泌尿生殖道支原體固體培養(yǎng)基的研制及臨床應(yīng)用

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(江門市皮膚醫(yī)院，廣東 江門 529000)

支原體是一類缺乏細(xì)胞壁、呈高度多形性、能通過濾菌器、在無生命培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物[1]。目前引起人類泌尿生殖道感染的主要有解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum,Uu)、人型支原體(Mycoplasma hominis, Mh)、生殖支原體(M. genitalium, Mg)與穿透支原體(M. penetrans, Mpe)[2-4]。隨著支原體引起的泌尿生殖道感染的發(fā)病率增高，亟待研制一種快速、準(zhǔn)確的支原體培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)泌尿生殖道支原體的臨床檢測(cè)多數(shù)采用液體培養(yǎng)法，這一方法已延用20多年，但臨床實(shí)踐中已暴露出諸多缺點(diǎn)。支原體在固體培養(yǎng)基上形成的特征性菌落是泌尿生殖道感染的直接證據(jù)，沒有假陽(yáng)性存在，是一種較科學(xué)的檢測(cè)手段。為此，本文旨在研制一種適合臨床檢測(cè)泌尿生殖道支原體的固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法并進(jìn)行初步的臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株Uu標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC27813)和Mh標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC15488)由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所惠贈(zèng)。

1.2支原體培養(yǎng)基的配制

1.2.1 自制支原體培養(yǎng)基 在基礎(chǔ)肉湯上增加1%的蛋白胨，并用25%新鮮酵母配制，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至6.5，8磅高壓滅菌30 min，待冷卻后加入終濃度分別為20%小牛血清、0.1%尿素、0.1%精氨酸，0.002%酚紅、100 μg/mL萬古霉素、3 μg/mL兩性霉素及50 μg/mL多粘菌素B等，分裝試劑盒，每支1.5 mL。在此基礎(chǔ)上，在無菌條件下加入0.9%的瓊脂，并傾注5 cm平皿即固體培養(yǎng)基。4～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 對(duì)照培養(yǎng)基 選用IST2支原體分離、鑒定、藥敏試劑盒(法國(guó)梅里埃公司批號(hào)：1005926020)和A7支原體固體培養(yǎng)基(法國(guó)梅里埃公司批號(hào)：1005665600)。

1.3檢測(cè)對(duì)象收集本院性病科門診2017年1月～6月的檢測(cè)標(biāo)本，共594例，其中男性415例，女性179例。年齡19～57歲，平均31.7±5.7歲。所有患者均有尿道炎癥狀或?qū)m頸炎癥狀。其中男性主要表現(xiàn)為尿頻、尿急、尿道口稀薄分泌物、腹部下墜痛等癥狀；女性主要表現(xiàn)為陰道分泌物異常(增多、顏色發(fā)黃、有異味、膿性或血性等)、外陰瘙癢、下腹痛等癥狀。

1.4檢測(cè)方法接種：常規(guī)用無菌棉拭取材，男性患者取尿道拭子，女性患者取宮頸拭子。取材后立即接種于自制支原體雙相液體培養(yǎng)基與梅里埃IST2肉湯中，分別取60 μL分3滴滴加于自制的固體培養(yǎng)基與A7支原體固體培養(yǎng)基表面[5]，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置10～20 min，待液面干后將培養(yǎng)皿倒置放于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并分別于16 h、20 h、24 h、36 h、48 h時(shí)間段觀察兩種液體培養(yǎng)基顏色變化單位(color changing unit，CCU)，同時(shí)用顯微鏡于低倍鏡下觀察兩種固體培養(yǎng)基的菌落形成單位(colony forming unit，CFU)并觀察支原體菌落形態(tài)。大于48 h液體培養(yǎng)基澄清不變色且固體培養(yǎng)基上無支原體菌落生長(zhǎng)者視為陰性，并記錄結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，一致性檢驗(yàn)采用κ值表示：極好的一致性(0.81<κ<1.0)，高度一致性(0.61<κ<0.8)，中度一致性(0.41<κ<0.6)，一致性差(0.81<κ<1.0)，無意義(κ<0)。率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)準(zhǔn)株檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)株在梅里埃IST2肉湯、A7固體培養(yǎng)基和自制支原體雙相液體、固體培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)。梅里埃IST2肉湯CCU為20 h，而自制支原體雙相液體培養(yǎng)基CCU小于16 h；梅里埃A7固體培養(yǎng)基CFU(≥104)為24 h，自制支原體固體培養(yǎng)基CFU(≥104)小于16 h。

2.2自制液體和固體培養(yǎng)基有較高的質(zhì)量標(biāo)本接種16 h時(shí)，自制支原體液體和固體培養(yǎng)基與對(duì)照組梅里埃試劑IST2和A7培養(yǎng)基的陽(yáng)性率分別為8.92%(53/594)和3.70%(22/594)，20 h培養(yǎng)的陽(yáng)性率分別為21.38%(127/594)和13.30%(79/594)，自制支原體培養(yǎng)基在16 h和20 h的陽(yáng)性檢出率均明顯優(yōu)于對(duì)照組梅里埃試劑(χ2=13.68，P<0.01；χ2=13.53，P<0.01)。自制固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落有92.27%于16 h～24 h之間可辨認(rèn)。48 h培養(yǎng)后，594例臨床標(biāo)本中梅里埃IST2和自制雙相液體培養(yǎng)基混濁生長(zhǎng)分別有7例和14例，這兩種液體培養(yǎng)基的抑菌率分別為98.82%(587/594)和97.64%(580/594)，抑菌效果基本一致。

2.3自制固體培養(yǎng)基與A7培養(yǎng)基有較好的一致性以鏡下固體培養(yǎng)基上的典型支原體菌落形態(tài)作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)(圖1)，梅里埃A7培養(yǎng)基培養(yǎng)陽(yáng)性192例，自制支原體固體培養(yǎng)基陽(yáng)性194例，結(jié)果見表1。以梅里埃A7培養(yǎng)基作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，如表2所示：自制支原體固體培養(yǎng)基的敏感性為97.92%(188/192)，特異性為98.51%(396/402)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩者差異無顯著性(χ2=0.10，P>0.05)，κ值為0.96，即自制固體培養(yǎng)基與A7培養(yǎng)基有較好的一致性。

表1 梅里埃與自制培養(yǎng)基鑒定594例臨床標(biāo)本中支原體效果比較

a：培養(yǎng)時(shí)間大于48 h且培養(yǎng)基混濁變紅色；b：培養(yǎng)時(shí)間大于48 h且培養(yǎng)基混濁不變色；c：培養(yǎng)時(shí)間大于48 h培養(yǎng)基澄清不變色

表2 梅里埃A7與自制固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果比較

圖1 支原體在自制支原體固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(10×)A：Uu，呈棕黑色海膽樣菌落；B：Mh，呈無色油煎蛋樣菌落；C：Uu與Mh混合生長(zhǎng)

3 討 論

解脲脲原體(Uu)和人型支原體(Mh)是泌尿生殖道感染較為常見的病原體，對(duì)于這兩種支原體的檢測(cè)，常規(guī)采用Uu和Mh單相液體培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后通過觀察液體CCU來診斷，但是單相液體培養(yǎng)基的CCU無法真正將Uu和Mh從送檢標(biāo)本中分離出來，液體培養(yǎng)基主要通過添加不同底物使其發(fā)生生化反應(yīng)對(duì)其作出間接判斷，若送檢標(biāo)本的雜菌多，使抑菌劑無效，從而容易造成培養(yǎng)污染、假陰性或假陽(yáng)性等結(jié)果。所以，根據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍意見，固體培養(yǎng)是判斷標(biāo)本中有無支原體存在的金標(biāo)準(zhǔn)方法，固體培養(yǎng)具有液體培養(yǎng)無可替代的優(yōu)勢(shì)：其一是根據(jù)典型菌落形態(tài)可以作出直接判斷，不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，即使固體培養(yǎng)基有輕度污染也不會(huì)影響支原體生長(zhǎng)及觀察；其二是根據(jù)菌落形態(tài)和出現(xiàn)時(shí)間可以在固體培養(yǎng)基上同時(shí)鑒別多種支原體，并能進(jìn)行純培養(yǎng)，用于后續(xù)研究[6]。目前，國(guó)內(nèi)醫(yī)院檢驗(yàn)科常用市售的液體雙相培養(yǎng)基進(jìn)行分離和鑒定支原體，同時(shí)附以藥敏板聯(lián)合培養(yǎng)，以便更快地幫助患者明確診斷和盡早應(yīng)用敏感的抗生素治療[7]。支原體在液體中生長(zhǎng)，Uu分解尿素，Mh分解精氨酸，均使液體培養(yǎng)基顏色由黃變紅，進(jìn)而鑒別支原體。由于泌尿生殖道內(nèi)含有多種微生物，有些微生物同樣可分解尿素或精氨酸，從而使培養(yǎng)基顏色變紅并出現(xiàn)渾濁或沉淀，若僅依據(jù)顏色改變可增加假陽(yáng)性或假陰性率。另外，液體培養(yǎng)只是一種生化鑒定，無法準(zhǔn)確判斷有無支原體生長(zhǎng)，且同一種液體培養(yǎng)基通常無法同時(shí)判斷兩種以上支原體生長(zhǎng)，所以進(jìn)行支原體固體培養(yǎng)基研制和應(yīng)用具有臨床診斷意義。

鑒于國(guó)內(nèi)臨床實(shí)踐中出現(xiàn)的問題及微生物學(xué)對(duì)診斷的要求，為此，本文旨在研究一種適合臨床檢驗(yàn)用的固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。支原體雙相培養(yǎng)基要提高支原體陽(yáng)性檢出率，必須注重微生物的生態(tài)環(huán)境，如培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分、pH值、抑菌劑及指示劑的選擇等。本文借鑒公認(rèn)的A7配方[8-9]，增加了蛋白胨、小牛血清含量，同時(shí)添加了DMEM，并用25%新鮮酵母配制。將傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的抑菌劑青霉素改為萬古霉素、兩性霉素及多粘菌素B，能有效地抑制革蘭陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭陰性細(xì)菌及真菌生長(zhǎng)，防止雜菌污染。由于支原體屬于無細(xì)胞壁微生物，所以臨床通常選用β-內(nèi)酰胺類抗生素(如青霉素)來抑制具有細(xì)胞壁的雜菌，但是青霉素在水溶液中不穩(wěn)定，抗菌譜狹窄，耐藥菌株多，在低濃度的水溶液中易分解，加之泌尿生殖道雜菌多，特別是耐藥的葡萄球菌大量存在，致使培養(yǎng)基污染長(zhǎng)菌，抑制了支原體的生長(zhǎng)。

本研究從表1數(shù)據(jù)可知，16 h內(nèi)生長(zhǎng)且鏡下可見典型菌落的梅里埃A7培養(yǎng)基有22株，而自制固體培養(yǎng)基有53株；20 h內(nèi)生長(zhǎng)且鏡下可見典型菌落的梅里埃A7培養(yǎng)基有79株，而自制固體培養(yǎng)基有127株，支原體在自制培養(yǎng)基中16 h和20 h的生長(zhǎng)速度明顯優(yōu)于梅里埃培養(yǎng)基(χ2=13.68，P<0.01；χ2=13.53，P<0.01)。經(jīng)48 h培養(yǎng)后，培養(yǎng)基混濁提示有細(xì)菌生長(zhǎng)，梅里埃IST2有7例，自制雙相液體培養(yǎng)基有14例，自制雙相液體培養(yǎng)基抑菌效果達(dá)97.64%。若以鏡下的典型支原體菌落形態(tài)作為陽(yáng)

性判斷標(biāo)準(zhǔn)，梅里埃A7培養(yǎng)基培養(yǎng)陽(yáng)性有192例，自制支原體固體培養(yǎng)基陽(yáng)性194例。以梅里埃A7培養(yǎng)基作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，自制支原體固體培養(yǎng)基的敏感性為97.92%，特異性為98.51%，兩者差異無顯著性(χ2=0.10，P>0.05)，說明自制的支原體固體培養(yǎng)基分離Uu和Mh的效果顯著，Uu和Mh在這種培養(yǎng)基上均能夠生長(zhǎng)良好，為一種培養(yǎng)基上同時(shí)分離Uu和Mh兩種支原體提供了良好技術(shù)支持，較液體培養(yǎng)更具有科學(xué)性臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。

總之，本研究生產(chǎn)的液體和固體培養(yǎng)基有其自身特點(diǎn)，將自制的支原體固體培養(yǎng)基用于Uu和Mh分離，可獲得與生物梅里埃A7固體培養(yǎng)基和IST2同樣的效果，支原體菌落生長(zhǎng)速度快，且來源方便、價(jià)格低廉，適合基層單位開展支原體檢測(cè)和診斷。

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