CDA基因變異對卡培他濱治療結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)手足綜合征的影響

李榮振 張思森 楊鐵健 季節(jié) 沈杰

結(jié)直腸癌在中國每年新發(fā)病例約為37.5萬例，男性發(fā)病率明顯高于女性，每年死亡病例約為19.1萬例［1］。近年來，隨著結(jié)直腸癌領(lǐng)域分子分型的進(jìn)一步深入，越來越多的不同作用靶點的藥物給結(jié)直腸癌患者帶來了不同的治療選擇，從而為患者帶來了更多的生存獲益。貝伐珠單抗開啟了晚期結(jié)直腸癌靶向治療的時代［2］。瑞戈非尼的批準(zhǔn)上市也為晚期結(jié)直腸癌患者帶來新的治療選擇［3］。另外，在輔助化療領(lǐng)域，基于對IDEA研究的認(rèn)可，2018年NCCN指南（第1版）推薦對于低危的Ⅲ期結(jié)腸癌推薦3個月的XELOX輔助化療方案（卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑）［4］。

作為5-氟尿嘧啶（5-FU）的前體，卡培他濱被廣泛用于結(jié)直腸癌患者的術(shù)后輔助化療?？ㄅ嗨麨I需要經(jīng)過三步酶聯(lián)反應(yīng)才能轉(zhuǎn)化為5-FU，其中最重要的一步是被胞苷脫氨酶（cytidine deaminase，CDA）和胸苷磷酸化酶代謝成5-FU而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。5-FU的主要作用靶標(biāo)為胸苷酸合成酶，被二氫嘧啶脫氫酶滅活［5］。卡培他濱轉(zhuǎn)化為5-FU的過程中具有腫瘤特異性，因此也降低了不良反應(yīng)發(fā)生率。但是仍有30%的患者會出現(xiàn)手足綜合征（hand foot syn?drome，HFS）。HFS同樣也是持續(xù)輸注5-FU以及其他的細(xì)胞毒性藥物如阿霉素、阿糖胞苷和多西他賽后出現(xiàn)的不良反應(yīng)。HFS的具體臨床表現(xiàn)是手掌足底泛紅、腫脹、感覺麻木，通常會造成劑量下調(diào)甚至治療中止［6］。

遺傳藥理學(xué)的主要目的之一是闡明基因遺傳變異對藥物不良反應(yīng)以及療效的影響［7］。近年來，通過對藥物代謝通路上基因的遺傳變異分析解釋抗腫瘤藥物臨床反應(yīng)的個體差異變得越來越重要［8］。在歐美國家及地區(qū)的高加索人群中，有研究表明CDA基因的一些多態(tài)性位點與卡培他濱引起的HFS有關(guān)［9］。但是CDA基因具有較大的種族差異，目前尚缺乏在中國的結(jié)直腸癌患者當(dāng)中探討CDD基因變異和HFS的相關(guān)性研究。因此，本研究旨在探討卡培他濱代謝通路上CDA基因的多態(tài)性和卡培他濱引起的HFS發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2014年5月至2017年5月在鄭州人民醫(yī)院接受卡培他濱治療的結(jié)直腸癌患者149例。入組標(biāo)準(zhǔn)：1）根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）分期確定為Ⅱ期和Ⅲ期的結(jié)直腸癌或術(shù)后復(fù)發(fā)的結(jié)直腸癌患者；2）治療過程中接受XELOX或卡培他濱單藥方案的患者。本研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（批號：ZZRMYY-140026-3），所有入組的患者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.12 治療方案 卡培他濱化療方案為1 000 mg/m2，2次/d，d1～14，3周為1個治療周期。部分結(jié)直腸癌患者因不耐受調(diào)整為800 mg/m2，2次/d，d1～14，3周為1個治療周期。

HFS的評價為治療兩個周期后，依據(jù)國內(nèi)公認(rèn)的常見不良反應(yīng)事件評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級。3級HFS定義為出現(xiàn)疼痛干擾到正常功能的皮膚損傷。其他的臨床基線資料包括年齡、卡培他濱用藥方案、減量次數(shù)、肝轉(zhuǎn)移等。

1.2.2 血液樣本收集及基因分型 收集149例結(jié)直腸癌患者的外周血標(biāo)本約5 mL提取基因組DNA，按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程采用苯酚氯仿法進(jìn)行DNA的提取，通過飛行時間質(zhì)譜（美國Sequenom公司）的方法對CDA的-451G＞A（rs532545）和-33delC（rs3215400）多態(tài)性位點進(jìn)行分型，5%的樣本隨機(jī)挑選重復(fù)驗證。

1.2.3 外周血單核細(xì)胞及CDA基因mRNA表達(dá)分析隨機(jī)選取入組的91例結(jié)直腸癌患者化療前的外周血標(biāo)本，保存于EDTA抗凝劑管中用標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的提取，用Trizol試劑提取PBMC中的RNA。CDA mRNA表達(dá)采用上海羅氏real-time PCR儀檢測，反應(yīng)體系總計20 μL，GAPDH mRNA的表達(dá)量作為內(nèi)參。CDA mRNA用相對定量法2-△△Ct進(jìn)行計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。χ2檢驗分析多態(tài)性位點基因分型是否符合哈迪溫伯格平衡。在基線臨床資料當(dāng)中，離散型的變量和-451G＞A位點不同基因型的分布采用χ2檢驗，當(dāng)數(shù)據(jù)較少時用Fisher精確檢驗。連續(xù)型的變量和該位點不同基因型的分析采用非參檢驗的Mann-Whitney U（兩組間）。CDA基因的多態(tài)性位點和HFS的相關(guān)性分析采用Logistic回歸模型分析，比較低毒性和高毒性兩組中不同基因型的基因頻率，從而算出風(fēng)險比（OR）值。野生的純合子個體作為參考組。采用t檢驗分析PBMC中不同基因型的CDA mRNA表達(dá)情況。所有表達(dá)的數(shù)據(jù)通過對數(shù)秩轉(zhuǎn)化。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基線臨床資料及CDA基因-451G＞A位點基因分型結(jié)果

149例患者的基線臨床資料中，年齡為25～78歲，中位年齡為54歲，大部分為Ⅲ期的結(jié)直腸癌患者（81.21%）。59.73%患者未進(jìn)行卡培他濱的劑量調(diào)整。3級HFS的發(fā)生率為34.23%，無4級以上的HFS（表1）。

-451G＞A位點的基因分型結(jié)果為野生GG型109例（73.15%），GA型 38例（25.50%），AA型 2例（1.36%），最小等位基因頻率為0.14，三種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.516）。因突變純合子AA型患者相對較少，后期分析中，將AA和GA型患者合并。該位點不同基因型在基線臨床資料中的分布基本均衡。

2.2 -451G＞A位點基因型與HFS的關(guān)聯(lián)性分析

AA與GA型患者合并共計40例。在Logistics回歸分析中，GA/AA基因型患者的3級HFS發(fā)生比例明顯高于野生型GG型患者（50.00%vs.28.44%），并具有顯著性差異（OR=2.53，P=0.014）。

2.3 CDA基因多態(tài)性位點的連鎖不平衡及與基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性分析

本研究通過提取的RNA對CDA的表達(dá)情況進(jìn)行分析，并與-451G＞A位點的基因型進(jìn)行了相關(guān)性統(tǒng)計。在91例PBMC標(biāo)本中，GG型67例，GA型22例，AA型2例，三種基因型分布頻率同樣符合哈迪溫伯格平衡（P=0.903）。將AA/GA型患者合并，共計24例。-451G＞A位點GA/AA型患者的CDA mRNA表達(dá)水平顯著高于野生型GG型的患者（4.01±0.53vs.3.13±0.61，P＜0.001，圖1）。

表1 149例結(jié)直腸癌患者的基線臨床資料

?圖1 CDA基因-451G＞A位點不同基因型患者的外周血單核細(xì)胞中CDA mRNA的相對表達(dá)量

另外，本研究發(fā)現(xiàn)位于CDA基因啟動子區(qū)域的插入變異-33delC和-451C＞T呈現(xiàn)高度的連鎖不平衡（D'=0.92，R'=0.82，圖2）。-33delC位點和3級HFS具有顯著的相關(guān)性。

圖2 CDA基因-451G＞A和-33delC位點的連鎖不平衡分析

3 討論

本研究通過分析卡培他濱代謝通路上CDA基因多態(tài)性與HFS發(fā)生的相關(guān)性，結(jié)果表明CDA基因上的-451G＞A多態(tài)性位點和3級HFS呈顯著性相關(guān)。在PBMC的表達(dá)分析中也發(fā)現(xiàn)該位點突變基因?qū)DA mRNA表達(dá)具有顯著的影響。

CDA參與嘧啶核苷酸補(bǔ)救合成途徑，具有不可逆地催化胞苷和脫氧胞苷水解脫氨基的作用［10］。另外，CDA在多數(shù)胞嘧啶核苷類似物的抗腫瘤藥物的代謝中發(fā)揮重要作用，將前體藥物轉(zhuǎn)化為5-FU［11］。

CDA基因多態(tài)性和胞嘧啶核苷類似物藥物的敏感性或毒性具有相關(guān)性。Yue等［12］的研究發(fā)現(xiàn)位于外顯子區(qū)域的G208A多態(tài)性位點和阿糖胞苷的敏感性相關(guān)。Yonemori等［13］的研究納入接受順鉑吉西他濱治療的腫瘤患者發(fā)現(xiàn)CDA基因208G＞A位點和吉西他濱相關(guān)的毒性有關(guān)，但是樣本量較少不足以說明該基因多態(tài)性位點的具體影響機(jī)制。

本研究與既往Caronia等［9］的研究一致，其納入了130例接受卡培他濱治療的晚期乳腺癌和結(jié)直腸癌患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了CDA基因的rs532545位點和3級HFS的發(fā)生顯著相關(guān)，同時也發(fā)現(xiàn)了rs3215400位點和rs532545位點呈現(xiàn)較強(qiáng)的連鎖不平衡。但是該研究表明在高加索人群當(dāng)中rs532545位點的等位基因頻率約為0.30，而該位點在本研究中只有0.14的等位基因頻率，這說明該位點具有較大的種族差異。另外，上述研究納入為乳腺癌和結(jié)直腸癌的患者，研究人群異質(zhì)性較大，而本研究僅為結(jié)直腸癌患者。本研究發(fā)現(xiàn)GA/AA型的患者CDA mRNA表達(dá)水平明顯較高，這與既住研究結(jié)果相反?？赡苁窃撐稽c存在較大的種族差異，不同人群中表達(dá)情況不一致造成的。Fitzgerald等［14］的研究報道了包含rs602950與rs532545的單倍型和CDA基因表達(dá)的關(guān)系，單倍型在本研究的人群發(fā)生頻率較低（＜1%）。另外，本研究基因表達(dá)的結(jié)果也可以部分解釋CDA基因-451G＞A多態(tài)性位點具有較高3級HFS發(fā)生的原因，GA/AA基因型的個體通過引起CDA mRNA的高表達(dá)從而在卡培他濱代謝過程中將5'脫氧氟胞苷更多地轉(zhuǎn)化為5'脫氧氟脲苷，進(jìn)而更多地代謝為5-FU，因此引起了較高的HFS發(fā)生率?；谀壳氨狙芯拷Y(jié)果，假設(shè)了一個模型即位于CDA啟動子區(qū)域的E2F點缺失可以增加CDA的轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞毒性藥物還可以增加手掌和腳底皮膚的增生率［15］，這樣便使得這些部位的皮膚對5-FU的細(xì)胞毒性更為敏感，從而誘發(fā)了較高級別的HFS［16］。

本研究仍存在一定局限性，首先是研究納入的樣本量較小，還需在更多的樣本當(dāng)中進(jìn)一步驗證。另外，研究為回顧性分析，存在一定偏倚。本研究對-451G＞A多態(tài)性位點引起3級HFS進(jìn)行了探討，同時也從CDA基因mRNA表達(dá)層面去揭示了該位點引起3級HFS的部分原因。相信經(jīng)過大樣本的進(jìn)一步研究驗證之后，基于對CDA基因型的分析可為臨床結(jié)直腸癌患者精準(zhǔn)化療方案的制定提供一定參考，為患者提供更為精準(zhǔn)的化療方案。

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