陸地棉植物絡(luò)合素合酶基因的鑒定與功能預(yù)測(cè)

梅磊 ，李玲 ，肖欽之 ，陳進(jìn)紅 ，祝水金 *

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州310058；2.劍橋大學(xué)植物系，英國(guó)劍橋CB2 3EA；3.湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南永州425199；4.湖南省邵陽(yáng)市煙草專(zhuān)賣(mài)局，湖南邵陽(yáng)422000）

楊偉華等[1]援引環(huán)保部和國(guó)土資源部2014年發(fā)布的全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查顯示，全國(guó)土壤總的點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)16.1%，其中耕地土壤點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)19.4%，主要無(wú)機(jī)污染物包括鎘、鉛、銅、汞和砷等重金屬元素。棉花在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中扮演重要角色。之前的研究結(jié)果表明，棉花對(duì)多種非生物脅迫表現(xiàn)一定的耐性，對(duì)重金屬脅迫具有較強(qiáng)的耐性[2-7]。李玲等[8]以3個(gè)陸地棉品系為研究對(duì)象，調(diào)查了鎘脅迫條件下，重金屬鎘在陸地棉不同組織部位中的分布。結(jié)果表明，其主產(chǎn)品纖維和副產(chǎn)品種子中重金屬含量均較低。由此可見(jiàn)，棉花中重金屬不易進(jìn)入食物鏈，是潛在的、優(yōu)良的、可用于耕地重金屬修復(fù)的工程農(nóng)作物。

通過(guò)植物絡(luò)合素類(lèi)物質(zhì)絡(luò)合金屬離子后經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中諸如液泡等特定部位，維持胞內(nèi)自由金屬離子的平衡是植物主動(dòng)防御重金屬毒害的重要機(jī)制之一。植物絡(luò)合素酶Phytochelatin synthase,PCS）控制絡(luò)合小分子合成，是直接決定植物對(duì)金屬脅迫抗性的關(guān)鍵酶[9]。Grill等[10]發(fā)現(xiàn) 200 μmol·L－1CdSO4脅迫下蛇木根細(xì)胞懸浮液中90%以上的重金屬被植物絡(luò)合素吸收，說(shuō)明植物絡(luò)合素在植物主動(dòng)防御重金屬脅迫中的核心作用。自Grill等[10]于1989年首次從膀胱麥瓶草中發(fā)現(xiàn)植物絡(luò)合素合酶以來(lái)，PCS基因幾乎在所有植物中均被發(fā)現(xiàn)，甚至酵母、藻青菌和線蟲(chóng)中也發(fā)現(xiàn)PCS的存在。目前研究認(rèn)為，PCS蛋白N端結(jié)構(gòu)域phytochelatin（Pfam ID：05023，InterproID：IPR007719）是催化中心，而 C端結(jié)構(gòu)域 phytochelatin_C（Pfam ID：09328，InterproID：IPR015407）控制催化效率，N端序列保守性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于C端。幾乎所有的植物均同時(shí)含有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即 phytochelatin和 phytochelatin_C。擬南芥中PCS基因家族包含2個(gè)旁系同源基因 （AtPCS1和AtPCS2），其中At-PCS1作為主效基因，在重金屬解毒過(guò)程中比AtPCS2具有更強(qiáng)的效果[11-13]，二者均含有PCS基因家族的特征結(jié)構(gòu)域。棉花和擬南芥同屬雙子葉植物，親緣關(guān)系較近。得益于近年來(lái)棉屬幾個(gè)重要種全基因組測(cè)序的完成，運(yùn)用比較基因組學(xué)方法鑒定棉花中的目標(biāo)基因更加高效快捷。陸地棉(Gossypium hirsutum,(AD)1)是全球最大的棉花栽培種，為異源四倍體，由同源二倍體雷蒙德氏棉基因組D5和亞洲棉基因組A2自然加倍而來(lái)。本研究基于陸地棉及其2個(gè)供體種全基因組的信息[14-16]，從全基因組范圍鑒定陸地棉的植物絡(luò)合素合酶基因及其特征，為進(jìn)一步的功能驗(yàn)證提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象和數(shù)據(jù)獲取

陸地棉[14]和亞洲棉[16]全基因組信息基于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所-華大基因（Cotton Genome Project-Beijing Genome Institute,CGP-BGI）版本和美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information,NCBI），登記組裝號(hào)分別為GCF_000327365.1、GCF_000612285.1和GCF_000987745.1。雷蒙德氏棉[15]全基因組信息基于聯(lián)合基因組研究所（Joint Genome Institute,JGI）版本。 以已經(jīng)完成功能驗(yàn)證的擬南芥中的AtPCS1（Gene ID:834430）和AtPCS2（Gene ID:839354）為主要參照，同時(shí)參考其他物種中PCS基因相關(guān)信息（見(jiàn)圖2），在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中以默認(rèn)值獲得3個(gè)棉種PCS基因及其蛋白序列，并將所得蛋白序列提交Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證[17-18]。蛋白分子量和等電點(diǎn)等相關(guān)特征信息通過(guò)軟件SnapGene Viewer 4.0進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

1.2 蛋白序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

除棉屬3個(gè)種的PCS外，本研究還包括來(lái)自高等植物、酵母、線蟲(chóng)等不同物種的18個(gè)PCS蛋白序列，用于保守結(jié)構(gòu)域和蛋白序列的比對(duì)，并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，其中用于鑒定參考的18個(gè)PCS的具體信息詳見(jiàn)圖1。利用ClustalⅩ2.0軟件對(duì)25個(gè)PCS蛋白序列進(jìn)行多序列聯(lián)配，參數(shù)為默認(rèn)值[9]。利用MEGA 6.06軟件將聯(lián)配結(jié)果通過(guò)鄰位連接法（Neighbor-Jointing,NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，設(shè)置重復(fù)值為1 000，提高進(jìn)化分支樹(shù)結(jié)果可靠性[19]。

1.3 棉花中PCS基因結(jié)構(gòu)分析

提取鑒定的8個(gè)棉花PCS基因的General Feature Format 3信息構(gòu)建整合文件，提交到在線分析系統(tǒng) Gene Structure Display Server（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析[20]。

2 結(jié)果和分析

2.1 陸地棉PCS基因的鑒定

根據(jù)蛋白序列和結(jié)構(gòu)域的保守性比對(duì)，在陸地棉中鑒定出4個(gè)旁系同源基因GhPCS1（LOC107922779）、GhPCS2 （LOC107922692 ）、GhPCS3（ LOC107955409）和GhPCS4 （LOC-107937656），其中GhPCS1和GhPCS2分別分布在第26號(hào)染色體（D13）的正、反義鏈（正反鏈以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)為準(zhǔn)）上，GhPCS3位于9號(hào)染色體，GhPCS4位于未錨定的Scaffold上（表1）。陸地棉供體種雷蒙德氏棉中只鑒定出2個(gè)旁系同源基因GrPCS1 （LOC105766126） 和GrPCS2（LOC105803222），分別位于第1和第7號(hào)染色體上，其中GrPCS1位于DNA反義鏈上。陸地棉另一供體種亞洲棉中也只鑒定出2個(gè)旁系同源基 因GaPCS1 （LOC108487459） 和GaPCS2（LOC108468678），分別位于第9條和第1條染色體上。陸地棉及其供體種8個(gè)被檢測(cè)到PCS基因均具有2～5個(gè)不等的可變剪切序列，編碼序列長(zhǎng)度為3～8 kb，其中最短的是GhPCS4，編碼長(zhǎng)度僅為3 310 bp；最長(zhǎng)的GrPCS1編碼長(zhǎng)度達(dá)8 265 bp，較GhPCS4長(zhǎng)1倍多。8個(gè)PCS基因編碼蛋白包含474～507個(gè)氨基酸殘基，基因之間編碼蛋白長(zhǎng)度差異不大，說(shuō)明不同PCS基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)差異較大。陸地棉及其供體種被預(yù)測(cè)到的8個(gè)基因中，其蛋白均在55 kDa左右，等電點(diǎn)4.9～6.4，均含有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（phytochelatin和 phytochelatin_C，表1），說(shuō)明這些蛋白具有相似的功能。

表1 陸地棉及其供體種的植物絡(luò)合素合酶及其基因的主要特征Table 1 Distribution of phytochelatin synthase in G.raim ondii,G.arboreu m and G.hirsutum

2.2 陸地棉PCS系統(tǒng)進(jìn)化分析與保守特征結(jié)構(gòu)域

圖1 棉花PCS與其它17個(gè)物種PCS蛋白的親緣關(guān)系和特征保守結(jié)構(gòu)域分布Fig.1 Phylogeny analysis on PCSs in cotton and other 17 selected organisms,combining conserved domains distributions

將陸地棉及其2個(gè)供體種的8個(gè)PCS蛋白與其它代表性物種的17個(gè)PCS蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖1）。25個(gè)PCS蛋白被分成3個(gè)亞類(lèi)，棉屬的8個(gè)PCS分別屬于2個(gè)亞類(lèi)，同一亞類(lèi)中棉屬PCS親緣關(guān)系比較接近，與其它物種差別明顯。第I亞類(lèi)中，GrPCS2與GhPCS1親緣關(guān)系最近，GaPCS1稍遠(yuǎn)，GhPCS2更遠(yuǎn)。第II亞類(lèi)中，GrPCS1和 GhPCS4，GaPCS2和 GaPCS3兩兩表現(xiàn)相近的親緣關(guān)系。結(jié)果還可以看出，棉屬中二倍體A2組（亞洲棉）和D5組（雷蒙德氏棉）分別有1對(duì)旁系同源PCS基因。陸地棉（(AD)1）有2對(duì)旁系同源PCS基因，并且分別與A、D組中有親緣關(guān)系較近的對(duì)應(yīng)基因，結(jié)果支持異源四倍體栽培陸地棉起源于2個(gè)二倍體棉種的觀點(diǎn)。從圖1還可以看出，棉屬2個(gè)種的PCS蛋白分屬于不同亞類(lèi)，而擬南芥和水稻中各自的2個(gè)旁系同源蛋白均屬于同一亞類(lèi)。由此推測(cè)，分屬于不同亞類(lèi)的棉花PCS可能在功能上存在較大分化。

2.3 陸地棉PCS基因結(jié)構(gòu)差異

通過(guò)對(duì)陸地棉及其供體種PCS家族基因的開(kāi)放閱讀框（Open reading frame,ORF）和ORF對(duì)應(yīng)基因組區(qū)域的序列進(jìn)行分析，獲得PCS家族基因的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)（圖2）。由圖2可以看出，3個(gè)棉種PCS家族基因基本由8個(gè)外顯子構(gòu)成，其中GrPCS2缺少N端2個(gè)外顯子，GrPCS1中3’端最右的外顯子長(zhǎng)度明顯較短，雷蒙德氏棉PCS基因家族外顯子結(jié)構(gòu)完整性低于亞洲棉和陸地棉，可能會(huì)導(dǎo)致相對(duì)較弱的催化能力。結(jié)合圖1，同一亞組的PCS基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)更為相近，其中雷蒙德氏棉中的2個(gè)PCS基因內(nèi)含子長(zhǎng)度較長(zhǎng)。

2.4 陸地棉PCS酶關(guān)鍵作用位點(diǎn)分析

圖2 棉花中PCS家族基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Structural analysis onPCS gene family in cotton

Vivares等[21]解析藻青菌PCC720 PCS蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)PCS酶活性中心具有類(lèi)似于木瓜蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，該酶活性中心為2個(gè)“新月型”的單體結(jié)構(gòu)組成二聚體，包含8個(gè)α螺旋和6個(gè)β折疊條，說(shuō)明PCS有與木瓜蛋白合酶類(lèi)似的作用機(jī)制。在酰基化 （轉(zhuǎn)肽）過(guò)程中，藻青菌NsPCS中參與γ-谷氨酰半胱氨酸 （γ-glutamylcysteine,γ-EC）形成氫鍵的氨基酸殘基有Cys70、Met123、Gly182、Asp225 和 Arg232， 其中作為酶催化位點(diǎn)中的最重要的3個(gè)氨基酸殘基Cys70、His183和Asp201在空間結(jié)構(gòu)上形成結(jié)合底物的“小洞”。這3個(gè)氨基酸殘基在真核生物和原核生物中均嚴(yán)格保守，在植物絡(luò)合素形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

為明確陸地棉PCS酶家族參與植物絡(luò)合素合成的關(guān)鍵位點(diǎn)之間的差異與特點(diǎn)，對(duì)擬南芥的AtPCS1和AtPCS2、已完成蛋白空間結(jié)構(gòu)解析的藍(lán)藻菌NsPCS和棉屬8個(gè)PCS蛋白家族酶催化端關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行比較。結(jié)果表明（圖3），棉屬3個(gè)種、擬南芥和藍(lán)藻菌PCS蛋白家族整個(gè)酶活性區(qū)域保守性都非常高，其中同屬高等植物的陸地棉及其供體種和擬南芥特征結(jié)構(gòu)域的保守性比藍(lán)藻菌更高，和物種中的親緣關(guān)系相對(duì)應(yīng)。陸地棉及其供體種PCS蛋白家族中，除去N端非齊頭氨 基 酸 ，GrPCS2 與 GhPCS1，GaPCS1 與 Gh-PCS2，GrPCS1、GhPCS4、GaPCS2 與 GhPCS3 分別具有完全保守的氨基酸序列；藍(lán)藻菌中Cys70、His183和Asp201與酶催化“小洞”相關(guān)，與之對(duì)應(yīng)位置的所有棉屬PCS家族中氨基酸也完全相同；相應(yīng)的，與γ-EC形成氫鍵的PCS的肽鏈折疊后形成的主、支鏈氨基酸位點(diǎn)在棉屬中也完全相同。由此可見(jiàn)，陸地棉與其供體種之間PCS家族關(guān)鍵氨基酸保守位點(diǎn)均嚴(yán)格保守，酶功能基因沒(méi)有丟失。

圖3 PCS酶家族催化中心功能位點(diǎn)對(duì)比Fig.3 Comparison in amino acid of enzyme center of PCS family

2.5 陸地棉PCS蛋白中半胱氨酸的分布

半胱氨酸（Cysteine，Cys）是唯一含有巰基的氨基酸，在植物對(duì)抗重金屬脅迫中具有重要作用，其易于與 Cd2＋，Hg2＋，Cu2＋，Ag＋等金屬離子形成 R-S-M'，R-S-M''-S-R（M'，M''分別為 1 價(jià)、2 價(jià)金屬）形式的不易溶硫醇鹽。作為還原劑，半胱氨酸能與弱氧化性的金屬離子如銅離子發(fā)生氧化反應(yīng)，改變重金屬離子的毒害效果；基于這些化學(xué)反應(yīng)特性，PCS中的半胱氨酸在重金屬識(shí)別和受重金屬調(diào)控酶活性過(guò)程中起重要作用。PCS的顯著特征就是N、C端富含Cys，且成對(duì)出現(xiàn)[9,22]。陸地棉及其供體種8個(gè)PCS蛋白所包含的酶作用位點(diǎn)（N端）中Cys分布十分相似，N端均含有1個(gè)Cys對(duì)。除GaPCS2和GhPCS3外，剩余6個(gè)PCS蛋白的N端均含有9個(gè)Cys。對(duì)酶催化起調(diào)控作用的C端Cys分布差別較大，Cys含量為10～14個(gè)不等，成對(duì)的Cys含量為1～4對(duì)不等。在3個(gè)棉種PCS家族2個(gè)亞組中，包含GrPCS2、GaPCS1、GhPCS1和GhPCS2的亞組I均有4對(duì)Cys以及13～14個(gè)單獨(dú)的Cys。亞組II中只有1～3對(duì)Cys和10個(gè)單獨(dú)的Cys。由此可推測(cè)，亞組I中PCS酶家族的酶活性可能比II更強(qiáng)，這與2.2中的結(jié)果相吻合。

3 討論

圖4 棉花PCS蛋白中的Cys分布Fig.4 Distribution of Cys in cotton PCS proteins

本研究在四倍體陸地棉中鑒定出4個(gè)PCS基因，從其供體種雷蒙德氏棉和亞洲棉中分別鑒定出2個(gè)PCS基因，陸地棉的PCS基因數(shù)量是2個(gè)供體種基因之和。與擬南芥和水稻等物種不同，陸地棉及其供體種PCS基因家族分屬于2個(gè)不同的亞組，暗示棉屬的旁系同源PCS蛋白在功能上可能具有較大的分化。亞組I中的PCS與大部分雙子葉植物中PCS更為接近，亞組II中的PCS與裂殖酵母、線蟲(chóng)等更為接近。藻青菌PCC720中的PCS只單獨(dú)含N端特征結(jié)構(gòu)域，裂殖酵母、線蟲(chóng)和小眼蟲(chóng)只含有N端特征結(jié)構(gòu)域PF05023而不含C端特征結(jié)構(gòu)域phytochelatin_C，因此這些物種中PCS酶活性較低。這可能說(shuō)明棉花PCS蛋白家族亞組I成員比亞組II成員具有更強(qiáng)的植物絡(luò)合素合酶活性。近年的研究發(fā)現(xiàn)，PCS具有雙功能酶特性，除轉(zhuǎn)肽酶活性外，同時(shí)還具有肽酶活性，但該功能只在擬南芥中有初步研究。棉屬植物PCS蛋白家族亞組的差異是否與該酶存在功能差異相對(duì)應(yīng)還需要進(jìn)一步研究。

PCS基因家族結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，相較于亞洲棉和陸地棉，雷蒙德氏棉中的2個(gè)旁系同源基因Gr-PCS2 N端缺少2個(gè)外顯子，GrPCS1中3’端最后1個(gè)外顯子長(zhǎng)度明顯較短，推測(cè)雷蒙德氏棉可能比亞洲棉和陸地棉對(duì)重金屬的反應(yīng)更為敏感。

PCS在植物中序列保守性高，但催化活性差異較大。早期的研究普遍認(rèn)為PCS基因是組成性表達(dá)，但催化活性受重金屬離子調(diào)控，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在小麥等的基因表達(dá)受重金屬離子濃度影響，可見(jiàn)該酶在不同物種中差異較大[23-25]。相較于其它作物，棉花對(duì)金屬脅迫有較強(qiáng)的抗性[2]，然而，有關(guān)棉花PCS基因結(jié)構(gòu)與特征還未見(jiàn)報(bào)道。棉屬種數(shù)量多、種間差異大，且對(duì)多種重金屬有著較好的耐性，是挖掘優(yōu)質(zhì)PCS基因的潛在對(duì)象。我們的研究結(jié)果也表明棉屬3個(gè)物種的PCS基因功能分化程度高于其他植物，這對(duì)棉屬PCS進(jìn)行深入研究意義重大。

4 結(jié)論

本研究在系統(tǒng)的全基因組信息基礎(chǔ)上，在陸地棉中鑒定出4個(gè)PCS家族基因，是其供體種的2倍，再次佐證了陸地棉由亞洲棉和雷蒙德氏棉進(jìn)化而來(lái)。棉花中PCS家族基因出現(xiàn)較大分化，相較于亞組II，歸屬亞組I的PCS可能具有較強(qiáng)的酶活性。雷蒙德氏棉對(duì)重金屬的敏感程度可能要高于陸地棉和亞洲棉。

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