基于rDNA-ITS和組蛋白3基因序列分析鑒定新疆棉花葉斑病病原

李映程 ，張國(guó)麗 ，任毓忠 ，李海強(qiáng) ，武剛 ，李天義 ，李國(guó)英 *，張莉 *

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所，新疆石河子832000；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊830000；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆阿拉爾843300；5.新疆塔里木河種業(yè)股份有限公司，新疆阿拉爾843300）

棉花葉斑病在世界各大植棉區(qū)普遍發(fā)生，也是我國(guó)棉花上的1種常見病害，其中鏈格孢菌（Alternariaspp.）是引起葉斑病的1類重要病原。但各地報(bào)道引起葉斑病的鏈格孢菌種類存在較大差異。Sciumbato等[1]1972年報(bào)道印度棉花輪紋斑病是由Alternaria macrospora引起的。在美國(guó)密蘇里州（Missouri）、路易斯安那州（Louisiana）以及以色列，該病也是由A.macrospora造成的；原蘇聯(lián)棉區(qū)發(fā)生的葉斑病主要由大孢鏈格孢（A.macrospora）和棉鏈格孢菌（A.gossypina）引起[2]；Palmateer等2000年和2001年調(diào)查美國(guó)亞拉巴馬州（Alabama）陸地棉葉斑病，最常見的病原為A.alternata[3]。我國(guó)棉花輪紋斑病病原以大孢鏈格孢（A.macrocpora）、細(xì)極鏈格孢（A.tenuissima）和棉鏈格孢（A.gossypina）等為常見種，最常見的為大孢鏈格孢（A.macrospora）[4-5]。張文蔚等從北京、天津、新疆、山東、河北、河南、江蘇等地采集17份葉斑病樣品鑒定，16份為A.alternata，只有1份從天津棉田采集的為A.macrospora[6]。陳凱等鑒定河南省洛陽(yáng)市、三門峽市、周口市和河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉田（鄭州市）發(fā)生的棉花葉斑病由A.tenuissima引起[7]。

新疆是我國(guó)最大的棉區(qū)，屬典型的大陸性氣候，春季常有明顯的倒春寒，秋季降溫快，是我國(guó)棉花葉斑病的常發(fā)區(qū)[8]，但對(duì)其病原尚未進(jìn)行較為系統(tǒng)的調(diào)查和鑒定，為此開展了本研究。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查、病樣采集及癥狀描述

2016年在棉花苗期和中后期，棉花葉斑病分別在石河子和阿克蘇植棉區(qū)大發(fā)生。為此于2016年和2017年，以北疆石河子和南疆阿克蘇（主要種植陸地棉，也種植長(zhǎng)絨棉）為主，分別對(duì)北疆石河子、昌吉、博樂(lè)、阿勒泰和南疆阿克蘇、喀什、和田等7個(gè)地區(qū)30個(gè)地點(diǎn)的棉花葉斑病發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查，并采集典型癥狀的病樣206份，供分離鑒定。同時(shí)對(duì)田間癥狀和接種后的癥狀進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)觀察和描述。

1.2 病原分離、純化及代表性菌株的選擇

采用常規(guī)組織分離法，即將所采病樣經(jīng)流水沖洗后，從病健交界處剪取4～5 mm2的組織塊，用0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）升汞消毒5～10 s，無(wú)菌水漂洗3次后，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （Potato dextrose agar medium，PDA）上，25℃恒溫培養(yǎng) 2 d后，挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行純化；并根據(jù)病樣采集時(shí)間、地點(diǎn)、分離菌株的數(shù)量及菌落的培養(yǎng)特征，按南疆、北疆分苗期（5―6月份采樣）和生長(zhǎng)中后期（主要在8―9月份，個(gè)別在7月上旬采樣），各選取10個(gè)代表性菌株（共40個(gè)代表性菌株），4℃保存在PDA上，供鑒定用。

1.3 病原致病性測(cè)定

采用離體葉片接種法。采集植株相同部位的健康葉片，清洗干凈，用75%（體積分?jǐn)?shù)）酒精輕輕擦拭葉片表面，消除雜菌，4℃處理24 h后供接種用。接種前用少量無(wú)菌水洗下在PDA上培養(yǎng)7 d的分生孢子，用血球計(jì)數(shù)板按常規(guī)方法配制每毫升1×107個(gè)分生孢子的懸浮液，采用噴霧法進(jìn)行接種，重復(fù)3次，以無(wú)菌水為對(duì)照。接種結(jié)束后，將其置于12 cm×12 cm、墊有濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙的發(fā)芽盒中，放入白天18℃、夜間12℃的智能光照培養(yǎng)箱中，定期觀察并記錄發(fā)病情況。發(fā)病后，觀察其癥狀并進(jìn)行分離和鏡檢，明確與原接種菌的異同。

1.4 病原鑒定

1.4.1形態(tài)學(xué)鑒定。用刀片直接刮取病斑處的分生孢子，觀察其形態(tài)、顏色并記錄分生孢子的縱橫膈膜數(shù)，測(cè)量50個(gè)分生孢子的大小。挑取純化后的供試菌株在PDA上培養(yǎng)5 d，觀察并描述菌落形態(tài)和顏色。采用常規(guī)玻片培養(yǎng)法，25℃下培養(yǎng)5 d，觀察、記錄其分生孢子的著生狀態(tài)并拍照，作為病原鑒定的主要形態(tài)學(xué)依據(jù)，參照《中國(guó)真菌志》（第十六卷）鏈格孢屬[9]對(duì)病原進(jìn)行鑒定。

1.4.2分子生物學(xué)鑒定。用滅菌刀片刮取在PDA上25℃培養(yǎng)7 d的各供試菌株的菌絲體。用BioFlux試劑盒提取供試菌株的基因組DNA。參照Kusaba等[10]和王洪凱等[11]報(bào)道，用真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）通用引物[ITS1 （5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），由上海生物工程股份有限公司合成]進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR），反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，反應(yīng)體系為 25 μL；參照王泰云等[12]、楊超等[13]的報(bào)道，用組蛋白3基因擴(kuò)增引物[H3-1a（5'-ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG-3'）和H3-1b（5'-GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT-3'），由上海生物工程股份有限公司合成]進(jìn)行PCR，反應(yīng)程序：96℃預(yù)變性 2 min；96℃變性 15 s，55℃退火30 s，75℃延伸 35 s，共 30個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 2 min，反應(yīng)體系為 25 μL。

2對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別用1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像儀上觀察并拍照。在ZF-90型多功能暗箱式紫外透射儀下切取目的片段，使用全式金凝膠回收試劑盒（Easy Pure Quick Gel Extraction Kit）回收目的片段。純化后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α。PCR檢測(cè)篩選陽(yáng)性克隆，送到上海生物工程有限公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，應(yīng)用MEGA 5.0軟件中的臨近法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建病原系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株間的親緣關(guān)系，確定病原分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花葉斑病發(fā)病情況的調(diào)查和癥狀描述

2016年和2017年在南北疆植棉區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病在新疆整個(gè)生長(zhǎng)期雖然都可發(fā)生，但主要在棉花苗期和生長(zhǎng)后期發(fā)生較重。不同時(shí)期、不同年份和不同地區(qū)間發(fā)病情況有較大差異。如2016年春季，北疆棉區(qū)由于持續(xù)低溫多雨，棉花苗期葉斑病大發(fā)生，發(fā)病率高達(dá)100%，明顯抑制幼苗生長(zhǎng)和發(fā)育；8月下旬南疆阿克蘇地區(qū)遭遇冰雹，之后葉斑病大發(fā)生，不少棉田棉花一片枯焦，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。2017年由于苗期和生長(zhǎng)后期氣候比較正常，該病發(fā)生相對(duì)較輕。

無(wú)論是陸地棉還是長(zhǎng)絨棉，苗期子葉、真葉均可發(fā)病，發(fā)病初期子葉和真葉上均產(chǎn)生紫紅色或褐色、中部稍凹陷的小型斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大成外緣紅褐色或褐色、圓形或不規(guī)則形、直徑2～3 mm的病斑，嚴(yán)重時(shí)病斑彼此連接成片，形成大型的褐色枯死斑，導(dǎo)致葉片焦枯、脫落。生長(zhǎng)后期發(fā)病的癥狀和苗期基本相同，均主要為害葉片產(chǎn)生葉斑，典型的輪紋很少，只有在條件非常有利發(fā)病的情況下才會(huì)出現(xiàn)。據(jù)在阿克蘇地區(qū)調(diào)查，該病在長(zhǎng)絨棉上發(fā)生一般重于陸地棉，在長(zhǎng)絨棉上不僅感染葉片，還感染苞葉，并在莖稈上產(chǎn)生細(xì)長(zhǎng)的梭狀條斑。

供試菌株接種后的癥狀和田間癥狀相同，主要在葉片產(chǎn)生斑點(diǎn)，極少產(chǎn)生典型的輪紋。

2.2 病原分離及代表性菌株的選擇

從南疆、北疆所采集的206份典型葉斑病樣中，成功分離出180個(gè)鏈格孢屬（Alternariaspp.）菌株，分離率達(dá)87.4%。選取40個(gè)代表性菌株供病原鑒定。其中，1～20號(hào)為北疆病樣（1～10為苗期，11～20為生長(zhǎng)中后期），21～40為南疆病樣（21～30為苗期，31～40為生長(zhǎng)中后期）。具體情況見表1。

2.3 病原致病性測(cè)定

室內(nèi)接種5 d后，葉片開始出現(xiàn)黑褐色斑點(diǎn)，癥狀與自然病害癥狀相似，40個(gè)代表性菌株均會(huì)引起葉片發(fā)病，對(duì)照組棉花葉片則未出現(xiàn)癥狀。從發(fā)病組織中再次分離的菌株與原接種菌形態(tài)特征一致。根據(jù)柯赫氏法則，40個(gè)代表性菌株均具有致病性。

2.4 病原鑒定

2.4.1形態(tài)學(xué)鑒定。經(jīng)形態(tài)觀察，初步可將供試菌株分為3類。第1類包括1～6、19和20號(hào)，共8個(gè)菌株，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初期菌落灰白色，后期中央略微隆起，褐色或深褐色，毛氈狀，基質(zhì)淺褐色至褐色。分生孢子梗單生或簇生，直立或彎曲；分生孢子單生或2～11個(gè)串生，具3～7個(gè)橫膈，2～4個(gè)縱膈或斜膈，大?。?2.5～35.0）μm×（5.0～12.5）μm，黃褐色或褐色，棒形、倒梨形；有喙或無(wú)喙，喙錐形或短柱狀，（2.0～12.5）μm×（1.5～4.5）μm。 初步鑒定為A.alternata（圖1 A1、A2、A3）。

第2類包括 7～10、12～18、21～30 和31～36號(hào)，共27個(gè)菌株，其形態(tài)和第1類比較相似，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落初期灰白色，后期中央略微隆起，灰白色至深灰綠色或深橄欖綠色，絨毛狀，基質(zhì)淺褐色至褐色。分生孢子梗單生或簇生，直立或曲膝狀彎曲；分生孢子倒棍棒形、卵圓形或近橢圓形，淡褐色至暗褐色，單生或7～15個(gè)串生，具4～7個(gè)橫膈，2～7個(gè)縱膈或斜膈，大小 （17.5～50.0）μm×（5.0～15.5）μm； 有喙或無(wú)喙，喙錐形或短柱狀，大小 （2.5～15.0）μm×（2.5～4.5）μm。 初步鑒定為A.tenuissima（圖 1 B1、B2、B3）。

表1 菌株樣品編號(hào)及來(lái)源Table 1 Number and source of strain samples

表1（續(xù)）Table 1 (Continued)

圖1 鏈格孢（A1、A2、A3）、細(xì)極鏈格孢（B1、B2、B3）和大孢鏈格孢（C1、C2、C3）菌落、分生孢子及著生方式Fig.1 Colonies,sub spore and the mode of production ofA.alternata(A1,A2,A3),A.tenuissima(B1,B2,B3)and A.macrospora (C1,C2,C3)

第3類包括11和37～40號(hào)，共5個(gè)菌株，其孢子形態(tài)和著生方式和前2類有明顯區(qū)別。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落初期灰白色，后期中央略微隆起，灰褐色，絨毛狀，基質(zhì)褐色或深橄欖綠色。分生孢子梗單生或簇生，直或彎曲；分生孢子多單生或少數(shù)2個(gè)串生，具6～10個(gè)橫膈，1～6個(gè)縱膈或斜膈，大?。?9.8～110.6）μm×（15.0～40.3）μm；頂端有細(xì)長(zhǎng)的喙，喙淺褐色至近無(wú)色，長(zhǎng)度超過(guò)孢子的一半，大小（30.5～135.0）μm×（2.0～4.5）μm。 初步鑒定為A.macrospora（圖 1 C1、C2、C3）。

2.4.2分子生物學(xué)鑒定。采用真菌通用引物ITS1/ITS4對(duì)病原基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，11號(hào)和37～40號(hào)菌株擴(kuò)增出582 bp的片段，剩余其他35個(gè)菌株擴(kuò)增出 569 bp的片段 （圖 2），經(jīng)BLAST比對(duì)，11號(hào)和37～40號(hào)菌株序列與Gen-Bank中A.macrospora（登錄號(hào)AY154689.1和DQ156342.1）同源性達(dá)99%。而其他菌株與A.al-ternata（登 錄 號(hào) KT384278.1、KY814634.1、KY788019.1和MG195995.1）的同源性達(dá)100%，與A.tenuissima（登錄號(hào) KF280456.1、KY788031.1、KT384277.1和MG250391.1）的同源性也達(dá)100%，無(wú)法確定其歸屬。因此，結(jié)合病原形態(tài)學(xué)特征，確認(rèn)11號(hào)和37～40號(hào)菌株為A.macrospora。

圖2 供試病原菌ITS區(qū)PCR擴(kuò)增Fig.2 The results of the PCR of pathogen’s ITS

通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，分析rDNA-ITS區(qū)序列，可以將大孢子種A.macrospora與小孢子種中的A.alternata和A.tenuissima區(qū)分，但無(wú)法將小孢子種A.alternata和A.tenuissima區(qū)分（圖 3）。

采用組蛋白3基因擴(kuò)增引物H3-1a/H3-1b對(duì)病原基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，1～6號(hào)和19號(hào)菌株擴(kuò)增出494 bp的片段，20號(hào)菌株擴(kuò)增440 bp的片段，7～10號(hào)、11～18號(hào)、21～30號(hào)和 31～40號(hào)菌株擴(kuò)增出 546 bp的片段 （圖 4）。經(jīng)BLAST比對(duì)顯示，1～6號(hào)和19號(hào)與A.alternata（AF404620、KF997067 和 KR866858） 相似性達(dá)99%；20 號(hào)菌株與A.alternata（KF280540.1）相似性達(dá) 100%；7～10號(hào)、12～18號(hào)、21～30號(hào)和31～36號(hào)菌株與A.tenuissima（KT384348.1）相似 性 達(dá) 99%， 與A.tenuissima（KT384290.1、KT384354.1和KP267539.1）相似性達(dá)100%；而11號(hào)和37～40號(hào)菌株與A.alternata和A.tenuissima相似性都很高，說(shuō)明組蛋白3基因擴(kuò)增引物H3-1a/H3-1b，不能準(zhǔn)確區(qū)分大孢子種和小孢子種。

由此，根據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，確認(rèn)7～10號(hào)、12～18號(hào)、21～30號(hào)和 31～36 號(hào)菌株為A.tenuissima，1～6 號(hào)、19 號(hào)和20號(hào)菌株為A.alternata。

通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，分析組蛋白3基因序列，很容易將小孢子種A.alternata和A.tenuissima分為2個(gè)類群，所有供試菌株與A.macrospora都不聚在一起（圖 5）。

由此確認(rèn)，此次采樣的新疆棉花葉斑病的病原種類有3種，即A.alternata、A.tenuissima和A.macrospora，但各地鏈格孢屬病原菌的種類有一定差別（表2），與內(nèi)地報(bào)道的棉花葉斑病的病原種類也不完全相同[4-7]。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)調(diào)查，棉花葉斑病在新疆棉花整個(gè)生長(zhǎng)期都可發(fā)生，但主要發(fā)生在苗期和生長(zhǎng)后期，此時(shí)如遇持續(xù)低溫高濕的環(huán)境，則葉斑病發(fā)生較重。如2016年北疆春季遇持續(xù)低溫高濕，苗期葉斑病發(fā)病率達(dá)100%，嚴(yán)重影響棉苗生長(zhǎng)和發(fā)育；當(dāng)年8月下旬后南疆阿克蘇地區(qū)持續(xù)低溫高濕，后期葉斑病大發(fā)生，不論是長(zhǎng)絨棉還是陸地棉，都有不少棉田一片枯焦。正常氣候條件下，該病在棉花生長(zhǎng)中期很少發(fā)生；但若此時(shí)遇持續(xù)低溫高濕的環(huán)境，特別是下冰雹之后，也會(huì)較重發(fā)生。如2016年6月末博州81團(tuán)下冰雹之后，凡遭冰雹危害的棉花也發(fā)生較重的葉斑病。這種情況與新疆氣候變化比較劇烈、春季常有明顯的倒春寒、秋季降溫快等因素有關(guān)。

圖3 供試病原菌與相似種的ITS序列的發(fā)育樹Fig.3 Dendrogram of ITS sequences of the pathogen and its related species

以形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ)，結(jié)合rDNA-ITS和組蛋白3基因序列分析，確定新疆棉花葉斑病的病原有 3種， 即A.alternata、A.tenuissima和A.macrospora，沒(méi)有分離到棉鏈格孢A.gossypina。其中：北疆苗期（5―6月）棉花葉斑病的主要病原為A.alternata，占供測(cè)菌株的60%，次為A.tenuissima，占供測(cè)菌株的40%；生長(zhǎng)后期（8―9月）棉花葉斑病的主要病原為A.tenuissima，占供測(cè)菌株的70%，次為A.alternata和A.macrospora，分別占供測(cè)菌株的20%和10%。南疆棉花苗期葉斑病的主要病原為A.tenuissima，占供測(cè)菌株的100%。南疆生長(zhǎng)后期主要病原為A.tenuissima和A.macrospora，分別占供測(cè)菌株的60%和40%；其中，3個(gè)長(zhǎng)絨棉品種上的病樣（37～39號(hào)）病原全是A.macrospora，故生長(zhǎng)后期長(zhǎng)絨棉葉斑病的病原可能以A.macrospora為主，陸地棉以A.tenuissima為主，有待繼續(xù)研究。

近年來(lái)研究證明，鏈格孢屬級(jí)特征明顯，種級(jí)特征變異較大，特別是鏈格孢屬中小孢子組的成員，僅根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行種的鑒定比較困難；因此，分子生物學(xué)方法越來(lái)越多地被應(yīng)用。rDNA ITS區(qū)域介于18S rDNA、5.8S rDNA和 28S rDNA之間，進(jìn)化速度較編碼區(qū)快，可以為種間或種內(nèi)的分子系統(tǒng)研究提供足夠多的變異[14]。本研究基于rDNA-ITS可有效區(qū)分大孢子種A.macrospora與小孢子種A.alternata和A.tenuissima，而對(duì)于rDNA-ITS同源性超過(guò)98%的小孢子種A.alternata和A.tenuissima，通過(guò)分析組蛋白3基因序列可以較好地辨別。這與Wang等[12]、楊超等[13]研究結(jié)果一致。另外，新疆地域廣闊，本研究采樣點(diǎn)南疆以阿克蘇為主，北疆以石河子為主，其他植棉區(qū)的葉斑病采樣相對(duì)較少，且長(zhǎng)絨棉葉斑病的采樣也較少。因此，今后進(jìn)一步研究時(shí)應(yīng)注意合理確定采樣地域及其分布。

圖4 供試病原菌組蛋白H3基因PCR擴(kuò)增

圖5 供試病原菌與相似種組蛋白3基因序列的發(fā)育樹Fig.5 Dendrogram of histone 3 gene sequences of the pathogen and its related species

表2 3種病原菌在南疆、北疆棉花苗期和成株期所占比例Table 2 Proportion of three pathogenic bacteria at the seedling and adult stage of cotton in Northern and Southern Xinjiang

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