芳香化酶抑制劑來(lái)曲唑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡實(shí)時(shí)觀測(cè)模型的建立*

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［1］。約75%乳腺癌患者激素受體為陽(yáng)性，他莫昔芬內(nèi)分泌治療是絕經(jīng)前激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者最常用的內(nèi)分泌治療藥物［2］。對(duì)于絕經(jīng)后激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者，芳香化酶抑制劑來(lái)曲唑療效因優(yōu)于他莫昔芬，被用作一線內(nèi)分泌治療［3］。絕經(jīng)后激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者循環(huán)血液中雖雌激素水平降低，但芳香化酶（編碼基因?yàn)镃YP19）可將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，進(jìn)而促進(jìn)雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中的雌激素對(duì)乳腺癌組織的刺激作用比循環(huán)血液中雌激素的刺激作用更明顯［4］。因此，阻斷雌激素合成的芳香化酶抑制劑是絕經(jīng)后激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者的重要內(nèi)分泌治療方式［5］。研究表明，芳香化酶抑制劑可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］，因此建立來(lái)曲唑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的實(shí)時(shí)觀測(cè)模型是研究的基礎(chǔ)。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建凋亡熒光指示蛋白和芳香化酶過(guò)表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系，構(gòu)建可實(shí)時(shí)觀測(cè)通過(guò)抑制芳香化酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡模型，為實(shí)時(shí)觀測(cè)來(lái)曲唑療效、篩選聯(lián)合藥物、尋找最佳用藥方式提供模型基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥物試劑 雌激素、雄激素、polybrene均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，芳香化酶抑制劑來(lái)曲唑購(gòu)自上海Selleck公司，兔抗人CYP19抗體及鼠抗人β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)ABcam公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，嘌呤霉素、Blasticidin均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Eco?RI、BamHI、T4連接酶均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，Trizol試劑購(gòu)自北京索來(lái)寶公司。

1.1.2 細(xì)胞系 人胚腎細(xì)胞293T和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7及ZR7530由本實(shí)驗(yàn)室凍存。攜帶凋亡熒光指示蛋白基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒 pCDH-CMV-VC3AI［7］由李兵輝教授實(shí)驗(yàn)室獲得。人CYP19全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框克隆質(zhì)粒PGEM-CYP19購(gòu)自北京義翹神州科技有限公司。整合質(zhì)粒pCMV-dR8.91和包膜質(zhì)粒pCMVVSV-G及過(guò)表達(dá)載體PCDH-puro-VECTOR由本實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物 引物均由上海金維智公司合成。芳香化酶的上游引物序列為5'-GACCA ATGAATCGGGCTATGT-3'，下游引物序列為5'-GATGT CTGGTTTGATGAGGAGAG-3'；選取GAPDH作為內(nèi)參，其上游引物序列為5'-GATTCCACCCATGGCAAATTC-3'，下游引物序列為5'-GTGAAGACGCCAGTGGAC-3'。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 293T和MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，ZR7530細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 芳香化酶過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 以PGEM-CYP19為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增含有特異限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的CYP19基因產(chǎn)物，產(chǎn)物由特異性內(nèi)切酶（EcoRI、BamHI）酶切1 h，經(jīng)瓊脂糖膠跑膠分離后切膠回收，同樣的方法切膠回收PCDH-puro-VECTOR載體。兩種回收產(chǎn)物與T4連接酶混合，室溫連接5 h，經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑菌、酶切鑒定以及測(cè)序驗(yàn)證后，芳香化酶過(guò)表達(dá)質(zhì)粒PCDH-puro-CYP19構(gòu)建成功。

1.2.3 細(xì)胞系構(gòu)建 將293T細(xì)胞鋪于6孔板中，待細(xì)胞均勻貼壁且細(xì)胞融合度為80%時(shí)，使用磷酸鈣共沉淀法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照載體質(zhì)粒：整合質(zhì)粒：包膜質(zhì)粒為2：1：1比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染5 h后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)液。48 h后，收集培養(yǎng)液，8 000 r/min離心30 min，收集病毒。每1 mL病毒液滴加10 mg/mL的polybrene 1 μL進(jìn)行細(xì)胞感染，12 h后更換新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后以Blasticidin篩選穩(wěn)定過(guò)表達(dá)VC3AI的細(xì)胞，同樣的方法，在表達(dá)VC3AI的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)芳香化酶。使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)芳香化酶的乳腺癌細(xì)胞。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 收集嘌呤霉素篩選后的細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。使用Nanodrop分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cD?NA合成。選取GAPDH作為內(nèi)參定量分析目的基因的mRNA水平。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) 收集過(guò)表達(dá)芳香化酶和空載體的MCF-7-VC3AI、ZR7530-VC3AI細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，冰上放置5 min，干式恒溫鍋內(nèi)95℃10 min。使用Nanodrop分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白定量，按照50 μg/孔蛋白量上樣，100 mV電壓恒壓條件下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳分離后的條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。兔抗人CYP19抗體及鼠抗人β-actin抗體使用TBST稀釋?zhuān)凑?：1 000稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，TBST洗膜3次。使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，洗膜后通過(guò)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞中芳香化酶CYP19蛋白的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。

1.2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的過(guò)表達(dá)芳香化酶MCF-7-VC3AI、ZR7530-VC3AI細(xì)胞，懸浮在去激素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞懸液密度為2×104/mL，按照0.1 mL/孔接種細(xì)胞至96孔板中，設(shè)5個(gè)平行孔。24 h后分別加入不同濃度的雄激素、雌激素，或者不同濃度來(lái)曲唑聯(lián)合100 nmol/L雄激素，均設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；取等量溶劑為對(duì)照組。細(xì)胞放置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按照0.2 mL/孔加入濃度為5 mg/mL MTT溶液，37℃孵箱培育。4 h后吸棄舊培養(yǎng)基，加入150 μL/孔DMSO，輕輕震蕩10 min，采用自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Ra）檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算平均值以及標(biāo)準(zhǔn)差。定義細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組吸光度-調(diào)零孔吸光度）/（對(duì)照組吸光度-調(diào)零孔吸光度）×100%。

1.2.7 培養(yǎng)細(xì)胞拍照 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的過(guò)表達(dá)芳香化酶MCF-7-VC3AI、ZR7530-VC3AI細(xì)胞，懸浮在去激素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞懸液密度為5×104/mL，按照1mL/孔接種細(xì)胞至12孔板中，設(shè)3個(gè)平行孔。24h后分別加入20 μmol/L來(lái)曲唑聯(lián)合100 nmol/L雄激素，并設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，取等量溶劑為對(duì)照組。細(xì)胞放置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于加藥后0、12、24、48 h在EVOS FL熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建芳香化酶過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型

過(guò)表達(dá)芳香化酶MCF-7-VC3AI、ZR7530-VC3AI細(xì)胞模型中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PCDH-puro-CYP19的CYP19 mRNA水平明顯高于過(guò)表達(dá)空載體PCDH-puro-VECTOR（P＜0.01，圖1A、B）；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)PCDH-puro-CYP19的CYP19蛋白水平明顯高于過(guò)表達(dá)空載體PCDH-puro-VECTOR（圖1C）。

2.2 雄激素、雌激素對(duì)芳香化酶過(guò)表達(dá)細(xì)胞增殖能力的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，雄激素、雌激素可促進(jìn)過(guò)表達(dá)芳香化酶MCF-7-VC3AI、ZR7530-VC3AI細(xì)胞的增殖，其中100 nmol/L雄激素對(duì)細(xì)胞增殖能力的促進(jìn)作用最明顯。實(shí)驗(yàn)組中的100 nmol/L雄激素作用下，過(guò)表達(dá)芳香化酶MCF-7-VC3AI、ZR7530-VC3AI細(xì)胞的增殖率約為對(duì)照組的1.2、1.5倍（P＜0.01）。高濃度的雄激素對(duì)細(xì)胞增殖能力的促進(jìn)作用減弱，甚至出現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的作用（圖2A、2B）。雌激素可促進(jìn)細(xì)胞增殖，其中促進(jìn)過(guò)表達(dá)芳香化酶MCF-7-VC3AI細(xì)胞增殖的最佳濃度為1 μmol/L，細(xì)胞增殖率約為對(duì)照組的1.17倍（P＜0.01）；而促進(jìn)過(guò)表達(dá)芳香化酶ZR7530-VC3AI細(xì)胞增殖的最佳濃度為1、10 μmol/L，細(xì)胞增殖率約為對(duì)照組的1.2倍（P＜0.05，圖2C、2D）。

圖1 芳香化酶過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型的鑒定

圖2 不同濃度雄激素、雌激素作用48 h對(duì)芳香化酶過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型增殖能力的影響

2.3 來(lái)曲唑?qū)Ψ枷慊高^(guò)表達(dá)細(xì)胞增殖能力的抑制作用

不同濃度來(lái)曲唑聯(lián)合100 nmol/L雄激素作用于過(guò)表達(dá)芳香化酶MCF-7-VC3AI、ZR7530-VC3AI細(xì)胞，細(xì)胞增殖能力隨來(lái)曲唑濃度增加而逐漸降低，來(lái)曲唑抑制雄激素促細(xì)胞增殖作用（圖3）。

圖3 不同濃度來(lái)曲唑聯(lián)合100 nmol/L雄激素作用48 h后對(duì)芳香化酶過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型增殖能力的影響

2.4 熒光顯微鏡檢測(cè)凋亡

選取20 μmol/L來(lái)曲唑聯(lián)合100 nmol/L雄激素作用于過(guò)表達(dá)芳香化酶MCF-7-VC3AI、ZR7530-VC3AI細(xì)胞，48 h后檢測(cè)綠色熒光（圖4）。大多數(shù)死亡細(xì)胞都能觀測(cè)到綠色熒光，部分死亡細(xì)胞無(wú)綠色熒光，說(shuō)明來(lái)曲唑?qū)θ橄侔┘?xì)胞的細(xì)胞毒性作用不只是促進(jìn)細(xì)胞凋亡還有其他非凋亡途徑參與。同時(shí)，在不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)時(shí)持續(xù)觀測(cè)用藥后細(xì)胞的凋亡情況發(fā)現(xiàn)，用藥12 h后開(kāi)始出現(xiàn)凋亡，綠色熒光能較好地反映細(xì)胞凋亡情況（圖5）。

圖4 來(lái)曲唑促進(jìn)芳香化酶過(guò)表達(dá)細(xì)胞凋亡模型

圖5 實(shí)時(shí)觀測(cè)來(lái)曲唑?qū)Ψ枷慊高^(guò)表達(dá)細(xì)胞模型的凋亡誘導(dǎo)作用

3 討論

芳香化酶是將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵代謝酶，是絕經(jīng)后激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者體內(nèi)雌激素水平升高的主要原因［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者的癌組織中芳香化酶表達(dá)水平升高且酶活性較高，外周血中雌激素水平升高［10-11］。芳香化酶抑制劑可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡［6］。

目前，實(shí)驗(yàn)室普遍采用從乳腺癌患者的癌組織中分離純化癌細(xì)胞進(jìn)行體外研究，因乳腺癌MCF-7及ZR7530細(xì)胞中芳香化酶表達(dá)均較低［12-13］，限制了在細(xì)胞系和分子水平上對(duì)芳香化酶抑制劑作用機(jī)制的研究。因此在體外研究中模擬芳香化酶抑制劑作用并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探索，構(gòu)建芳香化酶過(guò)表達(dá)細(xì)胞系是關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。本研究通過(guò)質(zhì)粒重組，將芳香化酶基因嵌入pCDH-CMV載體，構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，再通過(guò)慢病毒系統(tǒng)在穩(wěn)定過(guò)表達(dá)凋亡熒光指示蛋白的MCF-7-VC3AI、ZR7530-VC3AI細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)芳香化酶。本研究的MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果表明，雌激素和雄激素都可促進(jìn)這兩種細(xì)胞的增殖，體現(xiàn)了芳香化酶將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的生物學(xué)功能，芳香化酶抑制劑來(lái)曲唑可濃度依賴(lài)性地抑制雄激素對(duì)兩種細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

細(xì)胞凋亡是caspase家族蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，其中caspase-3的激活是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。VC3AI可被caspase-3剪切而發(fā)出綠色熒光［7，13］。研究報(bào)道，來(lái)曲唑可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡［6］。本研究通過(guò)構(gòu)建VC3AI和CYP19過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系，在保持細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上實(shí)時(shí)、連續(xù)觀測(cè)來(lái)曲唑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，通過(guò)熒光亮度和數(shù)目可直觀評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡情況，相比于其他觀測(cè)細(xì)胞凋亡的技術(shù)過(guò)程更簡(jiǎn)便。因此，本研究的細(xì)胞模型可用于篩選與來(lái)曲唑聯(lián)合協(xié)同作用的藥物，為進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)耐藥的研究奠定基礎(chǔ)。

研究表明，化療藥物的用藥方式、聯(lián)合藥物的用藥順序等均會(huì)影響藥物療效和不良反應(yīng)，合理的化療藥物用藥方式可達(dá)到最佳療效并使患者不良反應(yīng)降為最低［14］。本研究模型可實(shí)時(shí)、持續(xù)觀測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，可用于篩選最佳用藥方式及最佳用藥時(shí)間。

綜上所述，基于乳腺癌細(xì)胞凋亡實(shí)時(shí)觀測(cè)模型的研究，未來(lái)將通過(guò)構(gòu)建熒光素酶過(guò)表達(dá)癌細(xì)胞，構(gòu)建活體成像動(dòng)物模型，以便實(shí)時(shí)觀測(cè)乳腺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移情況，進(jìn)一步研究探索抗腫瘤藥物的最佳用藥方式和用藥時(shí)間，以期在減少或者不改變既定藥量的基礎(chǔ)上，探索減毒增效的最佳用藥策略。

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