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    肝臟基質(zhì)水凝膠的制備及其細胞相容性研究

    2018-06-02 02:06:05梁成宵古瑞李婷楊冠吳東葉屈琳林李鳳君田伏洲孫紅玉
    解放軍醫(yī)學雜志 2018年5期
    關鍵詞:檢測

    梁成宵,古瑞,李婷,楊冠,吳東葉,屈琳林,李鳳君,田伏洲,孫紅玉

    終末期肝病包括急性肝衰竭、肝硬化和肝癌等,病情兇險、病死率高,嚴重危害著人們的身體健康。肝移植是目前治療終末期肝病唯一有效的方法,但供體器官短缺、免疫抑制以及繼發(fā)感染等問題限制了其在臨床的應用[1-2]。近年來,隨著再生醫(yī)學的不斷進步,干細胞移植技術在各種終末期肝病的治療中取得了令人鼓舞的進展[3-4],但研究顯示其療效欠佳,這是由于肝臟病變部位處于相對惡劣的微環(huán)境,如缺血性缺氧、炎癥反應和氧化應激等,均會影響干細胞的黏附與存活[5]。因此,臨床上亟待尋找新的策略來提高干細胞修復肝病的療效。

    可注射水凝膠作為一種新穎的工具,可用于干細胞或藥物遞送,受到再生醫(yī)學研究者的極大關注[6]??勺⑸湫运z種類繁多,常見的有膠原、MatrigelTM、殼聚糖、纖維蛋白等。最近有研究表明,基于天然細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)材料的組織工程研究有望為組織損傷修復提供一種新的策略[7-9]。ECM脫細胞支架材料是指通過物理、化學和生物學方法將器官組織的細胞成分全部清除,從而完整地保留血管系統(tǒng)、超微結(jié)構以及主要細胞外基質(zhì)成分[10],能夠提供最天然的細胞外微環(huán)境,已成為組織再生領域有應用前景的支架材料。特別是ECM水凝膠材料,可通過微創(chuàng)注射的方法將材料或細胞遞送到組織損傷部位,具有微創(chuàng)、安全、可控性強等優(yōu)點,大大增強了脫細胞基質(zhì)材料在臨床上的應用[11-12]。國際上已將ECM水凝膠應用于心臟、軟骨和皮膚的組織再生領域,研究表明其對組織的修復與重建均發(fā)揮了有益作用[13-17]。然而,針對肝臟ECM水凝膠材料的研究相對較少,特別是尚未見有關其生物相容性的報道?;诖耍狙芯吭谥苽涓闻K脫細胞基質(zhì)的基礎上,研制與表征肝臟相似的ECM水凝膠材料,并系統(tǒng)評價其對BRL-3A 的細胞活力、增殖情況及黏附作用的影響,以期為后續(xù)肝臟ECM水凝膠的體內(nèi)應用提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物及主要試劑 健康成年雄性SD大鼠(體重200~220g)購自成都達碩實驗動物有限公司;大鼠正常肝細胞系BRL-3A 細胞購自中國科學院細胞庫。十二烷基磺酸鈉(sodium dedecyl sulfate,SDS;美國Amresco),聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100,美國Sigma)、異硫氰酸熒光素標記的鬼筆環(huán)肽(FITC-Phalloidin,美國Sigma)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,美國Sigma),胃蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibeo),HE(北京索萊寶科技有限公司),AlamarBlue試劑、Live/Dead活性/細胞毒性試劑盒(美國Thermo)。

    1.2 主要儀器 掃描電鏡(日本,日本電子),倒置相差熒光顯微鏡 (日本Olympus,IX81),CO2培養(yǎng)箱、離心機(美國Thermo),分光光度計(屹譜儀器制造上海有限公司),雙道微量注射泵(浙江浙大醫(yī)療設備有限公司),酶標儀(美國BioRad),冷凍干燥機(美國Virtis)。

    1.3 肝臟脫細胞基質(zhì)的制備 參照文獻[18]報道的方法對肝臟進行脫細胞處理。其制備方法簡述如下:分離完好的肝臟,1% SDS灌注2h,0.01mol/L PBS溶液沖洗15min,1% Triton X-100灌注30min,0.01mol/L PBS溶液沖洗3h。將洗脫好的肝臟,冷凍干燥,分裝密封,環(huán)氧乙烷消毒備用。

    1.4 ECM水凝膠的制備 在無菌條件下將肝臟脫細胞基質(zhì)剪碎,按照10mg/ml比例加入鹽酸-胃蛋白酶溶液中,室溫緩慢攪拌至溶解狀態(tài),調(diào)節(jié)pH值至7.4,然后將該溶液置于37℃,觀察其成膠時間。

    1.5 表面形貌表征 將凍干的ECM水凝膠樣品在液氮中冷凍,然后將其淬斷形成新鮮界面,界面噴金后,在掃描電鏡下觀察樣本表面形貌結(jié)構。

    1.6 細胞種植 將ECM水凝膠制備成24孔板大小,放入24孔板中,紫外燈滅菌2h后,用無菌生理鹽水清洗2次;將BRL-3A 細胞以8000個/孔的密度接種于ECM水凝膠上,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,同時設置空白培養(yǎng)板作為對照組;最后將孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)液。

    1.7 細胞活力檢測 采用Live/Dead活性/細胞毒性試劑盒檢測BRL-3A細胞在ECM水凝膠上的成活情況,以空白培養(yǎng)板作為對照組。在培養(yǎng)1d和3d時,按照試劑盒說明書加入相關試劑,染色后熒光顯微鏡下隨機選擇10個視野觀察,利用Image J 軟件計算水凝膠組與對照組活細胞和死亡細胞的數(shù)目,進行統(tǒng)計分析。細胞活力計算公式為:細胞活力=活細胞數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100%。

    1.8 細胞增殖情況檢測 采用AlamarBlue 法檢測ECM水凝膠對BRL-3A細胞增殖的影響,以空白培養(yǎng)板作為對照組,每組設置3個復孔。在指定時間點添加AlamarBlue試劑孵育后,采用酶標儀(波長為 570nm和610nm)檢測水凝膠組和對照組的吸光度(OD)值,記錄數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析。

    1.9 細胞黏附檢測 培養(yǎng)1d后,通過細胞骨架染色觀察BRL-3A細胞的黏附情況(水凝膠組),以空白培養(yǎng)板作為對照組。具體方法如下:每孔用PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定30min,PBS沖洗3次,每次5min;然后每孔加入濃度為5mg/L的FITCPhalloidin溶液,避光孵育10min;PBS洗3次,每次5min;最后加入濃度為5mg/L的DAPI溶液,避光孵育5min;PBS清洗3次,在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

    1.10 病理學觀察 肝臟脫細胞基質(zhì)經(jīng)4%多聚甲醛固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片等步驟制備為石蠟切片,行HE染色,在光學顯微鏡下觀察標本的組織形態(tài)。

    1.11 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料在滿足正態(tài)性的基礎上以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 肝臟脫細胞基質(zhì)鑒定 HE染色可見肝臟脫細胞基質(zhì)呈網(wǎng)狀結(jié)構,無藍染胞核物質(zhì)(圖1A);DNA含量測定結(jié)果顯示脫細胞基質(zhì)中DNA含量明顯低于正常肝臟組織,差異有統(tǒng)計學意義(圖1B,P<0.001),進一步證細胞已經(jīng)完全被洗脫掉,獲得了理想的肝臟脫細胞基質(zhì)材料。

    2.2 ECM水凝膠的大體觀察與內(nèi)部顯微結(jié)構 脫細胞基質(zhì)經(jīng)鹽酸-胃蛋白酶溶液溶解后在常溫下呈現(xiàn)液態(tài)(圖2A),但當置于37℃ 10~15min后,凝結(jié)為固態(tài)(圖2B)。掃描電鏡檢測顯示ECM水凝膠呈現(xiàn)為多孔狀結(jié)構,不同粗細的ECM纖維呈網(wǎng)狀分布(圖2C)。

    2.3 細胞毒性研究 經(jīng)Live/Dead染色試劑盒檢測BRL-3A細胞在ECM水凝膠上的存活情況,由圖3A可見,培養(yǎng)1d和3d后,與對照組比較,水凝膠組綠色熒光細胞(即活細胞)較多,紅色熒光細胞(即死細胞)較少。統(tǒng)計結(jié)果表明,水凝膠組細胞活力略高于對照組(圖3B),提示本實驗制備的肝臟ECM水凝膠有利于細胞生長。

    圖1 肝臟脫基質(zhì)的鑒定Fig. 1 Identification of acellular matrix for liver tissue

    圖2 ECM水凝膠大體觀察及表面形貌Fig. 2 General observation and surface characterization of ECM hydrogel

    圖3 細胞毒性實驗結(jié)果Fig. 3 Results of cytotoxicity test

    2.4 細胞增殖情況檢測結(jié)果 采用AlamarBlue法評估BRL-3A細胞在ECM水凝膠上的增殖情況,結(jié)果可見,培養(yǎng)1d和3d后,水凝膠組細胞的吸光度值顯著高于對照組(P<0.05,圖4)。

    2.5 細胞黏附檢測結(jié)果 通過FITC-Phalloidin染色細胞骨架(圖5A),在免疫熒光顯微鏡下觀察BRL-3A細胞在ECM水凝膠及空白培養(yǎng)板上培養(yǎng)1d后的黏附情況,結(jié)果顯示細胞在水凝膠表面呈梭形生長,細胞生長狀態(tài)明顯好于對照組,統(tǒng)計結(jié)果顯示每個視野下水凝膠組黏附的細胞數(shù)量(84±8個)顯著高于空白對照組(53±7個,P<0.05)。

    圖4 AlamarBlue法評估BRL-3A細胞在ECM水凝膠上的增殖情況Fig. 4 Proliferation of BRL-3A cells in ECM hydrogel detected by AlamarBlue method

    圖5 兩組細胞黏附情況Fig. 5 Cell adhesion of the two groups

    3 討 論

    近年來,可注射水凝膠在再生醫(yī)學領域的應用受到研究者的極大關注[4],特別是脫細胞基質(zhì)水凝膠材料,不但具備低免疫原性,含有豐富的生物活性成分,能為細胞提供更接近于天然組織的微環(huán)境,而且可微創(chuàng)注射于組織損傷部位,具有獨特的臨床應用價值[11-12]。因此,國際上掀起了基于可注射性ECM水凝膠材料研究的熱潮,結(jié)果顯示其在心肌、軟骨和皮膚組織損傷修復中均可發(fā)揮有益的促進作用[14,16-17]。然而,目前有關肝臟ECM水凝膠的研究鮮見。因此本研究制備了肝臟ECM水凝膠,并系統(tǒng)評價其對肝細胞生長、黏附和增殖的影響。

    脫細胞基質(zhì)是運用化學、酶解或機械等方法去除組織器官中的細胞成分,而保存細胞外基質(zhì)成分的一種技術[10]。本實驗對大鼠肝臟進行脫細胞處理,獲得肝臟脫細胞基質(zhì)材料,HE染色觀察可見脫細胞基質(zhì)為紅色網(wǎng)狀,未見細胞殘留,證實獲得了理想的脫細胞基質(zhì)材料,與文獻報道的一致[18]。肝臟脫細胞基質(zhì)經(jīng)溶解后制備成水凝膠,掃描電鏡觀察可見其呈交錯排列的網(wǎng)狀多孔結(jié)構,表明肝臟ECM水凝膠具有細胞附著增殖的充足空間,具備成為可注射支架材料的良好條件。

    生物相容性是評估組織工程支架材料的重要指標,也是支架材料臨床應用的前提和基礎。其中,體外細胞毒性評價是生物相容性評價的最基本指標之一。本實驗采用Live/Dead染色、AlamarBlue法和細胞骨架染色對肝臟基質(zhì)水凝膠的生物相容性進行了評價。Live/Dead細胞毒性檢測顯示,水凝膠組細胞活力略高于對照組,表明制備的肝臟ECM水凝膠有利于細胞的生長。此外,AlamarBlue法和鬼筆環(huán)肽染色檢測結(jié)果分別提示ECM水凝膠促進了肝細胞的增殖和黏附能力,這與心臟組織來源制備的水凝膠相似[13]。上述結(jié)果表明ECM水凝膠材料具有良好的細胞相容性。分析可能原因如下:其一,ECM水凝膠具有親水性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構,有利于細胞黏附于其表面;其二,ECM水凝膠含有細胞外基質(zhì)的多種生物活性分子,可為體外生長的細胞提供與體內(nèi)相似的微環(huán)境,有利于細胞的黏附和生長。本課題組后續(xù)將針對ECM水凝膠在體內(nèi)的生物相容性進行深入研究。

    綜上所述,本研究成功制備了網(wǎng)狀多孔結(jié)構的肝臟基質(zhì)水凝膠,該水凝膠有利于肝細胞生長,并可促進肝細胞的黏附和增殖。本研究制備的肝臟基質(zhì)水凝膠生物相容性良好,有望作為可注射性水凝膠材料在終末期肝病的治療中發(fā)揮作用。

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