梁成宵,古瑞,李婷,楊冠,吳東葉,屈琳林,李鳳君,田伏洲,孫紅玉
終末期肝病包括急性肝衰竭、肝硬化和肝癌等,病情兇險(xiǎn)、病死率高,嚴(yán)重危害著人們的身體健康。肝移植是目前治療終末期肝病唯一有效的方法,但供體器官短缺、免疫抑制以及繼發(fā)感染等問(wèn)題限制了其在臨床的應(yīng)用[1-2]。近年來(lái),隨著再生醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步,干細(xì)胞移植技術(shù)在各種終末期肝病的治療中取得了令人鼓舞的進(jìn)展[3-4],但研究顯示其療效欠佳,這是由于肝臟病變部位處于相對(duì)惡劣的微環(huán)境,如缺血性缺氧、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等,均會(huì)影響干細(xì)胞的黏附與存活[5]。因此,臨床上亟待尋找新的策略來(lái)提高干細(xì)胞修復(fù)肝病的療效。
可注射水凝膠作為一種新穎的工具,可用于干細(xì)胞或藥物遞送,受到再生醫(yī)學(xué)研究者的極大關(guān)注[6]??勺⑸湫运z種類繁多,常見(jiàn)的有膠原、MatrigelTM、殼聚糖、纖維蛋白等。最近有研究表明,基于天然細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)材料的組織工程研究有望為組織損傷修復(fù)提供一種新的策略[7-9]。ECM脫細(xì)胞支架材料是指通過(guò)物理、化學(xué)和生物學(xué)方法將器官組織的細(xì)胞成分全部清除,從而完整地保留血管系統(tǒng)、超微結(jié)構(gòu)以及主要細(xì)胞外基質(zhì)成分[10],能夠提供最天然的細(xì)胞外微環(huán)境,已成為組織再生領(lǐng)域有應(yīng)用前景的支架材料。特別是ECM水凝膠材料,可通過(guò)微創(chuàng)注射的方法將材料或細(xì)胞遞送到組織損傷部位,具有微創(chuàng)、安全、可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),大大增強(qiáng)了脫細(xì)胞基質(zhì)材料在臨床上的應(yīng)用[11-12]。國(guó)際上已將ECM水凝膠應(yīng)用于心臟、軟骨和皮膚的組織再生領(lǐng)域,研究表明其對(duì)組織的修復(fù)與重建均發(fā)揮了有益作用[13-17]。然而,針對(duì)肝臟ECM水凝膠材料的研究相對(duì)較少,特別是尚未見(jiàn)有關(guān)其生物相容性的報(bào)道。基于此,本研究在制備肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)的基礎(chǔ)上,研制與表征肝臟相似的ECM水凝膠材料,并系統(tǒng)評(píng)價(jià)其對(duì)BRL-3A 的細(xì)胞活力、增殖情況及黏附作用的影響,以期為后續(xù)肝臟ECM水凝膠的體內(nèi)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 健康成年雄性SD大鼠(體重200~220g)購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;大鼠正常肝細(xì)胞系BRL-3A 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。十二烷基磺酸鈉(sodium dedecyl sulfate,SDS;美國(guó)Amresco),聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100,美國(guó)Sigma)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(FITC-Phalloidin,美國(guó)Sigma)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,美國(guó)Sigma),胃蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibeo),HE(北京索萊寶科技有限公司),AlamarBlue試劑、Live/Dead活性/細(xì)胞毒性試劑盒(美國(guó)Thermo)。
1.2 主要儀器 掃描電鏡(日本,日本電子),倒置相差熒光顯微鏡 (日本Olympus,IX81),CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)(美國(guó)Thermo),分光光度計(jì)(屹譜儀器制造上海有限公司),雙道微量注射泵(浙江浙大醫(yī)療設(shè)備有限公司),酶標(biāo)儀(美國(guó)BioRad),冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Virtis)。
1.3 肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)的制備 參照文獻(xiàn)[18]報(bào)道的方法對(duì)肝臟進(jìn)行脫細(xì)胞處理。其制備方法簡(jiǎn)述如下:分離完好的肝臟,1% SDS灌注2h,0.01mol/L PBS溶液沖洗15min,1% Triton X-100灌注30min,0.01mol/L PBS溶液沖洗3h。將洗脫好的肝臟,冷凍干燥,分裝密封,環(huán)氧乙烷消毒備用。
1.4 ECM水凝膠的制備 在無(wú)菌條件下將肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)剪碎,按照10mg/ml比例加入鹽酸-胃蛋白酶溶液中,室溫緩慢攪拌至溶解狀態(tài),調(diào)節(jié)pH值至7.4,然后將該溶液置于37℃,觀察其成膠時(shí)間。
1.5 表面形貌表征 將凍干的ECM水凝膠樣品在液氮中冷凍,然后將其淬斷形成新鮮界面,界面噴金后,在掃描電鏡下觀察樣本表面形貌結(jié)構(gòu)。
1.6 細(xì)胞種植 將ECM水凝膠制備成24孔板大小,放入24孔板中,紫外燈滅菌2h后,用無(wú)菌生理鹽水清洗2次;將BRL-3A 細(xì)胞以8000個(gè)/孔的密度接種于ECM水凝膠上,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,同時(shí)設(shè)置空白培養(yǎng)板作為對(duì)照組;最后將孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)液。
1.7 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用Live/Dead活性/細(xì)胞毒性試劑盒檢測(cè)BRL-3A細(xì)胞在ECM水凝膠上的成活情況,以空白培養(yǎng)板作為對(duì)照組。在培養(yǎng)1d和3d時(shí),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)加入相關(guān)試劑,染色后熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野觀察,利用Image J 軟件計(jì)算水凝膠組與對(duì)照組活細(xì)胞和死亡細(xì)胞的數(shù)目,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞活力計(jì)算公式為:細(xì)胞活力=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。
1.8 細(xì)胞增殖情況檢測(cè) 采用AlamarBlue 法檢測(cè)ECM水凝膠對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖的影響,以空白培養(yǎng)板作為對(duì)照組,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在指定時(shí)間點(diǎn)添加AlamarBlue試劑孵育后,采用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)為 570nm和610nm)檢測(cè)水凝膠組和對(duì)照組的吸光度(OD)值,記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1.9 細(xì)胞黏附檢測(cè) 培養(yǎng)1d后,通過(guò)細(xì)胞骨架染色觀察BRL-3A細(xì)胞的黏附情況(水凝膠組),以空白培養(yǎng)板作為對(duì)照組。具體方法如下:每孔用PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定30min,PBS沖洗3次,每次5min;然后每孔加入濃度為5mg/L的FITCPhalloidin溶液,避光孵育10min;PBS洗3次,每次5min;最后加入濃度為5mg/L的DAPI溶液,避光孵育5min;PBS清洗3次,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.10 病理學(xué)觀察 肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)經(jīng)4%多聚甲醛固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片等步驟制備為石蠟切片,行HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察標(biāo)本的組織形態(tài)。
1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料在滿足正態(tài)性的基礎(chǔ)上以±s表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)鑒定 HE染色可見(jiàn)肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),無(wú)藍(lán)染胞核物質(zhì)(圖1A);DNA含量測(cè)定結(jié)果顯示脫細(xì)胞基質(zhì)中DNA含量明顯低于正常肝臟組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B,P<0.001),進(jìn)一步證細(xì)胞已經(jīng)完全被洗脫掉,獲得了理想的肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)材料。
2.2 ECM水凝膠的大體觀察與內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu) 脫細(xì)胞基質(zhì)經(jīng)鹽酸-胃蛋白酶溶液溶解后在常溫下呈現(xiàn)液態(tài)(圖2A),但當(dāng)置于37℃ 10~15min后,凝結(jié)為固態(tài)(圖2B)。掃描電鏡檢測(cè)顯示ECM水凝膠呈現(xiàn)為多孔狀結(jié)構(gòu),不同粗細(xì)的ECM纖維呈網(wǎng)狀分布(圖2C)。
2.3 細(xì)胞毒性研究 經(jīng)Live/Dead染色試劑盒檢測(cè)BRL-3A細(xì)胞在ECM水凝膠上的存活情況,由圖3A可見(jiàn),培養(yǎng)1d和3d后,與對(duì)照組比較,水凝膠組綠色熒光細(xì)胞(即活細(xì)胞)較多,紅色熒光細(xì)胞(即死細(xì)胞)較少。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,水凝膠組細(xì)胞活力略高于對(duì)照組(圖3B),提示本實(shí)驗(yàn)制備的肝臟ECM水凝膠有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖1 肝臟脫基質(zhì)的鑒定Fig. 1 Identification of acellular matrix for liver tissue
圖2 ECM水凝膠大體觀察及表面形貌Fig. 2 General observation and surface characterization of ECM hydrogel
圖3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 3 Results of cytotoxicity test
2.4 細(xì)胞增殖情況檢測(cè)結(jié)果 采用AlamarBlue法評(píng)估BRL-3A細(xì)胞在ECM水凝膠上的增殖情況,結(jié)果可見(jiàn),培養(yǎng)1d和3d后,水凝膠組細(xì)胞的吸光度值顯著高于對(duì)照組(P<0.05,圖4)。
2.5 細(xì)胞黏附檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)FITC-Phalloidin染色細(xì)胞骨架(圖5A),在免疫熒光顯微鏡下觀察BRL-3A細(xì)胞在ECM水凝膠及空白培養(yǎng)板上培養(yǎng)1d后的黏附情況,結(jié)果顯示細(xì)胞在水凝膠表面呈梭形生長(zhǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好于對(duì)照組,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示每個(gè)視野下水凝膠組黏附的細(xì)胞數(shù)量(84±8個(gè))顯著高于空白對(duì)照組(53±7個(gè),P<0.05)。
圖4 AlamarBlue法評(píng)估BRL-3A細(xì)胞在ECM水凝膠上的增殖情況Fig. 4 Proliferation of BRL-3A cells in ECM hydrogel detected by AlamarBlue method
圖5 兩組細(xì)胞黏附情況Fig. 5 Cell adhesion of the two groups
近年來(lái),可注射水凝膠在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到研究者的極大關(guān)注[4],特別是脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠材料,不但具備低免疫原性,含有豐富的生物活性成分,能為細(xì)胞提供更接近于天然組織的微環(huán)境,而且可微創(chuàng)注射于組織損傷部位,具有獨(dú)特的臨床應(yīng)用價(jià)值[11-12]。因此,國(guó)際上掀起了基于可注射性ECM水凝膠材料研究的熱潮,結(jié)果顯示其在心肌、軟骨和皮膚組織損傷修復(fù)中均可發(fā)揮有益的促進(jìn)作用[14,16-17]。然而,目前有關(guān)肝臟ECM水凝膠的研究鮮見(jiàn)。因此本研究制備了肝臟ECM水凝膠,并系統(tǒng)評(píng)價(jià)其對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附和增殖的影響。
脫細(xì)胞基質(zhì)是運(yùn)用化學(xué)、酶解或機(jī)械等方法去除組織器官中的細(xì)胞成分,而保存細(xì)胞外基質(zhì)成分的一種技術(shù)[10]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行脫細(xì)胞處理,獲得肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)材料,HE染色觀察可見(jiàn)脫細(xì)胞基質(zhì)為紅色網(wǎng)狀,未見(jiàn)細(xì)胞殘留,證實(shí)獲得了理想的脫細(xì)胞基質(zhì)材料,與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[18]。肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)經(jīng)溶解后制備成水凝膠,掃描電鏡觀察可見(jiàn)其呈交錯(cuò)排列的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu),表明肝臟ECM水凝膠具有細(xì)胞附著增殖的充足空間,具備成為可注射支架材料的良好條件。
生物相容性是評(píng)估組織工程支架材料的重要指標(biāo),也是支架材料臨床應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。其中,體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)是生物相容性評(píng)價(jià)的最基本指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)采用Live/Dead染色、AlamarBlue法和細(xì)胞骨架染色對(duì)肝臟基質(zhì)水凝膠的生物相容性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。Live/Dead細(xì)胞毒性檢測(cè)顯示,水凝膠組細(xì)胞活力略高于對(duì)照組,表明制備的肝臟ECM水凝膠有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外,AlamarBlue法和鬼筆環(huán)肽染色檢測(cè)結(jié)果分別提示ECM水凝膠促進(jìn)了肝細(xì)胞的增殖和黏附能力,這與心臟組織來(lái)源制備的水凝膠相似[13]。上述結(jié)果表明ECM水凝膠材料具有良好的細(xì)胞相容性。分析可能原因如下:其一,ECM水凝膠具有親水性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),有利于細(xì)胞黏附于其表面;其二,ECM水凝膠含有細(xì)胞外基質(zhì)的多種生物活性分子,可為體外生長(zhǎng)的細(xì)胞提供與體內(nèi)相似的微環(huán)境,有利于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)。本課題組后續(xù)將針對(duì)ECM水凝膠在體內(nèi)的生物相容性進(jìn)行深入研究。
綜上所述,本研究成功制備了網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)的肝臟基質(zhì)水凝膠,該水凝膠有利于肝細(xì)胞生長(zhǎng),并可促進(jìn)肝細(xì)胞的黏附和增殖。本研究制備的肝臟基質(zhì)水凝膠生物相容性良好,有望作為可注射性水凝膠材料在終末期肝病的治療中發(fā)揮作用。
[1]Soltys KA, Soto-Gutierrez A, Nagaya M, et al. Barriers to the successful treatment of liver disease by hepatocyte transplantation[J]. J Hepatol, 2010, 53(4): 769-774.
[2]Xu CY, Song SH, Ding GS. Research progress on humoral rejection after liver transplantation[J]. Med J Chin PLA, 2017,42(10): 920-924. [徐春揚(yáng), 宋少華, 丁國(guó)善. 肝臟移植術(shù)后體液性排斥反應(yīng)的研究進(jìn)展[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2017,42(10): 920-924.]
[3]Rountree CB, Mishra L, Willenbring H. Stem cells in liver diseases and cancer: recent advances on the path to new therapies[J]. Hepatology, 2012, 55(1): 298-306.
[4]Cui YB, Ma SS, Yao N, et al. Effects of human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation on expression of aging related gene in brain and liver of Alzheimer's disease mice[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2015, 50(1): 25-29. [崔淵博, 馬珊珊, 姚寧, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)老年癡呆小鼠腦、肝組織中衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2015, 50(1): 25-29.]
[5]Ryu KH, Kim SY, Kim YR, et al. Tonsil-derived mesenchymal stem cells alleviate concanavalin A-induced acute liver injury[J].Exp Cell Res, 2014, 326(1): 143-154.
[6]Yang JA, Yeom J, Hwang BW, et al. In situ-forming injectable hydrogels for regenerative medicine[J]. Prog Polym Sci, 2014,39(12): 1973-1986.
[7]Ott HC, Matthiesen TS, Goh SK, et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart[J]. Nat Med, 2008, 14(2): 213-221.
[8]Song JJ, Guyette JP, Gilpin SE, et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney[J]. Nat Med, 2013, 19(5): 646-651.
[9]Uygun BE, Soto-Gutierrez A, Yagi H, et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix[J]. Nat Med, 2010, 16(7): 814-820.
[10]Arenas-Herrera JE, KoI K, Atala A. Decellularization for whole organ bioengineering[J]. Biomed Mater, 2013, 8(1): 014106.
[11]Wang RM, Christman KL. Decellularized myocardial matrix hydrogels: In basic research and preclinical studies[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2016, 96: 77-82.
[12]Hinderer S, Layland SL, Schenke-Layland K. ECM and ECM-like materials – Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2016,97(4): 260-269.
[13]Singelyn JM, DeQuach JA, SeifNaraghi SB, et al. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering[J]. Biomaterials, 2009, 30(29): 5409-5416.
[14]Seif-Naraghi SB, Singelyn JM, Salvatore MA, et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction[J]. Sci Transl Med, 2013, 5(173):173ra25.
[15]Singelyn JM, Sundaramurthy P, Johnson TD, et al. Catheterdeliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction[J]. J Am Coll Cardiol, 2012, 59(8): 751-763.
[16]Fu Y, Fan X, Tian C, et al. Decellularization of porcine skeletal muscle extracellular matrix for the formulation of a matrix hydrogel: a preliminary study[J]. J Cell Mol Med, 2016, 20(4):740-749.
[17]Sharma B, Fermanian S, Gibson M, et al. Human cartilage repair with a photoreactive adhesive-hydrogel composite[J]. Sci Transl Med, 2013, 5(167): 167ra6.
[18]Zhou P, Lessa N, Estrada DC, et al. Decellularized liver matrix as a carrier for the transplantation of human fetal and primary hepatocytes in mice[J]. Liver Transplant, 2011, 17(4): 418-427.