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    肝臟基質(zhì)水凝膠的制備及其細(xì)胞相容性研究

    2018-06-02 02:06:05梁成宵古瑞李婷楊冠吳東葉屈琳林李鳳君田伏洲孫紅玉
    解放軍醫(yī)學(xué)雜志 2018年5期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    梁成宵,古瑞,李婷,楊冠,吳東葉,屈琳林,李鳳君,田伏洲,孫紅玉

    終末期肝病包括急性肝衰竭、肝硬化和肝癌等,病情兇險(xiǎn)、病死率高,嚴(yán)重危害著人們的身體健康。肝移植是目前治療終末期肝病唯一有效的方法,但供體器官短缺、免疫抑制以及繼發(fā)感染等問(wèn)題限制了其在臨床的應(yīng)用[1-2]。近年來(lái),隨著再生醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步,干細(xì)胞移植技術(shù)在各種終末期肝病的治療中取得了令人鼓舞的進(jìn)展[3-4],但研究顯示其療效欠佳,這是由于肝臟病變部位處于相對(duì)惡劣的微環(huán)境,如缺血性缺氧、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等,均會(huì)影響干細(xì)胞的黏附與存活[5]。因此,臨床上亟待尋找新的策略來(lái)提高干細(xì)胞修復(fù)肝病的療效。

    可注射水凝膠作為一種新穎的工具,可用于干細(xì)胞或藥物遞送,受到再生醫(yī)學(xué)研究者的極大關(guān)注[6]??勺⑸湫运z種類繁多,常見(jiàn)的有膠原、MatrigelTM、殼聚糖、纖維蛋白等。最近有研究表明,基于天然細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)材料的組織工程研究有望為組織損傷修復(fù)提供一種新的策略[7-9]。ECM脫細(xì)胞支架材料是指通過(guò)物理、化學(xué)和生物學(xué)方法將器官組織的細(xì)胞成分全部清除,從而完整地保留血管系統(tǒng)、超微結(jié)構(gòu)以及主要細(xì)胞外基質(zhì)成分[10],能夠提供最天然的細(xì)胞外微環(huán)境,已成為組織再生領(lǐng)域有應(yīng)用前景的支架材料。特別是ECM水凝膠材料,可通過(guò)微創(chuàng)注射的方法將材料或細(xì)胞遞送到組織損傷部位,具有微創(chuàng)、安全、可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),大大增強(qiáng)了脫細(xì)胞基質(zhì)材料在臨床上的應(yīng)用[11-12]。國(guó)際上已將ECM水凝膠應(yīng)用于心臟、軟骨和皮膚的組織再生領(lǐng)域,研究表明其對(duì)組織的修復(fù)與重建均發(fā)揮了有益作用[13-17]。然而,針對(duì)肝臟ECM水凝膠材料的研究相對(duì)較少,特別是尚未見(jiàn)有關(guān)其生物相容性的報(bào)道。基于此,本研究在制備肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)的基礎(chǔ)上,研制與表征肝臟相似的ECM水凝膠材料,并系統(tǒng)評(píng)價(jià)其對(duì)BRL-3A 的細(xì)胞活力、增殖情況及黏附作用的影響,以期為后續(xù)肝臟ECM水凝膠的體內(nèi)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 健康成年雄性SD大鼠(體重200~220g)購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;大鼠正常肝細(xì)胞系BRL-3A 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。十二烷基磺酸鈉(sodium dedecyl sulfate,SDS;美國(guó)Amresco),聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100,美國(guó)Sigma)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(FITC-Phalloidin,美國(guó)Sigma)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,美國(guó)Sigma),胃蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibeo),HE(北京索萊寶科技有限公司),AlamarBlue試劑、Live/Dead活性/細(xì)胞毒性試劑盒(美國(guó)Thermo)。

    1.2 主要儀器 掃描電鏡(日本,日本電子),倒置相差熒光顯微鏡 (日本Olympus,IX81),CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)(美國(guó)Thermo),分光光度計(jì)(屹譜儀器制造上海有限公司),雙道微量注射泵(浙江浙大醫(yī)療設(shè)備有限公司),酶標(biāo)儀(美國(guó)BioRad),冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Virtis)。

    1.3 肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)的制備 參照文獻(xiàn)[18]報(bào)道的方法對(duì)肝臟進(jìn)行脫細(xì)胞處理。其制備方法簡(jiǎn)述如下:分離完好的肝臟,1% SDS灌注2h,0.01mol/L PBS溶液沖洗15min,1% Triton X-100灌注30min,0.01mol/L PBS溶液沖洗3h。將洗脫好的肝臟,冷凍干燥,分裝密封,環(huán)氧乙烷消毒備用。

    1.4 ECM水凝膠的制備 在無(wú)菌條件下將肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)剪碎,按照10mg/ml比例加入鹽酸-胃蛋白酶溶液中,室溫緩慢攪拌至溶解狀態(tài),調(diào)節(jié)pH值至7.4,然后將該溶液置于37℃,觀察其成膠時(shí)間。

    1.5 表面形貌表征 將凍干的ECM水凝膠樣品在液氮中冷凍,然后將其淬斷形成新鮮界面,界面噴金后,在掃描電鏡下觀察樣本表面形貌結(jié)構(gòu)。

    1.6 細(xì)胞種植 將ECM水凝膠制備成24孔板大小,放入24孔板中,紫外燈滅菌2h后,用無(wú)菌生理鹽水清洗2次;將BRL-3A 細(xì)胞以8000個(gè)/孔的密度接種于ECM水凝膠上,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,同時(shí)設(shè)置空白培養(yǎng)板作為對(duì)照組;最后將孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)液。

    1.7 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用Live/Dead活性/細(xì)胞毒性試劑盒檢測(cè)BRL-3A細(xì)胞在ECM水凝膠上的成活情況,以空白培養(yǎng)板作為對(duì)照組。在培養(yǎng)1d和3d時(shí),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)加入相關(guān)試劑,染色后熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野觀察,利用Image J 軟件計(jì)算水凝膠組與對(duì)照組活細(xì)胞和死亡細(xì)胞的數(shù)目,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞活力計(jì)算公式為:細(xì)胞活力=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。

    1.8 細(xì)胞增殖情況檢測(cè) 采用AlamarBlue 法檢測(cè)ECM水凝膠對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖的影響,以空白培養(yǎng)板作為對(duì)照組,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在指定時(shí)間點(diǎn)添加AlamarBlue試劑孵育后,采用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)為 570nm和610nm)檢測(cè)水凝膠組和對(duì)照組的吸光度(OD)值,記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    1.9 細(xì)胞黏附檢測(cè) 培養(yǎng)1d后,通過(guò)細(xì)胞骨架染色觀察BRL-3A細(xì)胞的黏附情況(水凝膠組),以空白培養(yǎng)板作為對(duì)照組。具體方法如下:每孔用PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定30min,PBS沖洗3次,每次5min;然后每孔加入濃度為5mg/L的FITCPhalloidin溶液,避光孵育10min;PBS洗3次,每次5min;最后加入濃度為5mg/L的DAPI溶液,避光孵育5min;PBS清洗3次,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

    1.10 病理學(xué)觀察 肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)經(jīng)4%多聚甲醛固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片等步驟制備為石蠟切片,行HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察標(biāo)本的組織形態(tài)。

    1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料在滿足正態(tài)性的基礎(chǔ)上以±s表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)鑒定 HE染色可見(jiàn)肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),無(wú)藍(lán)染胞核物質(zhì)(圖1A);DNA含量測(cè)定結(jié)果顯示脫細(xì)胞基質(zhì)中DNA含量明顯低于正常肝臟組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B,P<0.001),進(jìn)一步證細(xì)胞已經(jīng)完全被洗脫掉,獲得了理想的肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)材料。

    2.2 ECM水凝膠的大體觀察與內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu) 脫細(xì)胞基質(zhì)經(jīng)鹽酸-胃蛋白酶溶液溶解后在常溫下呈現(xiàn)液態(tài)(圖2A),但當(dāng)置于37℃ 10~15min后,凝結(jié)為固態(tài)(圖2B)。掃描電鏡檢測(cè)顯示ECM水凝膠呈現(xiàn)為多孔狀結(jié)構(gòu),不同粗細(xì)的ECM纖維呈網(wǎng)狀分布(圖2C)。

    2.3 細(xì)胞毒性研究 經(jīng)Live/Dead染色試劑盒檢測(cè)BRL-3A細(xì)胞在ECM水凝膠上的存活情況,由圖3A可見(jiàn),培養(yǎng)1d和3d后,與對(duì)照組比較,水凝膠組綠色熒光細(xì)胞(即活細(xì)胞)較多,紅色熒光細(xì)胞(即死細(xì)胞)較少。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,水凝膠組細(xì)胞活力略高于對(duì)照組(圖3B),提示本實(shí)驗(yàn)制備的肝臟ECM水凝膠有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。

    圖1 肝臟脫基質(zhì)的鑒定Fig. 1 Identification of acellular matrix for liver tissue

    圖2 ECM水凝膠大體觀察及表面形貌Fig. 2 General observation and surface characterization of ECM hydrogel

    圖3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 3 Results of cytotoxicity test

    2.4 細(xì)胞增殖情況檢測(cè)結(jié)果 采用AlamarBlue法評(píng)估BRL-3A細(xì)胞在ECM水凝膠上的增殖情況,結(jié)果可見(jiàn),培養(yǎng)1d和3d后,水凝膠組細(xì)胞的吸光度值顯著高于對(duì)照組(P<0.05,圖4)。

    2.5 細(xì)胞黏附檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)FITC-Phalloidin染色細(xì)胞骨架(圖5A),在免疫熒光顯微鏡下觀察BRL-3A細(xì)胞在ECM水凝膠及空白培養(yǎng)板上培養(yǎng)1d后的黏附情況,結(jié)果顯示細(xì)胞在水凝膠表面呈梭形生長(zhǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好于對(duì)照組,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示每個(gè)視野下水凝膠組黏附的細(xì)胞數(shù)量(84±8個(gè))顯著高于空白對(duì)照組(53±7個(gè),P<0.05)。

    圖4 AlamarBlue法評(píng)估BRL-3A細(xì)胞在ECM水凝膠上的增殖情況Fig. 4 Proliferation of BRL-3A cells in ECM hydrogel detected by AlamarBlue method

    圖5 兩組細(xì)胞黏附情況Fig. 5 Cell adhesion of the two groups

    3 討 論

    近年來(lái),可注射水凝膠在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到研究者的極大關(guān)注[4],特別是脫細(xì)胞基質(zhì)水凝膠材料,不但具備低免疫原性,含有豐富的生物活性成分,能為細(xì)胞提供更接近于天然組織的微環(huán)境,而且可微創(chuàng)注射于組織損傷部位,具有獨(dú)特的臨床應(yīng)用價(jià)值[11-12]。因此,國(guó)際上掀起了基于可注射性ECM水凝膠材料研究的熱潮,結(jié)果顯示其在心肌、軟骨和皮膚組織損傷修復(fù)中均可發(fā)揮有益的促進(jìn)作用[14,16-17]。然而,目前有關(guān)肝臟ECM水凝膠的研究鮮見(jiàn)。因此本研究制備了肝臟ECM水凝膠,并系統(tǒng)評(píng)價(jià)其對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附和增殖的影響。

    脫細(xì)胞基質(zhì)是運(yùn)用化學(xué)、酶解或機(jī)械等方法去除組織器官中的細(xì)胞成分,而保存細(xì)胞外基質(zhì)成分的一種技術(shù)[10]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行脫細(xì)胞處理,獲得肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)材料,HE染色觀察可見(jiàn)脫細(xì)胞基質(zhì)為紅色網(wǎng)狀,未見(jiàn)細(xì)胞殘留,證實(shí)獲得了理想的脫細(xì)胞基質(zhì)材料,與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[18]。肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)經(jīng)溶解后制備成水凝膠,掃描電鏡觀察可見(jiàn)其呈交錯(cuò)排列的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu),表明肝臟ECM水凝膠具有細(xì)胞附著增殖的充足空間,具備成為可注射支架材料的良好條件。

    生物相容性是評(píng)估組織工程支架材料的重要指標(biāo),也是支架材料臨床應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。其中,體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)是生物相容性評(píng)價(jià)的最基本指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)采用Live/Dead染色、AlamarBlue法和細(xì)胞骨架染色對(duì)肝臟基質(zhì)水凝膠的生物相容性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。Live/Dead細(xì)胞毒性檢測(cè)顯示,水凝膠組細(xì)胞活力略高于對(duì)照組,表明制備的肝臟ECM水凝膠有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外,AlamarBlue法和鬼筆環(huán)肽染色檢測(cè)結(jié)果分別提示ECM水凝膠促進(jìn)了肝細(xì)胞的增殖和黏附能力,這與心臟組織來(lái)源制備的水凝膠相似[13]。上述結(jié)果表明ECM水凝膠材料具有良好的細(xì)胞相容性。分析可能原因如下:其一,ECM水凝膠具有親水性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),有利于細(xì)胞黏附于其表面;其二,ECM水凝膠含有細(xì)胞外基質(zhì)的多種生物活性分子,可為體外生長(zhǎng)的細(xì)胞提供與體內(nèi)相似的微環(huán)境,有利于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)。本課題組后續(xù)將針對(duì)ECM水凝膠在體內(nèi)的生物相容性進(jìn)行深入研究。

    綜上所述,本研究成功制備了網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)的肝臟基質(zhì)水凝膠,該水凝膠有利于肝細(xì)胞生長(zhǎng),并可促進(jìn)肝細(xì)胞的黏附和增殖。本研究制備的肝臟基質(zhì)水凝膠生物相容性良好,有望作為可注射性水凝膠材料在終末期肝病的治療中發(fā)揮作用。

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