RNA干擾沉默SOX9對腎細(xì)胞癌786?O細(xì)胞體外增殖、凋亡及裸鼠成瘤能力的影響

楚廣民 張建波 孫淼淼

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)中僅次于膀胱腫瘤的最常見的惡性腫瘤之一，約占腎臟惡性腫瘤的85%［1］。腎癌對于傳統(tǒng)藥物和放射治療不敏感，預(yù)后相對較差，所以尋找新的治療方法顯得尤為重要。SOX9（sex determining region Y?box 9）屬于SRY（sex determination region of Y chromosome）相關(guān)基因家族，目前為止共發(fā)現(xiàn)20多個(gè)SOX基因家族，其共同特點(diǎn)是各個(gè)基因都含有一個(gè)保守的HMG?box DNA 結(jié)合域［2］。有研究表明，SOX9基因的表達(dá)異常與結(jié)直腸癌、肺癌及胰腺癌等多種腫瘤進(jìn)展相關(guān)［3?5］。目前干擾SOX9基因表達(dá)對腎癌細(xì)胞增殖、凋亡及裸鼠成瘤的影響仍有待進(jìn)一步研究。本研究采用小干擾RNA（small interfer?ing RNA，siRNA）技術(shù)沉默下調(diào)腎細(xì)胞癌786?O細(xì)胞中SOX9基因的表達(dá)，檢測其對786?O細(xì)胞增殖、凋亡及裸鼠成瘤的影響，為腎細(xì)胞癌的臨床治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

腎細(xì)胞癌786?O細(xì)胞株購自ATCC（American Type Culture Collection）。細(xì)胞培養(yǎng)基為RPIM?1640（美國Hyclone公司），其中添加10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL及鏈霉素100 IU/mL。所用實(shí)驗(yàn)動物均為BALB/c雌性裸鼠，4～6周齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器和試劑

Multiskan FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司，cx41熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。Hoechst 33342細(xì)胞凋亡試劑盒購于北京聯(lián)科生物科技有限公司，CCK?8試劑盒購于日本東仁化工公司，免疫組織化學(xué)抗體Ki?67購自美國Santa cruz公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)與方法

1.3.1 siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染及qPCR

SOX9siRNA 有效序列為：上游：5′?AG?CAAGTCCGCGAGCCAGTAC?3′，下游：5′?GGT?GTGCCTTCTGTGCTGCAC?3′；對照組序列為：上游：5′?UCCACUGTCACUGGUCCGATT?3′，下游：5′?CGUGACAGUGCCGAGAAT?3′。具體轉(zhuǎn)染方法如下：細(xì)胞生長融合度為70%～80%時(shí)，按操作說明書，分別將INTERFERINGTM轉(zhuǎn)染試劑（Poly?plus Transfection公司，法國）和SOX9 siRNA或陰性對照序列（50 nmol/L的終濃度）加入786?O細(xì)胞培養(yǎng)液中，將細(xì)胞繼續(xù)置于細(xì)胞孵化箱中轉(zhuǎn)染。48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)功能檢測。取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA。按cDNA反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）說明書進(jìn)行操作，將2 μg Total RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增。SOX9序列：上游：5′?CAGAAGTACTGGGAAAGTCGT?3′，下游：5′?CC?GGTACTTGTAGTTGGGGTAGT?3′。內(nèi)參GAP?DH序列：上游：5′?AGCCTCAAGATCATCAG?CAAT?3′，下游：5′?TGTGGTCATGAGTCCTTC?CACG?3′。反應(yīng)體系總體積 20 μL，其中模板 cD?NA為1.5 μL，上、下游引物分別為1 μL，SYBR混合物 10 μL，無菌蒸餾水 6.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，用2?△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.2 CCK?8法檢測細(xì)胞活性

將各組786?O細(xì)胞制成細(xì)胞混懸液，以3×104個(gè)/孔的密度種于96孔板中，于細(xì)胞孵箱中分別孵育0、24、48、72 h。用100 μL的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基與10 μL的CCK?8試劑混勻并加入各孔之中，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1 h。最后將96孔板置于酶標(biāo)儀下，于450 nm激發(fā)光下測定光密度（opti?cal density，OD）值。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組3個(gè)復(fù)孔。

1.3.3 Hoechst 33342細(xì)胞熒光染色

轉(zhuǎn)染48 h后，將各組786?O細(xì)胞制備成1×105個(gè)/mL濃度細(xì)胞混懸液。取2 mL細(xì)胞混懸液加入6孔板（底部置入1張清潔載玻片）中，將6孔板置入細(xì)胞培養(yǎng)箱。48 h后將爬滿細(xì)胞的玻片用PBS清洗3次，然后用4%多聚甲醛固定1 h。再次將玻片用PBS清洗3遍。然后將玻片浸泡在裝有Hoechst33342染液的染色缸中10 min。熒光顯微鏡（×100）下，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)?；罴?xì)胞呈彌散均勻熒光，凋亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，3個(gè)或3個(gè)以上的DNA熒光碎片被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞［6］。

1.3.4 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)過siRNA轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞2×106個(gè)重懸于100 μL PBS，分別皮下接種于裸鼠右前肢腋下。每隔5天，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長（L）和寬（W），瘤體體積計(jì)算公式為LW2/2（mm3）。初始每組11只裸鼠，第7天時(shí)，SOX9沉默組有一只裸鼠因注射部位感染而死亡，對照組有一只裸鼠從始至終未長出腫瘤。第20天時(shí)處死裸鼠，仔細(xì)分離瘤體并稱重。瘤體組織用于后續(xù)免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色

新鮮的腫瘤組織從裸鼠體內(nèi)分離后立即用4%多聚甲醛溶液行標(biāo)本固定。然后經(jīng)酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，用切片機(jī)切成厚約4 μm的組織薄片。經(jīng)二甲苯及梯度酒精處理予以脫蠟至水化。滴加Ki?67抗體孵育過夜，二抗孵育1 h。行二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精染色后中性樹脂封片。在普通顯微鏡下，隨機(jī)取5個(gè)40倍高清視野計(jì)數(shù)總的細(xì)胞數(shù)目及Ki?67陽性細(xì)胞數(shù)目，其中細(xì)胞核為棕褐色即視為 Ki?67 染色陽性。Ki?67 陽性細(xì)胞比例=Ki?67 陽性細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.3.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染了siRNA的786?O細(xì)胞制成單細(xì)胞混懸液，以1 000個(gè)/孔的密度接種于普通6孔板。將六孔板置于細(xì)胞孵箱中，每兩天更換一次新鮮培養(yǎng)基。14天之后，將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色。普通顯微鏡（×100）下隨機(jī)取5個(gè)視野，并計(jì)數(shù)大于100個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞集落數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組3個(gè)復(fù)孔。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)處理均采用SPSS 13.0軟件。計(jì)量資料表達(dá)形式為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），兩組間的比較采用student?t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默SOX9基因的表達(dá)影響786?O細(xì)胞的活性

轉(zhuǎn)染48 h后，相對于對照組而言，沉默組中SOX9mRNA的表達(dá)水平顯著降低，干擾效率為83.8%（圖1A）。同時(shí)轉(zhuǎn)染48 h及72 h后，SOX9沉默組的細(xì)胞活性相對于對照組顯著降低（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 干擾沉默SOX9基因?qū)?86?O細(xì)胞活性的影響Figure 1 Effects of SOX9 siRNA on cell viability of 786?O cells

2.2 沉默SOX9基因的表達(dá)抑制786?O細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腎癌786?O細(xì)胞轉(zhuǎn)染SOX9siRNA后，SOX9沉默組的細(xì)胞集落數(shù)為（140.0±11.52）個(gè)，顯著低于對照組的細(xì)胞集落數(shù)（323.3±14.51）個(gè)（P＜0.05）（圖2A和圖2B）。Hoechst 33342細(xì)胞熒光染色結(jié)果顯示，SOX9沉默組細(xì)胞凋亡比例為（27.7±3.25）%，顯著高于對照組細(xì)胞凋亡比例（6.0±0.94）%（P＜0.05）（圖3A和圖3B）。

2.3 沉默SOX9基因的表達(dá)抑制786?O細(xì)胞裸鼠成瘤能力。

將SOX9siRNA轉(zhuǎn)染后的786?O細(xì)胞及其對照組細(xì)胞分別接種到BALB/c裸鼠體內(nèi)，觀察其成瘤能力。在第20天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，SOX9沉默組平均瘤體體積為（315.44±63.73）mm3，明顯小于對照組平均瘤體體積（595.2±50.52）mm3（圖 4A）。同時(shí)SOX9沉默組平均瘤體重量為（0.43±0.23）g，顯著低于對照組的平均瘤體重量（0.89±0.16）g（P＜0.05）（圖 4B）。Ki?67 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖5所示，SOX沉默組Ki?67陽性的細(xì)胞比例為（13.3±2.66）%，顯著低于對照組腫瘤組織中Ki?67陽性的細(xì)胞比例（56.3±3.21）%（P＜0.05）。

圖2 干擾沉默SOX9基因?qū)?86?O細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Effects of SOX9 siRNA on 786?O cells proliferation

圖3 沉默SOX9基因?qū)?86?O細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effects of SOX9 siRNA on 786?O cells apoptosis

3 討論

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，手術(shù)切除結(jié)合分子靶向藥物是其主要的治療方法。但是腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多基因參與的過程，部分腎癌患者對現(xiàn)有的分子靶向藥物治療并不敏感。所以尋找新的分子靶點(diǎn)，對于腎癌的治療具有重要的意義。

圖4 干擾沉默SOX9基因?qū)?86?O細(xì)胞裸鼠成瘤能力的影響Figure 4 Effects of SOX9 siRNA on 786?O cells tumorigenesis in nude mice

圖5 干擾沉默SOX9基因?qū)?86?O細(xì)胞Ki?67蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effects of SOX9 siRNA on Ki?67 protein expression in 786?O cells

SOX基因超家族參與人體眾多重要的生理過程，如決定性別、調(diào)節(jié)胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、參與軟骨形成、晶狀體的發(fā)育、血細(xì)胞生成等等［7?8］。近年來相關(guān)研究表明，SOX基因家族與人類腫瘤關(guān)系密切，如SOX2基因通過調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［9］。SOX6基因在肝癌組織中表達(dá)明顯降低，且低表達(dá)SOX6基因的患者預(yù)后較差［10］?？谇击[狀細(xì)胞癌患者的SOX7低表達(dá)與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤高分級分期密切相關(guān)，抑制SOX7的表達(dá)能夠降低口腔鱗狀上皮癌細(xì)胞增殖及侵襲能力［11］。SOX9基因表達(dá)異常升高可導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生［3］，且在肺癌和胰腺癌組織中表達(dá)豐富，參與調(diào)節(jié)其相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［4?5］，此外也與乳腺癌的預(yù)后密切相關(guān)［12］。SOX9表達(dá)增強(qiáng)能夠促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［13］，而沉默SOX9基因的表達(dá)能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖［14］。此外，在前列腺癌中SOX9發(fā)揮抑癌基因的作用，低表達(dá)SOX9基因與ERG陽性的前列腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切關(guān)聯(lián)［15］。有報(bào)道稱SOX9在相應(yīng)的腎細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)，與其預(yù)后密切相關(guān)［16］。但涉及SOX9基因的表達(dá)對腎細(xì)胞癌細(xì)胞功能的相關(guān)影響仍未見報(bào)道。

為探究SOX9對腎細(xì)胞癌786?O細(xì)胞增殖的影響，本研究采用CCK?8檢測siRNA干擾沉默SOX9基因表達(dá)對細(xì)胞活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默SOX9表達(dá)后786?O細(xì)胞活性顯著下降。同時(shí)，相應(yīng)的平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和Hoechst 33342細(xì)胞熒光染色結(jié)果進(jìn)一步顯示，干擾沉默SOX9能顯著抑制786?O細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡增加。早期研究表明，在體外敲除SOX9基因能夠顯著抑制甲狀腺癌、直腸癌及胃癌等細(xì)胞的增殖［3，17?18］，促進(jìn)脊索神經(jīng)瘤細(xì)胞凋亡［19］；此外，敲除骨肉瘤細(xì)胞系SOX9基因的表達(dá)既能導(dǎo)致細(xì)胞增殖被抑制，同時(shí)也能促進(jìn)其細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本吻合。

此外，為進(jìn)一步了解沉默SOX9基因?qū)w內(nèi)腎癌細(xì)胞增殖的影響，本研究將細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)觀察腫瘤體積及重量的變化。結(jié)果表明，SOX9沉默組腫瘤體積與腫瘤重量均低于對照組。Ki?67是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖中不可缺少，該蛋白高表達(dá)反應(yīng)細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，是一個(gè)常用的細(xì)胞增殖抗原［21］。數(shù)據(jù)顯示，沉默SOX9基因后，增殖抗原Ki?67的表達(dá)顯著被抑制。提示沉默SOX9基因同樣能夠抑制體內(nèi)腎細(xì)胞癌786?O細(xì)胞的增殖，與其體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜合上述研究結(jié)果，干擾沉默SOX9的表達(dá)能夠顯著抑制腎細(xì)胞癌786?O細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)該細(xì)胞凋亡。同時(shí)證明在體外及動物體內(nèi)靶向抑制SOX9基因表達(dá)能夠有效地殺傷腎細(xì)胞癌相關(guān)細(xì)胞系，進(jìn)一步為腎細(xì)胞癌的臨床治療提供參考。

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