1EBR 后 PIABS分 別提高 101.1%和265.6%。同時，低溫脅迫下外源噴施EBR棉花葉片PSⅡ總的性能指數(shù) （PIT,Performance index on total）也顯著提高，除泗棉3號外，不同濃度的外源EBR對PIT的影響差異不顯著。以上結(jié)果表明外源EBR可以緩解低溫對棉花幼苗葉片PSⅡ結(jié)構(gòu)和功能的破壞，同時提高電子傳遞到光系統(tǒng)Ⅰ（PhotosystemⅠ,PSⅠ）最終電子受體的能力和能量轉(zhuǎn)換的潛能。其中，中棉所60在0.1 mg·L－1EBR處理后效果較好，魯棉研28和泗棉3號0.2 mg·L－1EBR處理后效果較好。

圖4 不同處理對低溫脅迫下棉花幼苗性能指數(shù)的影響Fig.4 Effect of different treatments on the performance of PSⅡactivity of cotton seedlings under low temperature stress

2.5 外源EBR對低溫脅迫下棉花幼苗PSⅡ反應(yīng)中心的影響

低溫脅迫下噴施EBR顯著影響了單位有活性PSⅡ反應(yīng)中心和單位受光面積的效率（圖5）。與對照相比，外源EBR顯著提高單位受光面積吸收的光能 （ABS/CSm）、 捕獲的光量子（TRo/CSm）、電子傳遞到電子傳遞鏈QA下游其他電子受體的能量（ETo/CSm）以及電子傳遞到PSⅠ最終電子受體的能量（REo/CSm），而單位有活性反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）顯著降低，表明外源EBR可以減少低溫脅迫下棉花幼苗葉片失活的PSⅡ反應(yīng)中心的數(shù)量和提高對光能的吸收利用。有圖5可知，外源EBR處理后單位有活性反應(yīng)中心熱耗散的能量（DIO/RC）顯著降低，而將電子傳遞到電子傳遞鏈QA下游其他電子受體的能量（ETo/RC）以及電子傳遞到PSⅠ最終電子受體的能量（REo/RC）增加，表明單位有活性反應(yīng)中心將吸收的光能主要用于光合電子傳遞。中棉所60和魯棉研28不同濃度EBR處理之間沒有顯著差異， 但泗棉3號0.2 mg·L－1較 0.1 mg·L－1EBR處理各參數(shù)均顯著提高。以上結(jié)果表明外源EBR可以緩解低溫脅迫下棉花幼苗PSⅡ反應(yīng)中心的降解或失活，提高PSⅡ反應(yīng)中心對光能的吸收利用。

2.6 外源EBR對低溫脅迫下棉花幼苗PSⅡ受體側(cè)的影響

圖5 不同處理對低溫脅迫下棉花幼苗光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心熒光參數(shù)的影響Fig.5 Effects of different treatments on fluorescence parameters of the reaction center of PSⅡof cotton seedlings under low temperature stress

圖6 不同處理對低溫脅迫下棉花幼苗PSⅡ反應(yīng)中心受體側(cè)熒光參數(shù)的影響Fig.6 Effects of different treatments on fluorescence parameters of electron acceptors of the reaction center of PSⅡof cotton seedlings under low temperature stress

由圖6可知，低溫脅迫下，外源噴施EBR顯著提高棉花幼苗PSⅡ?qū)ξ展饽艿牟东@效率（φPo）、光合機構(gòu)吸收的光量子將電子傳遞到QA下游電子受體的概率（φEo）和傳遞到PSⅠ最終電子受體的概率（φRo）以及捕獲的光量子將電子傳遞到電子傳遞鏈QA下游其他電子受體的概率（ψEo），表明PSⅡ受體側(cè)功能發(fā)生改變，提高了PSⅡ電子傳遞能力。外源EBR處理后OJIP曲線初始斜率Mo顯著降低和Area（OJIP曲線、FM及Y軸之間的面積）、PSⅡ受體側(cè)的電子受體庫容量（Sm，Sm=Area/（FM－F0））顯著提高，表明電子從 QA進入電子傳遞鏈的數(shù)量增多以及QA下游電子受體庫增大。不同濃度的EBR對中棉所60和魯棉研28的PSⅡ電子傳遞能力的影響沒有顯著差異，但0.2 mg·L－1EBR對泗棉3號的作用顯著高于0.1 mg·L－1。以上結(jié)果表明外源EBR對低溫脅迫下棉花幼苗PSⅡ受體側(cè)具有保護作用，可以提高PSⅡ?qū)ξ展饽艿牟东@效率，增加進入電子傳遞鏈的電子以及增大QA下游電子受體庫促進電子傳遞。除泗棉3號，外源EBR的作用效果與濃度無關(guān)。

3 討論

植物受到逆境影響時，細胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，植物細胞浸提液的電導(dǎo)率增大[19]。Dexter首次將電導(dǎo)法用于植物抗冷性研究之后，細胞膜透性被廣泛應(yīng)用于鑒定植物的抗冷能力[20]。我們發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下噴施EBR棉花幼苗葉片的相對電導(dǎo)率顯著下降，表明外源EBR可以緩解低溫對棉花葉片細胞膜的損害，提高棉花耐冷能力。低溫易造成植物葉綠素降解，導(dǎo)致葉綠素含量降低[21]。我們研究發(fā)現(xiàn)外源EBR處理后棉花幼苗葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量不同程度的提高，表明外源EBR對低溫脅迫下棉花幼苗葉綠素具有保護作用。這可能是由于24-表油菜素內(nèi)酯直接或間接促進葉綠素的合成或抑制葉綠素酶的活性[22]。同時，0.1 mg·L－1和 0.2 mg·L－1外源 EBR 對中棉所60和魯棉研28相對電導(dǎo)率和葉綠素含量的影響沒有顯著差異，但不同濃度EBR對泗棉3號作用效果差異顯著，0.2 mg·L－1EBR 較 0.1 mg·L－1EBR處理后葉片相對電導(dǎo)率下降幅度和葉綠素含量提高幅度更大，這可能是由于不同品種對EBR響應(yīng)能力存在差異。

植物光合器官的葉綠素熒光變化一定程度上可以反映不利的環(huán)境因素對植物光合作用的影響[23-24]，通過快速葉綠素熒光誘導(dǎo)動力學曲線的分析，可深入了解不利的環(huán)境因素對光合作用暗反應(yīng)前PSⅡ的影響[25]。我們利用快速葉綠素熒光誘導(dǎo)動力學曲線研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下與噴施蒸餾水相比，外源噴施EBR可以顯著提高反映植物受到光抑制程度的FV/FM和反映植物光合作用整體狀態(tài)的PIABS，表明外源EBR可以緩解低溫對棉花幼苗光合作用的傷害，低溫脅迫下維持棉花幼苗較高的光合能力。這與前人研究EBR減少低溫對黃瓜、茄子光合作用的傷害，維持較高的最大光化學效率的結(jié)果一致[26-27]。同時，我們研究發(fā)現(xiàn)中棉所 60用0.1 mg·L－1處理后 PIABS提高幅度最大，而魯棉研28和泗棉3號在0.2 mg·L－1處理后PIABS提高幅度大，表明外源EBR提高低溫脅迫下棉花幼苗的光合能力與其濃度相關(guān)，不同的棉花品種所需適宜的EBR濃度不同。

低溫導(dǎo)致光合作用下降主要是由于低溫對類囊體造成氧化破壞、阻礙光合電子傳遞、PSⅡ蛋白質(zhì)構(gòu)相改變和解離、反應(yīng)中心失活等[28-30]。我們研究發(fā)現(xiàn)與對照相比，低溫脅迫下外源噴施EBR棉花幼苗葉片的ABS/CSm顯著升高，ABS/RC降低，表明外源EBR可以減少低溫脅迫下棉花幼苗葉片失活的PSⅡ反應(yīng)中心的數(shù)量和提高對光能的吸收利用。這與Li研究發(fā)現(xiàn)低溫處理前辣椒葉片噴施EBR可以提高PSⅡ反應(yīng)中心活性的結(jié)果相一致[31]。低溫脅迫下外源噴施EBR棉花幼苗葉片φPo、φEo和Sm顯著提高，表明外源EBR可以提高低溫脅迫下棉花幼苗PSⅡ?qū)ξ展饽艿牟东@效率、PSⅡ供體側(cè)電子傳遞和增大電子傳遞鏈QA下游電子受體庫。這與李濤濤等人發(fā)現(xiàn)外源BRs提高干旱、鹽和銅脅迫下3種楊樹單位受光面積捕獲的光量子和光合機構(gòu)吸收的光量子將電子傳遞到QA下游電子受體概率的結(jié)果相似[32]。中棉所60和魯棉研28不同濃度EBR處理之間各參數(shù)沒有顯著差異，而泗棉3號0.2 mg·L－1較 0.1 mg·L－1EBR 處理后各參數(shù)的變化幅度更大。

4 結(jié)論

外源24-表油菜素內(nèi)酯能夠減輕低溫對棉花幼苗細胞膜的傷害，通過提高葉綠素含量、保護PSⅡ反應(yīng)中心活性和PSⅡ受體側(cè)電子傳遞能力，從而提高低溫脅迫下棉花幼苗的光合能力。不同的棉花品種所需適宜的EBR濃度存在差異，其中中棉所60用0.1 mg·L－1EBR處理效果較好，魯棉研28和泗棉3號用0.2 mg·L－1EBR處理效果較好。

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