表達(dá)豬流行性腹瀉病毒保護(hù)性抗原重組乳酸桿菌的構(gòu)建及鑒定

孫玉章，許運(yùn)斌，王宏華，孫明軍，蔣貽海

（1. 青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，國家動(dòng)物用保健品工程技術(shù)研究中心，山東青島 266000；2. 遵義醫(yī)學(xué)院，貴州省傳染病與生物安全特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563000；3. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由冠狀病毒科冠狀病毒屬豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種急性、高度接觸性豬傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為主要臨床特征[1]。本病1971年首次報(bào)道于英國，隨后迅速在歐洲蔓延，目前全球范圍內(nèi)均有報(bào)道。我國1984年首次確認(rèn)了該病的存在和流行[2]。PEDV可感染各種年齡的豬。哺乳仔豬、架子豬或育肥豬發(fā)病率可達(dá)100%，尤其是哺乳仔豬，受害最嚴(yán)重，而母豬發(fā)病率為15%～90%[3]。由于PEDV主要感染仔豬腸道組織黏膜并在小腸和結(jié)腸的絨毛上皮細(xì)胞漿中復(fù)制，因此局部黏膜免疫產(chǎn)生的抗原特異性分泌型免疫球蛋白A（secretory IgA，SIgA），理論上應(yīng)具有更好的免疫潛力和免疫效果[4]。

研究證實(shí)，乳酸菌是誘導(dǎo)黏膜免疫極好的免疫佐劑和疫苗載體[5]。因此，本研究構(gòu)建了表達(dá)PEDV表面纖突糖蛋白主要核心保護(hù)性抗原表位（COE）的重組乳酸菌基因工程菌株，以期為下一步體內(nèi)重組乳酸桿菌抗PEDV黏膜免疫效果評價(jià)和口服疫苗制備提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒、載體與菌株

PEDV SG-1株：2016年分離自山東省壽光市某規(guī)?；B(yǎng)豬場，由本實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存；乳酸菌基因工程菌株和穿梭表達(dá)載體pSIP等：吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)傳染病教研室惠贈(zèng)；pMD-18T載體：購自Takara（大連）有限公司；E.coli DH5α菌株及其感受態(tài)細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

基因組總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收與純化試劑盒和DNA Ladder marker（DL2000、DL5000）等：購于天根生化科技（北京）有限公司；RT-PCR預(yù)混液、EcoR I、Xba I、Nhe I、Hind III和T4 DNA ligase等：購于Takara（大連）有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素和紅霉素等：購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)責(zé)任有限公司；小鼠抗HIS標(biāo)簽單抗、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG：購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒：購于武漢博士德生物工程有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 PEDV主要保護(hù)性抗原表位的擴(kuò)增

1.3.1 引物合成 根據(jù)PEDV SG-1株 S基因部分保護(hù)性抗原（499～638 aa，COE）的序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)1對擴(kuò)增引物。上游引物P1：5′-TCA GCTAGC TTGCTTTTGACCTTGACGATG-3′（ 含 有 Nhe I酶切位點(diǎn)）；下游引物P2：5′-AGT AAGCTT TTAAGAAACGTCCGTGACACC-3′（ 含 有 Hind III酶切位點(diǎn)）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 PEDV主要保護(hù)性抗原表位的擴(kuò)增 將PEDV細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次后12 000 r/min離心；按基因組總RNA提取試劑盒（天根）說明書所列操作規(guī)程，提取病毒懸液總RNA；以此為模板反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有所設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)的目的片段。RT-PCR反應(yīng)體系為：RT-PCR Mix 25 μL，P1 2μL，P2 2 μL，AMV RT enzyme 1 μL，Genome template 4 μL，RNase inhibitor 1 μL，ddH2O 15 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 60 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.4 重組乳桿菌載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物按DNA凝膠回收與純化試劑盒（天根）說明書所列操作程序，回收純化后克隆于pMD-18T載體并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽性菌落進(jìn)行擴(kuò)增并測序；將測序正確的陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，經(jīng)Nhe I、Hind III雙酶切后，定向克隆于pSIP穿梭表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)抗性平板篩選陽性菌落后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.5 表達(dá)外源蛋白重組乳桿菌的構(gòu)建

利用電轉(zhuǎn)化儀，將pSIP-PEDV-S-COE轉(zhuǎn)化至新鮮制備的乳酸桿菌基因工程菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)抗性平板篩選陽性菌落后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行Nhe I、Hind III雙酶切鑒定。

1.6 重組乳酸桿菌的表達(dá)與Western-blot鑒定

挑取重組乳酸桿菌轉(zhuǎn)化平板上的單菌落，接種于工作濃度的抗性MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)過夜；取過夜培養(yǎng)物，以1%比例接種于搖瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，待OD600nm為0.3～0.5時(shí)，加入工作濃度的誘導(dǎo)劑，計(jì)時(shí)培養(yǎng)，間隔固定時(shí)間取樣檢測；將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，以12 000 r/min離心，收集菌體，并用PBS重懸菌體沉淀，然后加入等量SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴10 min，最后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

利用BIO-RAD半干式轉(zhuǎn)膜儀，將凝膠中的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用ddH2O洗膜3次；將膜置于含5%脫脂奶粉的PBS，室溫封閉2 h，PBST洗膜3次；加入1:3 000稀釋的一抗（鼠抗HIS標(biāo)簽單抗），室溫孵育2 h，PBST洗膜3次；加入1:5 000稀釋的二抗（HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG），室溫孵育2 h，PBST洗膜3次；用DAB顯色試劑盒顯色并觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PEDV主要保護(hù)性抗原表位的擴(kuò)增

提取PEDV細(xì)胞培養(yǎng)液總RNA，按前述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行RT-PCR，然后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到預(yù)期大小約500 bp的COE目的片段（圖1）。

2.2 表達(dá)外源蛋白重組乳酸桿菌的鑒定

將pSIP-PEDV-S-COE電轉(zhuǎn)化至新鮮制備的乳酸桿菌基因工程菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)抗性篩選后，小量擴(kuò)增，提取質(zhì)粒并進(jìn)行Nhe I、Hind III雙酶切鑒定，得到約500 bp的目的片段，與預(yù)期大小相符（圖2）。

2.3 重組乳酸桿菌的表達(dá)及鑒定

重組乳酸桿菌pSIP-PEDV-COE經(jīng)過夜培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)后，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，利用抗HIS標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果在約27 KD處檢測到目的蛋白條帶，且誘導(dǎo)4 h與8 h的蛋白表達(dá)量差異不顯著（圖3）。

圖3 Western blot檢測

3 討論

PEDV S蛋白是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，能夠結(jié)合仔豬腸道黏膜上的氨基肽酶N（Aminopeptidase N，APN）受體[6]，從而介導(dǎo)PEDV與宿主細(xì)胞的吸附、融合，同時(shí)可以刺激宿主機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體和細(xì)胞免疫途徑。研究證實(shí)，S蛋白存在多個(gè)線性抗原表位[7-9]，其中499～638aa位的核心抗原表位區(qū)COE在不同PEDV毒株中均比較保守，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的中和抗體，因此COE是開發(fā)新型PEDV疫苗的重要靶位[10-13]。

由于PEDV對腸道組織具有親嗜性，因此局部黏膜免疫可能在PED發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。哺乳動(dòng)物的胃腸道黏膜上皮及固有層內(nèi)均含有大量的免疫細(xì)胞及免疫分子，其能夠通過SIgA和IgM阻止病原微生物在黏膜上皮層的粘附和定殖。作為食品安全級(jí)的乳酸菌，其不僅能夠促進(jìn)多種淋巴細(xì)胞的活化和多種細(xì)胞因子的分泌，還能作為免疫佐劑，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素和提高腸道中非特異性IgA抗體水平。因此，將乳酸菌等益生菌作為被動(dòng)黏膜免疫遞送系統(tǒng)的外源載體具有廣泛的應(yīng)用前景。它可以通過口服等方式向目標(biāo)動(dòng)物腸道黏膜靶向傳遞抗原組分，從而刺激機(jī)體B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體和Th1/Th2型平衡的免疫應(yīng)答[14-15]。

4 結(jié)論

本研究將PEDV核心保護(hù)性抗原基因（COE）插入到穿梭表達(dá)載體并電轉(zhuǎn)化至乳酸桿菌基因工程菌株內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，構(gòu)建了表達(dá)PEDV部分保護(hù)性抗原COE的重組乳酸桿菌，以期通過乳酸菌本身的早期占位和天然抗菌功能，在仔豬腸道局部黏膜形成優(yōu)勢免疫區(qū)，從而預(yù)防和控制PED的發(fā)生和流行。本研究為進(jìn)一步開展動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)和研發(fā)PED新型口服疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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