兩種無義突變p.Gln263X和p.Tyr351X導致的遺傳性凝血因子Ⅺ缺陷癥家系分析

翁妙珊 林芬 章金燦 吳教仁 邢少宜 楊立業(yè)★

凝血因子Ⅺ（FⅪ）缺陷癥曾被稱為血友病C、遺傳性血漿凝血激酶前質(zhì)缺乏癥、Rosenthal綜合征等，為常染色體不完全隱性遺傳病。該病在人群中的發(fā)生率約為1/10萬～1/100萬，猶太人和法國巴斯克地區(qū)發(fā)生率較高［1］。遺傳性FⅪ缺陷癥主要與FⅪ基因的突變有關(guān)，患者較少出現(xiàn)自發(fā)性出血，部分致病基因攜帶者有輕微的出血傾向。目前我國對于該病的報道較少，國內(nèi)的FⅪ基因突變類型以無義突變和錯義突變最為常見［2?5］，還有少見的剪接突變［6］以及移碼突變［5，7］等。本文通過對1個遺傳性FⅪ缺陷癥家系進行凝血指標檢測與基因突變分析，進而探討其分子發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

先證者，男，61歲，廣東省潮州市楓溪區(qū)人，因“混合痔”入住我院治療。檢查凝血常規(guī)時發(fā)現(xiàn)單純性活化性凝血活酶時間（activited partial thombo?plastin time，APTT）延長達86.0 s，遂行 APTT糾正試驗，確定為凝血因子缺乏，進一步篩查凝血因子活性，發(fā)現(xiàn)FⅪ：C僅為1.7%，其他凝血指標均無明顯異常，考慮患者為FⅪ缺陷癥?；颊咦栽V并無自發(fā)出血病史和血栓病史，僅因痔瘡原因?qū)е麓蟊銜r有滴血癥狀。其父母非近親婚配，家系中其他成員均無出血病史和血栓病史。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準，在獲得先證者與家系成員的知情同意下，采集先證者與家系成員（共5人）外周血標本各2管，0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝，1管用于檢測凝血指標，并于2 h內(nèi)完成；另1管-80℃凍存，準備用于抽提DNA，進一步做基因檢測。

1.2.2 凝血指標檢測

采用美國ACL TOP700全自動血凝儀對先證者及其家系成員進行PT、APTT、凝血因子Ⅷ活性（FⅧ：C）、凝血因子Ⅸ活性（FⅨ：C）、FⅪ：C和凝血因子Ⅻ活性（FⅫ：C）的檢測，配套試劑為美國IL公司產(chǎn)品。

1.2.3 基因分析方法

采用深圳亞能生物技術(shù)有限公司試劑盒，提取基因組DNA，對先證者FⅪ基因所有的外顯子及其側(cè)翼序列進行PCR擴增，引物序列及擴增片段參照文獻［8］。PCR產(chǎn)物純化后用ABI 3700測序儀（Applied Biosystems，美國）進行測序，測序的結(jié)果通過網(wǎng)站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進行序列比較。家系成員僅針對先證者基因突變區(qū)域進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 凝血指標檢測結(jié)果

先證者APTT明顯延長為86.0 s，F(xiàn)Ⅺ：C明顯降低僅為1.7%，其兒子和女兒APTT略延長，分別為40.7 s和41.4 s；其母親、兒子和女兒FⅪ：C均輕度降低，分別為58.9%、51.2%和50.8%。先證者和家系成員的其他凝血指標均無明顯異常，凝血指標檢測結(jié)果見表1。

2.2 FⅪ基因檢測結(jié)果

基因測序發(fā)現(xiàn)先證者8號外顯子存在c.841C＞T，為無義突變 CAA→TAA（p.Gln263X），同時在10號外顯子還存在無義突變c.1107C＞A即TAC→TAA（p.Tyr351X）。家系成員中，先證者的女兒為c.841C＞T雜合突變，母親及兒子均為c.1107C＞A雜合突變。基因檢測結(jié)果見表2和圖1。經(jīng)查詢FⅪ基因突變數(shù)據(jù)庫（http：//factorxi.org），c.1107C＞A（p.Tyr351X）為國內(nèi)首次報道。

表1 FⅪ缺陷癥家系凝血指標檢測結(jié)果Table 1 The coagulation indices of the hereditary coagulation factorⅪdeficiency family

表2 FⅪ缺陷癥家系基因型檢測結(jié)果Table 2 The genotype results of the hereditary coagulation factorⅪdeficiency family

圖1 FⅪ基因突變測序結(jié)果Figure 1 The sequencing results of factorⅪgene mutation

2.3 家系圖譜分析

家系分析表明，先證者的女兒攜帶p.Gln263X，其母親及兒子則攜帶了p.Tyr351X，可見先證者的p.Tyr351X基因突變遺傳自母親，p.Gln263X基因突變則推測遺傳自已故的父親，而先證者兒子和女兒各自攜帶的FⅪ雜合突變基因則遺傳自先證者，家系圖譜見圖2。

圖2 本例遺傳性FⅪ缺陷癥家系圖Figure 2 The family tree of hereditary coagulation factorⅪdeficiency

3 討論

遺傳性FⅪ缺陷癥是由合成FⅪ蛋白的基因發(fā)生突變引起，該基因位于第4號染色體長臂（4q35），含15個外顯子和14個內(nèi)含子。其中，外顯子3～10編碼成熟蛋白質(zhì)位于氨基端4個AP結(jié)構(gòu)域，由369個氨基酸殘基組成重鏈區(qū)，外顯子11～15編碼羧基端的催化結(jié)構(gòu)域，由238個氨基酸殘基組成輕鏈區(qū)。成熟FⅪ蛋白以絲氨酸蛋白酶原形式存在于血液中，為同源二聚體結(jié)構(gòu)。

本文先證者APTT明顯延長達86.0 s，F(xiàn)Ⅺ：C僅為1.7%，而其他凝血指標均未見異常，故診斷為FⅪ缺陷癥。經(jīng)FⅪ基因測序發(fā)現(xiàn)，先證者為8號外 顯 子 c.841C＞T（p.Gln263X）及 10 號 外顯 子c.1107C＞A（p.Tyr351X）復合雜合突變。先證者10號外顯子c.1107C＞A突變可使編碼351位酪氨酸密碼子TAC變?yōu)榻K止密碼子TAA，Tyr351位于重鏈區(qū)AP4區(qū)域，該區(qū)域中第321位半胱氨酸（Cys）是2個FⅪ單體間通過二硫鍵形成二聚體的部位，同時還是FⅫa結(jié)合區(qū)域。c.1107C＞A導致Tyr351無義突變，使蛋白結(jié)構(gòu)的完整性及區(qū)域功能性受到影響，因缺失AP4部分區(qū)域和整個催化結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生的截短蛋白因高度不穩(wěn)定可能是循環(huán)中FⅪ：C減低的原因。Au等［9］于2003年首次報道FⅪ基因p.Tyr351X，先證者為1名56歲女性，因拔牙后出血時間延長而被發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Ⅺ：C為1%，基因型為p.Tyr351X/p.Gln263X復合雜合子，其二女兒和小女兒為p.Tyr351X雜合子，大女兒及三女兒為p.Gln263X雜合子。巧合的是，本文先證者基因型與首次報道的先證者基因型完全一樣。經(jīng)查詢FⅪ基因突變數(shù)據(jù)庫（http：//factorxi.org），c.1107C＞A（p.Tyr351X）為國內(nèi)首次報道，而本文先證者的基因型p.Tyr351X/p.Gln263X為新發(fā)現(xiàn)的FⅪ男性復合雜合子突變類型。

Gln263位于FⅪ基因8號外顯子，即重鏈區(qū)AP3區(qū)域，該區(qū)域有結(jié)合FⅨ、肝素和血小板GPⅠb的作用。c.841C＞T雜合無義突變，使編碼263位的谷氨酰胺提前出現(xiàn)終止密碼子（CAA→TAA），多肽鏈截短使AP3缺失部分序列，整個AP4區(qū)域和輕鏈區(qū)也全部缺失，結(jié)構(gòu)功能域的不完整性和截短蛋白的不穩(wěn)定性可能是導致FⅪ：C下降的原因。也有學者認為，活化的血小板上約有1 500個FⅪ結(jié)合位點，由其上面的血小板GPⅠb介導連接［4］。而Gln263是AP3結(jié)構(gòu)域中血小板的結(jié)合位點之一，因此p.Gln263X可能會干擾AP3結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)形成從而影響其相關(guān)的功能。本文先證者FⅪ：C僅為1.7%，考慮p.Tyr351X和p.Gln263X復合雜合突變是導致其血漿中FⅪ活性極度降低的原因。p.Gln263X在2000年首次發(fā)現(xiàn)于日本家庭中［10?11］，國內(nèi)也有一些文獻報道其研究的 FⅪ缺陷癥家系中存在 p.Gln263X［4，5，12］。Asselta等［13］對全球FⅪ缺陷癥的發(fā)病率及基因突變類型的發(fā)生頻率做了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)東亞人群的FⅪ缺陷癥發(fā)病率約為20.3/100萬，其中p.Gln263X約占東亞人群基因突變類型的28.2%，可見該突變在東亞人群中有較高的發(fā)生頻率。

遺傳性FⅪ缺陷癥臨床表現(xiàn)多樣，雖然FⅪ：C低于15%～20%被認為發(fā)生出血的危險概率最高，但是FⅪ：C水平的高低并不是FⅪ缺陷癥患者出血的發(fā)生率及出血程度的唯一決定因素［14］，出血癥狀的輕微與否還與所累及的組織有關(guān)，在纖溶組織活性高的部位出血癥狀較為嚴重。由于FⅪ：C的血漿水平與出血發(fā)生率及出血程度間無明顯相關(guān)性，使該疾病的診斷和治療存在多變性［15］。本研究中雖然先證者FⅪ重度缺乏，但并無自發(fā)出血癥狀，因FⅪ出血風險難以預測，我院對其采取了保守治療，未施行手術(shù)。

基因分析不僅能檢測出FⅪ缺陷癥的突變基因，也有助于更準確地對其家系成員進行篩查和診斷，是目前家系患病風險估計與預測中最有效與最直接的檢測手段之一，不僅能節(jié)省測序成本，也避免家系成員重復血液檢查。我們在粵東潮州地區(qū)發(fā)現(xiàn)的FⅪ缺陷癥p.Tyr351X/p.Gln263X為新的FⅪ男性復合雜合子突變類型，本地區(qū)的突變類型是否與國內(nèi)其他地區(qū)有所不同，是否有突變熱點，有待進一步研究。

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