一種防治棉花黃萎病的生物復(fù)合種衣劑的研制

陳麗華 ，何鵬飛 ,3，袁德超 ，歐曉慧 ，吳毅歆 ,3，何月秋 ,3*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明650201；3.微生物菌種篩選與應(yīng)用國家地方聯(lián)合工程研究中心，昆明650217）

播種包衣種子是控制土傳和種傳病害的重要手段。種衣劑具有保護(hù)種子、提高出苗率、防治病蟲害、促進(jìn)作物生長、增強(qiáng)抗逆性等作用[1-4]。為實(shí)現(xiàn)我國農(nóng)業(yè)部提出的 “兩減一增”（減化肥、減農(nóng)藥、增效益）的綠色防控目標(biāo)，生物農(nóng)藥的研發(fā)成為重點(diǎn)，其中以生物種衣劑和生物復(fù)合種衣劑為代表的新型種衣劑，能減少農(nóng)藥用量，降低病原菌和害蟲產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)展前景廣闊。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌LH-L3（Bacillus methylotrophicusCGMCC,No.12565，簡稱“LH-L3”）是本實(shí)驗(yàn)室從健康棉株葉片上分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌，平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)多種病原菌有抑制作用，經(jīng)溫室試驗(yàn)證明其對(duì)棉花黃萎病有很好的防病作用，且具有促生長效果[5]。為了充分利用該菌株的優(yōu)良特性，并應(yīng)用于作物生產(chǎn)，本文對(duì)LH-L3菌株與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配作為種衣劑的可行性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

原藥包括9種殺菌劑：98%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）咯菌腈 （湖北巨勝科技有限公司生產(chǎn)）；95%福美雙 （河北冠龍農(nóng)化有限公司生產(chǎn)）；98%氟啶胺和98%異菌脲 （江西施普潤農(nóng)化有限公司生產(chǎn)）；96%嘧菌酯、95%苯醚甲環(huán)唑和95.4%噻呋酰胺（浙江威爾達(dá)化工有限公司生產(chǎn)）；97%烯酰嗎啉和98%甲基硫菌靈（河北益海安格諾公司生產(chǎn)），1種殺蟲劑：94.06%克百威（湖南國發(fā)精細(xì)化工科技有限公司生產(chǎn)）。目前我國禁止克百威在蔬菜、果樹、茶樹、中草藥材上使用，并禁止用于防治衛(wèi)生害蟲。

助劑：農(nóng)乳602（上海倍科化工有限公司生產(chǎn)）；萘磺酸鈉甲醛縮合物（廣州市創(chuàng)琞化工科技有限公司生產(chǎn)）；黃原膠（河北金豐新材料科技有限公司生產(chǎn)）；糊化淀粉、苯甲酸鈉和甘油（山東浩中化工科技有限公司生產(chǎn)）；聚乙烯醇1750（常州市海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)）；玫瑰精（河南澳欣化工產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)）。

棉種（冀棉11）及棉花黃萎病菌（大麗輪枝菌Vd084，強(qiáng)致病力）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所李志芳博士惠贈(zèng)，LH-L3及其綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）基因序列標(biāo)記菌株 LH-L3-P43GFPmut3a（簡稱“LH-L3-GFP”）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 抑制棉花黃萎病殺菌劑的篩選

選用前述9種殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。以丙酮溶解氟啶胺、異菌脲、苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯，以N-甲基吡咯烷酮溶解烯酰嗎啉、福美雙、噻呋酰胺、甲基硫菌靈和咯菌腈。從培養(yǎng)好的玉米粒上洗下大麗輪枝菌孢子，依次稀釋10倍涂板，記錄每培養(yǎng)基平板菌落數(shù)為50～100的稀釋倍數(shù)，經(jīng)試驗(yàn)選擇稀釋100倍的菌液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

藥劑篩選：大麗輪枝菌在馬鈴薯蔗糖瓊脂（Potato-saccharose-agar，PSA） 培養(yǎng)基上生長緩慢，且其侵染是依靠萌發(fā)的孢子，而不是菌絲；因此，本試驗(yàn)采用計(jì)數(shù)孢子萌發(fā)菌落數(shù)計(jì)算菌落抑制率的方法評(píng)價(jià)化學(xué)農(nóng)藥的效果，這樣既省時(shí)，又準(zhǔn)確。統(tǒng)一設(shè)置1個(gè)濃度，將溶解的藥劑加入100 mL PSA培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中藥劑質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg·L－1（對(duì)于多數(shù)藥效極佳的農(nóng)藥來說，這是1個(gè)較高的質(zhì)量濃度，可用于評(píng)價(jià)殺菌效果），補(bǔ)足溶劑并保持各處理溶劑體積一致，以不含藥劑但含相同體積溶劑的處理為溶劑對(duì)照，PSA為空白對(duì)照。將稀釋100倍的菌液涂布于平板，每處理重復(fù)5次，25℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，觀察菌落生長情況。以PSA平板的菌落大小為參照，記錄含藥培養(yǎng)基上菌落的大小和數(shù)量，計(jì)算菌落抑制率（R，%）。R（%）=（NPSA－NM）×100/NPSA.式中，NPSA為不含藥PSA培養(yǎng)基菌落數(shù)量，NM為含藥PSA培養(yǎng)基菌落數(shù)量。依據(jù)R值確定抑菌效果最佳的藥劑，為下一步種衣劑中殺菌劑的選用提供依據(jù)。

1.3 LH-L3菌劑的制備

將LH-L3活化后，挑取單菌落接種到LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)液，在 37 ℃、轉(zhuǎn)速 180 r·min－1的搖床上培養(yǎng)4 d后，取菌液10 mL于80℃水浴加熱15 min，稀釋涂板法檢測(cè)芽孢生成量后，在常溫下離心除去部分培養(yǎng)液，制成芽孢含量109cfu·mL－1的菌劑。

1.4 種衣劑的配制

根據(jù)1.2中篩選出的殺菌劑，參照本實(shí)驗(yàn)室董麗萍[6]研制的懸浮劑助劑配方配制種衣劑。在文獻(xiàn)[6]助劑配方的基礎(chǔ)上，添加殺蟲劑克百威10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），芽孢含量 109cfu·mL－1的LH-L3（或是 LH-L3-GFP）菌劑 1%，即為 1號(hào)配方；在配方1基礎(chǔ)上，分別添加殺菌劑咯菌腈2.5%、福美雙10%，即為2、3號(hào)配方；在配方1基礎(chǔ)上，添加咯菌腈2.5%和福美雙10%，即為4號(hào)配方（咯·福·克生物復(fù)合種衣劑，Biological complex seed-coating agent，簡稱為 BCSA）。上述 4 種配方均用無菌水補(bǔ)足體積。

按配方稱取各原料，先將增稠劑和成膜劑放入容器中，加無菌水[6]，將該容器置于沸水中水浴加熱攪動(dòng)成糊狀，冷卻至48～52℃，再加入除菌劑以外的其余原料混合攪勻得混合原料，且留一部分無菌水用于沖洗容器，然后將混合原料倒入砂磨機(jī)中，用留下的無菌水沖洗容器壁上的原料并倒入砂磨機(jī)中，研磨至95%以上混合原料的粒度為5 μm，且混合原料的黏度大于600 mPa·s，即制成化學(xué)藥劑種衣劑[6]。再按上述配方的劑量加入芽孢含量109cfu·mL－1的LH-L3菌劑，充分混合均勻即得到各配方的種衣劑。

1.5 各配方種衣劑對(duì)帶菌種子的殺菌效果

帶菌種子的制備：選取飽滿的棉種于75%（體積分?jǐn)?shù)）酒精中浸泡5 min進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗5～6次，取出晾干后放入長滿大麗輪枝菌的平板中，用無菌鑷子拌勻，使棉種表面充分帶菌，然后取出放入無菌血清瓶中，于漩渦振蕩器上再次混勻，25℃培養(yǎng)箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將上述配方的4種種衣劑對(duì)帶大麗輪枝菌的棉花種子按藥種質(zhì)量比1∶50進(jìn)行包衣，分別于處理24 h、48 h后用無菌水振蕩洗下表面孢子，采用稀釋涂板法檢測(cè)大麗輪枝菌的存活情況，同時(shí)設(shè)不包衣的帶菌種子為空白對(duì)照（CK），所用平板為加1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）硫酸鏈霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （Potato dextrose agar medium，PDA），殺菌效果最佳的種衣劑用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 對(duì)種衣劑理化性質(zhì)的測(cè)定

參照GB/T 32775―2016《農(nóng)藥分散性測(cè)定方法》[7]、GB/T 14825―2006 《農(nóng)藥懸浮率測(cè)定方法》[8]、GB/T 19136―2003 《農(nóng)藥熱貯穩(wěn)定性測(cè)定方法》[9]、GB/T 19137―2003 《農(nóng)藥低溫穩(wěn)定性測(cè)定方法》[10]、GB/T 17768―1999 《懸浮種衣劑產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)范》[11]，進(jìn)行測(cè)定。

1.7 菌體存活情況測(cè)定

檢測(cè)標(biāo)記菌株LH-L3-GFP在種衣劑BCSA中是否與野生型菌株具有相同的耐受性。方法：按照野生型菌劑制備方法，將標(biāo)記菌株于氯霉素質(zhì)量濃度為10 mg·L－1的LB培養(yǎng)液中搖瓶培養(yǎng)4 d后，常溫離心除去部分培養(yǎng)液，制成芽孢含量達(dá)到109cfu·mL－1的菌劑，然后按配方比例加入化學(xué)種衣劑中，于相應(yīng)濃度的氯霉素平板中涂板檢測(cè)種衣劑中有效活菌數(shù)初始量。每月檢測(cè)1次含標(biāo)記菌株、野生型菌株2種種衣劑的有效活菌數(shù)量（簡稱“菌量”），檢測(cè)持續(xù)5個(gè)月。因標(biāo)記菌株具有氯霉素抗性，若標(biāo)記菌株與野生型菌株具有相同的耐受性，則用含標(biāo)記菌株的種衣劑進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

存儲(chǔ)期菌量的測(cè)定：分裝3份含標(biāo)記菌株LH-L3-GFP的種衣劑，每份100 mL，用于檢測(cè)種衣劑BCSA中菌量變化情況；同時(shí)將棉種表面消毒晾干后，按藥種質(zhì)量比1∶50包衣，用于檢測(cè)包衣棉種的菌量變化情況。2次試驗(yàn)的樣品同時(shí)置于4℃（冷貯）、37℃（熱貯）、室溫3個(gè)溫度條件下， 分別于 7 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、185 d檢測(cè)菌量。

1.8 種衣劑BCSA促進(jìn)棉花生長和防治黃萎病的作用

帶菌土的制備：采用玉米粒產(chǎn)孢法，將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上活化好的大麗輪枝菌菌絲塊接種到煮熟并滅菌的玉米粒上，每天搖動(dòng)1次玉米粒使其分散開，大約7 d后菌絲即可長滿整瓶玉米粒。從玉米粒上水洗孢子，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算懸浮液孢子含量，然后把孢子懸浮液澆在滅菌土上，充分混勻，制得孢子含量約為105cfu·g－1的帶菌土。

供試藥劑為BCSA和不加生防菌LH-L3的咯·?！た朔N衣劑（簡稱為“CSA”），用 2.5%咯菌腈懸浮種衣劑（簡稱為“FSA”，瑞士先正達(dá)公司生產(chǎn)）作對(duì)照藥劑，參照上述試驗(yàn)以及說明書推薦劑量， 分別按藥種質(zhì)量比 1∶50、1∶50、1∶250對(duì)棉種進(jìn)行包衣處理，種子晾干后播種于14 cm×21 cm（直徑×高度）的花盆中，每處理3盆，每盆10粒棉種，以未包衣種子為裸種對(duì)照。棉種出苗2 d（出苗率50%以上）、15 d（出苗結(jié)束）時(shí)調(diào)查出苗率，出苗后15 d測(cè)量株高、最大葉片寬度，裸種對(duì)照發(fā)?。úシN后 25 d）2 d、5 d、10 d、17 d 時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。按5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算病情指數(shù)和相對(duì)防效[12]。

1.9 種衣劑防治棉花葉部害蟲的初步試驗(yàn)

試驗(yàn)于2016年5月17日至6月3日在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行，試驗(yàn)期間溫室窗戶一直開啟。用BSCA按藥種質(zhì)量比1∶50對(duì)棉種包衣，以裸種作空白對(duì)照，按上述方法進(jìn)行播種，每處理重復(fù)5盆。試驗(yàn)盆置于溫室窗戶口，待種子出苗后每天觀察葉片上是否出現(xiàn)蟲害，并調(diào)查蟲害發(fā)生情況，記錄每株幼苗上害蟲數(shù)量和每片葉上蟲孔數(shù)量。計(jì)算被害率和防治效果（E）[13]。公式：E（%）=（NCK－NT）/NCK×100.式中，NCK為對(duì)照每葉蟲孔數(shù)，NT為處理每葉蟲孔數(shù)。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.5軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測(cè)定結(jié)果，并做Duncan's多重比較，采用MS Excel 2003制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制棉花黃萎病菌的殺菌劑篩選

供試9種藥劑對(duì)大麗輪枝菌均表現(xiàn)出一定的毒力，但毒力差異較大（表1），所用溶劑對(duì)菌落生長無影響。培養(yǎng)基中藥劑質(zhì)量濃度為1 mg·L－1時(shí)，氟啶胺對(duì)大麗輪枝菌的抑制作用最強(qiáng)，其次為福美雙、咯菌腈、苯醚甲環(huán)唑、嘧菌酯，其他藥劑抑制效果不明顯。根據(jù)市場(chǎng)上已有的棉花種衣劑以及成本，選用福美雙、咯菌腈進(jìn)行下一步種衣劑配制試驗(yàn)。

2.2 各配方種衣劑對(duì)帶菌種子的殺菌效果

4種配方的種衣劑對(duì)帶菌種子具有不同殺菌效果（表2）。其中：4號(hào)配方殺菌效果最強(qiáng)，于包衣后24 h，其處理的帶菌種子上的大麗輪枝菌就已被完全殺死；3號(hào)配方殺菌效果次之，在包衣后24 h，其處理的帶菌種子上的大麗輪枝菌數(shù)量不足空白對(duì)照（CK）的0.1%；1號(hào)和2號(hào)配方殺菌效果相差不大，它們處理的帶菌種子上的大麗輪枝菌數(shù)量不足CK的1%。因此，選擇同時(shí)含有生防菌和2種殺菌劑的4號(hào)配方種衣劑為后續(xù)試驗(yàn)的種衣劑。

表1 9種不同殺菌劑（1 mg·L－1）與溶劑對(duì)大麗輪枝菌菌落生長的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of 9 chemical fungicides against colony growth ofV.dahliae

2.3 生物復(fù)合懸浮種衣劑理化性質(zhì)的測(cè)定

由4號(hào)配方生物復(fù)合懸浮種衣劑的各項(xiàng)理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（表3）可知，該種衣劑懸浮率較高，成膜時(shí)間短，包衣較均勻，不易脫落，各測(cè)定項(xiàng)均在國家標(biāo)準(zhǔn)[7-11]范圍內(nèi)；貯藏穩(wěn)定性較好，熱貯、冷貯前后各項(xiàng)指標(biāo)僅有微小變化，且經(jīng)過振搖很快恢復(fù)原狀，包衣均勻度和脫落率不受影響。這說明該生物復(fù)合懸浮種衣劑符合國家標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的貯藏穩(wěn)定性。

2.4 標(biāo)記菌株LH-L3-GFP和野生型菌株LHL3在種衣劑BCSA中的存活情況

由圖1可知，2個(gè)菌株（標(biāo)記菌株LH-L3-GFP和野生型菌株LH-L3）對(duì)種衣劑BCSA的耐受性均較好，即標(biāo)記菌株的耐受性沒有因?yàn)榧尤隚FP標(biāo)記而降低。貯藏6個(gè)月，2個(gè)菌株在BCSA中的菌量均保持在105cfu·mL－1左右，表明標(biāo)記菌株在BCSA中可存活，且耐受性與野生型菌株相當(dāng)。因此，標(biāo)記菌株可代替野生型菌株進(jìn)行種衣劑BCSA貨架期的檢測(cè)。

2.5 不同貯藏溫度對(duì)種衣劑BCSA中菌量的影響

將BCSA置于室溫、37℃、4℃貯藏環(huán)境中6個(gè)月，通過對(duì)菌量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)LH-L3-GFP菌株存活有一定影響，但各貯藏溫度下BCSA中LH-L3-GFP菌量都隨貯藏時(shí)間呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)（圖2）。貯藏30 d，冷貯的BCSA中菌量比室溫貯藏和熱貯的菌量低1個(gè)數(shù)量級(jí)，但貯藏60～90 d，3個(gè)溫度下BCSA中菌量基本相同，貯藏90 d以后，熱貯和冷貯的BCSA中菌量均比室溫貯藏低，至185 d時(shí)室溫貯藏、熱貯、冷貯BCSA中菌量分別為 1.1×105cfu·mL－1、4.2×104cfu·mL－1、2.8×104cfu·mL－1。 建議該種衣劑置于室溫貯藏，并且每隔半年加入少量生防菌劑，使菌量保持在 107～108cfu·mL－1。

圖1 常溫下2個(gè)菌株在生物復(fù)合種衣劑BCSA中的存活情況Fig.1 Survival of tow bacterium strains in BCSA at the room temperature

圖2 不同貯藏溫度下LH-L3-GFP在種衣劑BCSA中的存活情況Fig.2 The survival rate of the bacterium LH-L3-GFP in BCSA at different storage temperatures

2.6 不同貯藏溫度對(duì)包衣棉種表面LH-L3-GFP菌量的影響

結(jié)果（圖3）顯示：在室溫和37℃貯藏 1個(gè)月，包衣棉種表面LH-L3-GFP菌量均出現(xiàn)上升趨勢(shì)，且在37℃下菌量增加得多，之后菌量趨于平衡，一直維持在2×104cfu·g－1左右；4℃貯藏的包衣棉種表面菌量一直低于室溫和37℃貯藏，但也維持在104cfu·g－1。至貯藏6個(gè)月時(shí)，室溫、37℃和4℃貯藏的包衣棉種表面菌量分別為9.6×103cfu·g－1、7.8×103cfu·g－1、4.5×103cfu·g－1，下降了50%～80%。因此，包衣棉種貯藏于室溫最佳，貯藏時(shí)間不宜超過半年。

圖3 不同貯藏溫度下LH-L3-GFP在BCSA包衣棉種表面的存活情況Fig.3 The bacterium LH-L3-GFP survival on surface of seeds coated by BCSA at different storage temperatures

2.7 種衣劑對(duì)棉花生長和黃萎病的防治效果

2.7.1種衣劑對(duì)棉花生長的影響。棉種包衣處理后，播種于帶黃萎病菌的土中，2.5%咯菌腈種衣劑（FSA）處理與裸種對(duì)照相比出苗率差別不大，出苗 2 d時(shí)，22.5%咯·福·克種衣劑 （CSA）和22.5%BCSA與對(duì)照相比出苗率分別提高9.10%、13.64%；至出苗15 d，各處理出苗情況已穩(wěn)定，咯·?！た朔N衣劑和BCSA與對(duì)照相比出苗率分別提高 7.68%、11.54%，2.5%FSA、22.5%CSA和22.5%BCSA與對(duì)照相比，棉苗株高分別增加8.91%、－4.07%、18.74%，最大葉寬分別增加 15.82%、－5.36%、20.91%。 因此，22.5%BCSA對(duì)棉種出苗和棉苗生長有明顯的促進(jìn)作用。

2.7.2種衣劑對(duì)棉花黃萎病的室內(nèi)防治效果。從發(fā)病情況可看出，隨發(fā)病時(shí)間的延長，各處理植株病情呈動(dòng)態(tài)變化，但FSA處理的相對(duì)防效始終最差，CSA處理的相對(duì)防效呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，BCSA處理的相對(duì)防效出現(xiàn)升-降-升的變化趨勢(shì)。發(fā)病2 d時(shí)，F(xiàn)SA、CSA和BCSA包衣處理與對(duì)照相比發(fā)病率分別降低19.80%、44.41%、65.42%，病情指數(shù)分別降低8.65%、69.69%、44.86%，此時(shí)CSA相對(duì)防效高于BCSA處理。發(fā)病5 d時(shí)，F(xiàn)SA、CSA和BCSA包衣處理與對(duì)照相比病情指數(shù)分別降低10.84%、51.45%、48.56%，此時(shí)CSA相對(duì)防效略高于BCSA處理。發(fā)病10 d時(shí)，CSA和BCSA處理發(fā)病情況和相對(duì)防效基本一致，但再過7 d，BCSA處理相對(duì)防效已明顯超過CSA處理。因此，CSA和BCSA包衣處理對(duì)初期的黃萎病均有較好的防治效果，并且加有生防菌LH-L3的生物復(fù)合種衣劑相比純化學(xué)種衣劑防病效果更佳。FSA的相對(duì)防效較低是因?yàn)槠溆行С煞忠陀贑SA和BCSA。

表4 棉種的出苗率以及棉苗的株高和最大葉寬Table 4 Seed emergence rate,seedling height and maximum leaf width of cotton

2.8 BCSA防治棉花葉部害蟲效果初探

本試驗(yàn)于棉種出苗第2天觀察到害蟲，經(jīng)觀察鑒定該害蟲為棉大卷葉螟（圖5-A），但可能受環(huán)境及天敵的影響，出苗第6天時(shí)空白對(duì)照和包衣處理均已觀察不到蟲體。出苗第6天時(shí)，BCSA包衣處理的棉苗蟲害明顯降低，被害株率為13.64%，比空白對(duì)照降低66.92百分點(diǎn)；BCSA包衣處理棉苗每片葉上蟲孔僅為5.52個(gè)，大幅低于空白對(duì)照的每片葉39.65個(gè)（圖5），防治效果達(dá)到92.33%。因此，初步認(rèn)為該種衣劑對(duì)棉大卷葉螟具有較好的防治效果。

圖4 不同種衣劑包衣棉種幼苗的發(fā)病情況Fig.4 The disease incidence of seedling of coated cotton seeds with different agents

圖5 棉大卷葉螟及其對(duì)棉苗的危害Fig.5 Sylepta derogataand its damage to cotton seedlings

3 討論

傳統(tǒng)的種衣劑已被廣泛用于作物生產(chǎn)，但近年來人們?nèi)找嬉庾R(shí)到化學(xué)藥物對(duì)環(huán)境的危害[14]。目前，內(nèi)生細(xì)菌作為藥學(xué)和農(nóng)業(yè)上具有廣泛應(yīng)用前景的新資源，受到全世界的關(guān)注，尤其在微生物農(nóng)藥領(lǐng)域?qū)ζ溲芯扛鼮樯钊?。由本?shí)驗(yàn)室自主研制的含有菌株Y2（專利號(hào)：ZL 20031010-4195.6）的2%戊唑醇生物復(fù)合種衣劑，對(duì)水稻[15]、牧草[16]、玉米[4]等多種單子葉和豆科植物具有較好的促生長效果。但在研究適用作物范圍時(shí)發(fā)現(xiàn)該種衣劑對(duì)油菜、棉花等部分雙子葉作物存在明顯抑制效果。因此，本試驗(yàn)以不能使用戊唑醇生物種衣劑的作物——棉花植株為分離材料，得到對(duì)棉花黃萎病有較強(qiáng)抑制效果的內(nèi)生菌株，并利用該菌株研制出1種新型微生物復(fù)合種衣劑。

在研究種衣劑配方前，我們首先進(jìn)行了抑制棉花黃萎病殺菌劑的篩選試驗(yàn)，在單純微生物種衣劑效果不佳的情況下添加1種或2種殺菌劑輔助殺菌，在此考慮到成本和市場(chǎng)上已有的棉花種衣劑，選用福美雙和咯菌腈進(jìn)行試驗(yàn)。福美雙是1種高效低毒的具有保護(hù)作用且抗菌廣譜的硫代氨基甲酸酯類殺菌劑，化學(xué)名稱為二硫化四甲基秋蘭姆[17]。咯菌腈（適樂時(shí)）是1種新型的非內(nèi)吸性苯基吡咯類殺菌劑，是假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）的不同種產(chǎn)生的次生代謝物硝吡咯菌素的類似物[18]，最大的特點(diǎn)是高效、低毒、低殘留。目前，這2種殺菌劑均被廣泛地應(yīng)用于防治農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的真菌性病害。市面上以它們?yōu)橛行С煞种瞥傻膽腋》N衣劑也很多，其中可用于棉種包衣的種衣劑如：400 g·L－1福美雙·萎銹靈懸浮種衣劑對(duì)棉花苗期立枯病防治效果在85%左右[19]；20%福美雙·甲基立枯磷懸浮種衣劑按質(zhì)量比1∶40～1∶50包衣棉種，可以有效防治棉花苗期炭疽病和立枯病[20]；2.5%適樂時(shí)懸浮種衣劑在棉種播種前800～1 000 mL包衣100 kg種子，可以有效防止棉花苗期病害發(fā)生，其保苗率和相對(duì)防效均在80%以上[21]。因此，福美雙和咯菌腈可以用于棉種包衣。

由于本實(shí)驗(yàn)室已有配制2%戊唑醇微生物復(fù)合種衣劑的基礎(chǔ)，因此懸浮種衣劑中助劑的成分、比例以及制備方法均按照前人結(jié)果進(jìn)行操作即可。在種衣劑有效成分的確定中，采用單一有效成分和分別復(fù)配的方法進(jìn)行，確保種衣劑的殺菌效果，同時(shí)避免重復(fù)添加造成的浪費(fèi)，殺菌劑均是按照市場(chǎng)上已有種衣劑的比例進(jìn)行添加[22-24]。本試驗(yàn)中，只含生防菌或含生防菌與1種殺菌劑的種衣劑對(duì)種子表面黃萎病菌的殺菌效果均低于同時(shí)含生防菌、福美雙和咯菌腈的種衣劑。因此，要達(dá)到較好的殺滅黃萎病菌效果必須同時(shí)添加這3種有效成分。此外，大部分作物在生長過程中很容易遭受蟲害，因此，新研制的微生物復(fù)合種衣劑 （BCSA）中還加有10%的克百威。試驗(yàn)表明，該種衣劑對(duì)棉大卷葉螟有一定的防治效果，但對(duì)其他害蟲的防治效果有待田間試驗(yàn)檢驗(yàn)。

雖然芽孢桿菌能形成有較強(qiáng)耐受力的芽孢，但由于BCSA中含有福美雙和咯菌腈2種殺菌劑，LH-L3菌株對(duì)這2種殺菌劑的耐受性尚不清楚，因此其存儲(chǔ)期菌量的變化也是研究的重點(diǎn)。在不確定熒光標(biāo)記菌株和野生型菌株在BCSA中耐受力差異的情況下，采用這2個(gè)菌種同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)菌株耐受性均較好，標(biāo)記菌株與野生型菌株幾乎無差異。室溫貯藏6個(gè)月該種衣劑中菌量仍保持105cfu·mL－1，降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)左右，穩(wěn)定性較好。但若要保持該種衣劑殺菌效果，建議每隔半年適當(dāng)加入少量生防菌劑，使其含菌量達(dá)到 107～108cfu·mL－1。

4 結(jié)論

LH-L3菌株與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配作為種衣劑完全可行，且本試驗(yàn)研制的生物復(fù)合種衣劑對(duì)棉花黃萎病和棉大卷葉螟有較好的防治效果。

[1]雷斌,李進(jìn),段留生,等.種衣劑對(duì)低溫處理下棉花胚根及幼苗外部形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國農(nóng)業(yè)氣象,2017,38(4):248-256.Lei Bin,Li Jin,Duan Liusheng,et al.Effect of seed coating agents on external morphology and ultrastructure of cotton radicles and seedlings under low temperature treatments[J].Chinese Journal of Agrometeorology,2017,38(4):248-256.

[2]劉銅,申永強(qiáng),劉震,等.3種種衣劑對(duì)蕓豆根腐病的防治效果[J].植物保護(hù),2017,43(2):216-219.Liu Tong,Shen Yongqiang,Liu Zhen,et al.Control effect of three kinds of seed-coating formulations on the root rot of kidney beans[J].Plant Protection,2017,43(2):216-219.

[3]任美鳳,陸俊姣,李大琪,等.2種種衣劑對(duì)小地老虎幼蟲的毒力測(cè)定及保苗效果[J].中國植保導(dǎo)刊,2017,37(4):68-70.Ren Meifeng,Lu Junjiao,Li Daqi,et al.Determination of the toxicity for the larve of blank cutworm and protect the seedling effect by the two kinds of seed coating agents[J].China Plant Protection,2017,37(4):68-70.

[4]崔文艷,何鵬飛,何朋杰,等.微生物復(fù)合種衣劑對(duì)玉米發(fā)芽、苗期生理特性及產(chǎn)量的影響[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)),2016,31(4):630-636.Cui Wenyan,He Pengfei,He Pengjie,et al.Effect of mirobial complex seed-coating agent on germination,seedling biological traits and yield of maize[J].Journal of Yunnan Agricultural University(Natural Science),2016,31(4):630-636.

[5]陳麗華,袁德超,吳毅歆,等.棉花黃萎病生防內(nèi)生芽孢桿菌LH-L3的分離鑒定[J].棉花學(xué)報(bào),2017,29(6):550-559.Chen Lihua,Yuan Dechao,Wu Yixin,et al.Isolation and characterization of endophyticBacillus methylotrophicusLH-L3 antagonist of cotton Verticillium wilt[J].Cotton Science,2017,29(6):550-559.

[6]董麗萍.解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2復(fù)合懸浮劑的研制及在油菜上的應(yīng)用效果[D].昆明:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.Dong Liping.Development and application of a compound suspension agent containingBacillus amyloliquefaciensB9601-Y2 on canola[D].Kunming:Yunnan Agricultural University,2012.

[7]全國農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).農(nóng)藥分散性測(cè)定方法:GB/T 32775―2016[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2017.Committee on Standardization of Pesticides in China.Testing method of dispersibility for pesticide:GB/T 32775―2016[S].Beijing:China Standards Press,2017.

[8]全國農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).農(nóng)藥懸浮率測(cè)定方法:GB/T 14825―2006[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2007.Committee on Standardization of Pesticides in China.Method for determination of pesticide suspension rate:GB/T 14825―2006[S].Beijing:China Standards Press,2007.

[9]全國農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).農(nóng)藥熱貯穩(wěn)定性測(cè)定方法:GB/T 19136―2003[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.Committee on Standardization of Pesticides in China.Method for determination of heat storage stability of pesticide:GB/T 19136―2003[S].Beijing:China Standards Press,2003.

[10]全國農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).農(nóng)藥低溫穩(wěn)定性測(cè)定方法:GB/T 19137―2003[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.Committee on Standardization of Pesticides in China.Method for determination of low temperature stability of pesticide:GB/T 19137―2003[S].Beijing:China Standards Press,2003.

[11]沈陽化工研究所.懸浮種衣劑產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)范:GB/T 17768―1999[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2000.Shenyang Chemical Industy Research Institute.Guidelines on drafting standards of suspension concentrates for seed dressing:GB/T 17768―1999[S].Beijing:China Standards Press,2000.

[12]Xue Lei,Xue Quanhong,Chen Qin,et al.Isolation and evaluation of rhizosphere actinomycetes with potential application for biocontrol of Verticillium wilt of cotton[J].Crop Protection,2013,43(1):231-240.

[13]孫毅民,吳炳芝,段文學(xué).白菜地黃條跳甲新防治方法的研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2000(1):32-33.Sun Yimin,Wu Bingzhi,Duan Wenxue.A new method for control striped flea-beetles in cabbage fields[J].Heilongjiang Agricultural Science,2000(1):32-33.

[14]Zeng Defang,Wang Fang,Wang Zhen.Preparation and study of a novel,environmentally friendly seed-coating agent for wheat[J].Communications in Soil Science and Plant Analysis,2012,43(10):1490-1497.

[15]陳麗華,高秋雨,張家恒,等.生物復(fù)合種衣劑對(duì)水稻苗期生長的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2015,31(12):105-110.Chen Lihua,Gao Qiuyu,Zhang Jiaheng,et al.Effect of a biological complex seed-coating agent on rice seedling growth[J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2015,31(12):105-110.

[16]陳麗華,高秋雨,張家恒,等.生物復(fù)合種衣劑對(duì)4種牧草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[J].草地學(xué)報(bào),2016,24(1):231-236.Chen Lihua,Gao Qiuyu,Zhang Jiaheng,et al.Effect of a biological complex seed-coating agent on the germination and seedling growth of four pasture grass[J].Acta Agrestia Sinica,2016,24(1):231-236.

[17]花日茂,湯桂蘭,李學(xué)德,等.幾種農(nóng)藥在煙草上的消解動(dòng)態(tài)與復(fù)合效應(yīng)[J].中國環(huán)境科學(xué),2003,23(4):440-443.Hua Rimao,Tang Guilan,Li Xuede,et al.Degradation dynamics and combined effect of several pesticides in tobacco[J].China Environmental Science,2003,23(4):440-443.

[18]楊玉柱,焦必寧.新型殺菌劑咯菌腈研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2007,6(5):35-39.Yang Yuzhu,Jiao Bining.Advances in the research of a new fungicide fludioxonil[J].Modern Agrochemicals,2007,6(5):35-39.

[19]師勇強(qiáng),馮自力,李志芳,等.400 g·L－1福美雙·萎銹靈懸浮種衣劑對(duì)棉花苗期立枯病的防治效果[J].中國棉花,2014,41(9):28-30.Shi Yongqiang,Feng Zili,Li Zhifang,et al.Control of cotton seedlingRhizoctonia solanidisease by 400 g·L－1thiram·carboxin suspending formulations for seed coating[J].China Cotton,2014,41(9):28-30.

[20]張俊飛,吳孔明,楊華.福美雙·甲基立枯磷懸浮種衣劑對(duì)棉花苗期病害的防效研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2001,7(3):47-48.Zhang Junfei,Wu Kongming,Yang Hua.Effects of thiram-tolelofosmethyl flowable seed coating agents against seeding disease of cotton[J].Anhui Agricultural Science Bulletin,2001,7(3):47-48.

[21]孫紅煒,楊崇良,路興波,等.2.5%適樂時(shí)懸浮種衣劑防治棉花苗期病害研究[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2006,5(1):38-39.SSun Hongwei,Yang Chongliang,Lu Xingbo,et al.Effect of 2.5%fludioxonil FSC on cotton seedling diseases in the field[J].Modern Agrochemicals,2006,5(1):38-39.

[22]李防洲,辛慧慧,周廣威,等.水楊酸包衣劑包衣棉種對(duì)棉花幼苗抗寒性的影響[J].棉花學(xué)報(bào),2015,27(6):589-594.Li Fangzhou,Xin Huihui,Zhou Guangwei,et al.Effects of the seed film coating salicylic acid on the chilling tolerance of cotton seedlings[J].Cotton Science,2015,27(6):589-594.

[23]李防洲,冶軍.復(fù)合外源調(diào)節(jié)劑種子包衣在滴灌棉田應(yīng)用研究[J].中國棉花,2017,44(4):11-14.Li Fangzhou,Ye Jun.Study on application effects of composite coating with exogenous regulator substances in the dropper cotton field[J].China Cotton,2017,44(4):11-14.

[24]婁善偉,張鵬忠,王大光,等.枯草芽孢桿菌種子包衣對(duì)棉花黃萎病抑制作用的研究[J].中國棉花,2016,43(6):28-30.Lou Shanwei,Zhang Pengzhong,Wang Daguang,et al.Study on the inhibitory effect of cotton Verticillium wilt by seed coating withBacillus subtilis[J].China Cotton,2016,43(6):28-30.