利用組織芯片分析DJ-1蛋白在非霍奇淋巴瘤組織中的定位表達(dá)及意義

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(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所, 湖南 衡陽(yáng) 421001; 2.常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院; 3.湖南環(huán)境生物學(xué)院醫(yī)學(xué)院)

非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma, NHL)主要發(fā)生在淋巴結(jié)、脾臟、胸腺等淋巴器官，它是一類常見的淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，占淋巴瘤總發(fā)病率的70.1%～95.1%。NHL病情進(jìn)展較快，且它的發(fā)病率和死亡率每年都在穩(wěn)步增加，嚴(yán)重威脅著人類的健康安全。但迄今為止，人們對(duì)NHL的發(fā)病機(jī)制還沒有明確的了解。有研究表明淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制可能與基因突變、免疫抑制、感染、環(huán)境等因素有關(guān)，其中基因突變引起的原癌基因激活和抑癌基因失活是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因。因此，尋找可作為腫瘤早期診斷和特異性治療的靶點(diǎn)是NHL治療的關(guān)鍵。DJ-1蛋白在人體的組織和器官中廣泛存在，而DJ-1蛋白缺失或過度表達(dá)會(huì)引起很多相關(guān)疾病，在前列腺癌、胰腺癌等多種腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)DJ-1過度表達(dá)的情況。研究表明這與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[1]。然而，關(guān)于DJ-1蛋白在NHL中的表達(dá)與淋巴瘤生物學(xué)特性的關(guān)系國(guó)內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本文旨在探討DJ-1蛋白在NHL中的表達(dá)及意義，為NHL的診治提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料人淋巴瘤組織芯片(LYM1502)，購(gòu)于上海卓立生物科技有限公司；病理組織學(xué)確診為非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者61例，男31例，女30例，年齡14～80歲，中位年齡42歲；病理組織學(xué)確診為非腫瘤淋巴組織7例作為對(duì)照組，包含男3例，女4例，年齡7～52，中位年齡34歲。患者臨床、病理及實(shí)驗(yàn)室資料完整，病理類型和惡性程度按照WHO(2016)的標(biāo)準(zhǔn)分類。兔抗人DJ-1抗體購(gòu)自ABGENT公司,SP免疫組化試劑盒均購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2免疫組織化學(xué)染色根據(jù)超敏SP免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行，使用福建邁新生物有限公司提供的已知陽(yáng)性片作為對(duì)照，同時(shí)陰性對(duì)照組用PBS處理。

1.3組織芯片染色結(jié)果判定組織芯片中黃色、棕黃色、棕褐色部位為蛋白陽(yáng)性表達(dá)。每芯隨機(jī)選取三個(gè)不重復(fù)的400倍視野，每個(gè)視野中隨機(jī)記數(shù)連續(xù)的200個(gè)細(xì)胞，記數(shù)每個(gè)細(xì)胞核與漿中DJ-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。細(xì)胞核蛋白表達(dá)結(jié)果的判定，按細(xì)胞核染色強(qiáng)度與細(xì)胞核陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比綜合計(jì)分，同理，細(xì)胞漿蛋白表達(dá)結(jié)果的判定，按細(xì)胞漿染色強(qiáng)度與細(xì)胞漿陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比綜合計(jì)分。根據(jù)文獻(xiàn)，按染色強(qiáng)度分別計(jì)無(wú)色者為1分，黃色者為2分，棕褐色者為3分; 按陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)分別計(jì)總數(shù)≤25% 者為1分，26%～50%者為2分，51%～75%為3分，>75%者為4分；將每個(gè)組織點(diǎn)染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分率得分相乘的積為其最后得分。1分為陰性“-”，2～4分為弱陽(yáng)性“+”，5～8分為中等陽(yáng)性“++”，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性“+++”[2]。陰性和弱陽(yáng)性定義為低表達(dá)，中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性定義為高表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組織芯片結(jié)果數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，選用用卡方檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DJ-1在NHL和非淋巴瘤組織中的表達(dá)情況采用組織芯片結(jié)合免疫組化檢測(cè)DJ-1在NHL及非腫瘤組織中的表達(dá)情況，如圖1所示。通過鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示：NHL中DJ-1蛋白細(xì)胞核高表達(dá)率分別為72.1%，顯著高于非腫瘤組織(淋巴結(jié)反應(yīng)性增生和正常淋巴結(jié))14.3%(P<0.01)；細(xì)胞漿高表達(dá)率為93.4%，顯著高于非腫瘤組織(淋巴結(jié)反應(yīng)性增生和正常淋巴結(jié))28.6%(P<0.01)。比較NHL中DJ-1在細(xì)胞核與細(xì)胞漿中的表達(dá)情況，NHL中DJ-1的漿表達(dá)率為93.4%,明顯高于核表達(dá)的72.1%。

表1 組織芯片結(jié)合免疫組化檢測(cè)檢測(cè)DJ-1在非霍奇金淋巴瘤(NHL)及非腫瘤組織中的表達(dá)情況

與非腫瘤組織比較，aP<0.01

2.2 DJ-1的表達(dá)與NHL惡性程度的關(guān)系所示DJ-1在惰性、侵襲性和高度侵襲性淋巴瘤中核高表達(dá)率分別為52.2%、82.9%和100%(P<0.05),細(xì)胞漿內(nèi)為82.6%、100%、100%(P<0.05)。DJ-1的表達(dá)與惡性程度正相關(guān)，且細(xì)胞核內(nèi)DJ-1高表達(dá)率較之細(xì)胞漿內(nèi)梯度差異更為明顯。見表2。

2.3 NHL中DJ-1的表達(dá)與性別、年齡和組織學(xué)分型的關(guān)系為調(diào)查DJ-1的表達(dá)是否受性別、年齡和組織學(xué)分型的影響，以性別、年齡和組織學(xué)來(lái)源進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)。其結(jié)果如表2所示：DJ-1的表達(dá)差異與性別、年齡和組織學(xué)分型無(wú)顯著的相關(guān)性(P>0.05)。

圖1 DJ-1在非霍奇金淋巴瘤(NHL)組織及非腫瘤組織中的表達(dá)情況(左列100×，右列400×)A:非腫瘤組織，核表達(dá)(-)，漿表達(dá)(+)； B:非霍奇金淋巴瘤，核表達(dá)(+)，漿表達(dá)(+++)；C:非霍奇金淋巴瘤，核表達(dá)(++)，漿表達(dá)(+++)

表2 DJ-1的表達(dá)與非霍奇金淋巴瘤惡性程度、性別、年齡和組織學(xué)分型的關(guān)系

3 討 論

惡性腫瘤的早期診斷對(duì)其治療具有著重要的意義，惡性腫瘤在早期階段一般還未具備侵襲轉(zhuǎn)移的能力，如何在其發(fā)病早期診斷是目前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。然而，目前人們對(duì)惡性腫瘤的形成機(jī)制還不是十分了解，能確定的是基因突變引起的癌基因激活且或抑癌基因失活與腫瘤的形成密切相關(guān)，因此如何篩選出腫瘤中突變的癌基因或抑癌基因?qū)δ[瘤的早期診斷意義非凡。組織芯片又稱組織微陣列，能同時(shí)檢測(cè)幾十乃至上千的組織標(biāo)本，具有高通量、誤差小、可比性強(qiáng)和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，能幫助篩選惡性腫瘤中具有潛在診斷意義的分子[3]。運(yùn)用組織芯片篩選出與淋巴瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的腫瘤生物標(biāo)記物，對(duì)淋巴瘤的診斷、預(yù)后評(píng)估具有十分重要的意義。

DJ-1蛋白由位于1號(hào)染色體短臂遠(yuǎn)端(1p36.12-1p36.33)區(qū)域的同名基因表達(dá)，分子大小為20 KDa，并以同源二聚體的形式存在，破壞其二聚體結(jié)構(gòu)往往能使其失活[4]。DJ-1是一種多功能的蛋白質(zhì)，它能夠調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白的亞基，氧化還原分子伴侶[5]，半胱氨酸蛋白酶[6]，轉(zhuǎn)錄共激活因子[7]等功能。這些功能使DJ-1蛋白牽連著生物過程的各個(gè)方面,當(dāng)然也包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。DJ-1蛋白在單獨(dú)或者與其他癌基因如c-myc、ras等共同作用時(shí)能夠轉(zhuǎn)化NIH-3T3細(xì)胞，暗示了其對(duì)基因轉(zhuǎn)錄有調(diào)控作用并具備致癌潛力。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NHL細(xì)胞核和細(xì)胞漿中DJ-1的表達(dá)顯著高于非腫瘤組織，因此可以認(rèn)為DJ-1與NHL發(fā)生密切相關(guān)。

DJ-1作為凋亡過程的一個(gè)重要調(diào)節(jié)點(diǎn)，與腫瘤的形成發(fā)展緊密相關(guān)。DJ-1調(diào)控多條致癌信號(hào)通路，在細(xì)胞核內(nèi)能與Daxx結(jié)合，阻止其進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)激活A(yù)SK1，而ASK1的激活能啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[8]；DJ-1蛋白在細(xì)胞漿中與MEKK1的結(jié)合能阻斷MEKK1-SEK1-JNK1級(jí)聯(lián)信號(hào)通路激活引起的凋亡[9]。由此可見DJ-1參與不同致癌通路的定位是不一樣的，或許根據(jù)DJ-1在細(xì)胞內(nèi)定位表達(dá)的情況結(jié)合現(xiàn)有研究資料能初步推測(cè)DJ-1參與哪些致癌信號(hào)通路。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NHL細(xì)胞中細(xì)胞核和細(xì)胞漿中都存在高表達(dá)的現(xiàn)象，不過細(xì)胞漿中DJ-1高表達(dá)較細(xì)胞核中更為明顯。有研究表明DJ-1蛋白結(jié)構(gòu)的C106殘基的氧化能阻斷 P53的C末端與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而調(diào)控促凋亡因子Bax的轉(zhuǎn)錄并抑制下游Caspase酶的活化[10]，而DJ-1的敲低增加了Bax蛋白水平，并加速caspase-3的激活和細(xì)胞死亡。這表明DJ-1的細(xì)胞保護(hù)是通過抑制p53-Bax-Caspase途徑來(lái)介導(dǎo)的[11]。DJ-1對(duì)p53的這種抑制活性取決于本身的sumo化，它是泛素化修飾的一種，且主要在翻譯后參與蛋白質(zhì)的修飾，能使蛋白質(zhì)構(gòu)象更加穩(wěn)定并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的核運(yùn)輸、信號(hào)傳遞等[12]，當(dāng)Sumo化位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，DJ-1將無(wú)法向核內(nèi)轉(zhuǎn)移并喪失其通過p53-Bax-Caspase通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力[13]。這種核內(nèi)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象或許是本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果中細(xì)胞核和細(xì)胞漿中都存在高表達(dá)現(xiàn)象，但卻有強(qiáng)弱之別的原因。

尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)能使腫瘤周圍的基質(zhì)蛋白降解并促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[14]，而侵襲和轉(zhuǎn)移對(duì)評(píng)估腫瘤的惡性程度及判斷患者預(yù)后具有重要意義。DJ-1蛋白能使ERK和SRC磷酸化繼而激活下游的ERK/ uPA通路，因此DJ-1的高表達(dá)能促進(jìn)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲。另外多種腫瘤患者體內(nèi)呈現(xiàn)血清DJ-1蛋白的高水平，而這往往與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切[15]。DJ-1可能作為腫瘤轉(zhuǎn)移早期診斷和監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物有著巨大的潛力。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，DJ-1的高表達(dá)率與NHL的惡性程度正相關(guān)，即惡性程度高的淋巴瘤中DJ-1的表達(dá)更高，故DJ-1可能與NHL的轉(zhuǎn)移和侵襲等惡性進(jìn)程密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中DJ-1于腫瘤細(xì)胞中核、漿內(nèi)都有高表達(dá)，漿表達(dá)更加明顯但核表達(dá)卻能根據(jù)NHL的惡性程度表現(xiàn)出差異梯度，似乎作為診斷標(biāo)準(zhǔn)更為合適。但在DJ-1臨床應(yīng)用前仍需擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)標(biāo)本量并進(jìn)一步明確該蛋白在NHL中的表達(dá)強(qiáng)度與轉(zhuǎn)移和侵襲的關(guān)系。DJ-1作為腫瘤惡性行為的分子診斷指標(biāo)以及評(píng)估患者預(yù)后都具有極大潛力和重要意義。

不止于在診斷方面探索，DJ-1在腫瘤的治療方面也有許多研究進(jìn)展。研究表明DJ-1的沉默能增加腫瘤對(duì)藥物的敏感性，使用RNA干擾技術(shù)(siRNA)沉默DJ-1基因能使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能力受損并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性如吉西他濱、順鉑等。這提示DJ-1的高表達(dá)與腫瘤耐藥性密切相關(guān)，而通過檢測(cè)耐藥腫瘤中DJ-1表達(dá)情況，使用靶向干擾DJ-1的藥物來(lái)抑制DJ-1的表達(dá)也許能改善化療藥物的療效，增加化療成功率。因此化療藥物與靶向干擾DJ-1藥物的聯(lián)合治療方法是極具潛力的新型抗腫瘤手段。

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