G6PD活性、UGT1A1、SLCO1B1、ABCC2基因多態(tài)性和新生兒高膽紅素血癥的關(guān)系研究

肖奇志 郭洪創(chuàng) 李戀湘 王昭晴 李磊 鄺文英 周玉球

葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（glucose?6?phosphate de?hydrogenase，G6PD）缺乏癥是一種常見的遺傳性疾病，該病是一種公認(rèn)的導(dǎo)致新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素［1］，約30%永久性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的黃疸新生兒為 G6PD 缺乏［2?3］。UGT1A1基因編碼的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1（UDP?glucuronosyl transferase 1A1，UGT1A1），肝細(xì)胞溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員1B 1（solute carrier organic anion transporter family member 1 B1，SLCO1B1）基因編碼的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽C（organic anion transporter polypeptide C，OATP?C）和ATP結(jié)合盒子亞家族C成員2（ATP?binding cas?sette subfamily C member 2 gene，ABCC2）基因編碼的多藥耐受相關(guān)蛋白 2（multidrug?resistance pro?tein 2，MRP2）是膽紅素排泄通路上的重要蛋白。未結(jié)合膽紅素主要是由紅細(xì)胞破碎產(chǎn)生，然后由肝細(xì)胞膜上的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽C將未結(jié)合膽紅素從血液系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞內(nèi)，在肝細(xì)胞內(nèi)的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1催化未結(jié)合膽紅素與葡萄糖醛酸結(jié)合形成水溶性、不能透過半透膜的結(jié)合膽紅素，結(jié)合膽紅素通過多藥耐受相關(guān)蛋白2轉(zhuǎn)運(yùn)到膽管，再經(jīng)膽汁排至腸道內(nèi)［4］。未結(jié)合膽紅素為脂溶性，可穿過新生兒不完整的血腦屏障和細(xì)胞膜，引起細(xì)胞和腦組織損傷，導(dǎo)致急性和慢性膽紅素腦病，即核黃疸，嚴(yán)重者病死率高，存活者多留有后遺癥，高達(dá)42.2%［5］。G6PD缺乏癥的患者頻繁發(fā)生溶血，導(dǎo)致膽紅素的生成過多，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽C和多藥耐受相關(guān)蛋白2負(fù)責(zé)膽紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄。因此，G6PD酶活性缺乏，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽C和多藥耐受相關(guān)蛋白2功能的缺陷都會(huì)影響膽紅素的產(chǎn)生和排泄，與新生兒膽紅素水平升高密切相關(guān)。

已有報(bào)道表明，UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A（TA）6TAA?A（TA）7TAA（rs8175347）變異位點(diǎn)通過影響UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)TATA盒，影響UGT1A1基因的表達(dá)，進(jìn)而增加新生兒核黃疸的發(fā)生率［6］。同樣，UGT1A1基因1號(hào)外顯子的211G＞A錯(cuò)義突變（UGT1A1*6，rs4148323）在一個(gè)大規(guī)模的全基因組關(guān)聯(lián)研究分析中發(fā)現(xiàn)與血清膽紅素濃度密切相關(guān)［7］。因此，影響UGT1A1，SLCO1B1和ABCC2基因功能的單核苷酸多態(tài)性（single nucleo?tide polymorphism，SNPs）位點(diǎn)均可能影響對(duì)應(yīng)蛋白的功能進(jìn)而影響新生兒外周血膽紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)與排泄。除了上述2個(gè)變異位點(diǎn)以外，UGT1A1基因?3279T＞G（rs4124874），SLCO1B1的?11187G＞A（rs4149015） ，388A＞G （rs2306283） ，521T＞C（rs4149056）和ABCC2基因的?24C＞T（rs717620），1249G＞A（rs2273697）也被報(bào)道影響對(duì)應(yīng)蛋白的功能［8?12］，可能成為新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)因素。

為此，本研究通過分析膽紅素濃度峰值與候選基因功能性SNPs之間的相關(guān)性，探討上述8個(gè)SNPs位點(diǎn)是否會(huì)影響中國(guó)人新生兒高膽紅素水平以及是否與G6PD缺乏癥對(duì)外周血膽紅素水平具有積累和協(xié)同作用，是否會(huì)增加G6PD缺乏癥新生兒高膽紅素血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，本研究結(jié)果將為新生兒高膽紅素血癥的防控奠定理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

珠海市婦幼保健院出生后15天以內(nèi)的足月新生兒，共收集457例，其中男性329例，女性128例。所有病例中高膽紅素血癥病例（高膽紅素組）共計(jì)285例，膽紅素正常病例（膽紅素正常組）共計(jì)172例，高膽紅素組體重范圍為2 600～3 900 g，平均體重為3 254 g，男女比例為2.5：1；膽紅素正常組體重范圍為2 550～3 850 g，平均體重為3 140 g，男女比例為2.2：1；高膽紅素組中G6PD活性缺乏共計(jì)203例，G6PD活性正常共計(jì)82例；膽紅素正常組中G6PD活性缺乏共計(jì)76例，G6PD活性正常共計(jì)96例。兩組病例中均排除其它因素影響血清總膽紅素的個(gè)體，如早產(chǎn)兒、窒息、敗血癥、乙肝大三陽、膽管阻塞、ABO和Rh血型不合導(dǎo)致的溶血、攜帶其它血紅蛋白病（如地中海貧血）、嚴(yán)重脫水、嚴(yán)重血管外溶血（如頭顱血腫、皮下血腫、肺等部位大出血）、極低體重出生兒等，所有病例的臍帶血標(biāo)本被收集。

1.2 方法

1.2.1 G6PD缺乏癥病例的診斷

①G6PD/6PGD比值法，G6PD/6PGD＜1.5為G6PD活性缺乏，G6PD/6PGD＞1.5為G6PD活性正常；②熒光斑點(diǎn)法，根據(jù)熒光斑點(diǎn)強(qiáng)弱判斷為G6PD活性重度缺乏，中度缺乏和G6PD活性正常；③采用廈門致善生物科技有限公司的探針熔解曲線G6PD基因突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)到G6PD基因突變［13］。

1.2.2 病理性黃疸的診斷

測(cè)量新生兒從出生后第1天到第7天的皮測(cè)膽紅素值（JM?103，KONICA MINOLTA，日本）和血清總膽紅素值（釩酸鹽氧化法，上?？迫A生物股份有限公司），以最高的那一次數(shù)值為峰值。血清總膽紅素峰值大于221 μmol/L為病理性黃疸，血清總膽紅素峰值小于221 μmol/L為膽紅素?cái)?shù)值正常個(gè)體［14］。

1.2.3 基因組DNA提取

抽取新生兒臍帶血1 mL，采用DNA提取試劑盒（廈門致善生物科技有限公司）提取基因組DNA，-20℃保存。

1.2.4 SNPs分型

待分析的SNPs位點(diǎn)有8個(gè)，分別為UGT1A1基因 A（TA）6TAA?A（TA）7TAA（rs8175347）、?3279T＞G（rs4124874）和211G＞A（rs4148323）；SL?CO1B1基因的?11187G＞A（rs4149015）、388A＞G（rs2306283）和 521T＞C（rs4149056）；ABCC2基因的?24C＞T（rs717620）和 1249G＞A（rs2273697）。本次設(shè)計(jì)引物采用軟件Oligo 6.31（Molecular Biol?ogy Insights，Inc.CO，美國(guó)）和 Primer premier 5.0設(shè)計(jì)上下游引物，PCR擴(kuò)增以后通過DNA測(cè)序獲得該位點(diǎn)的SNPs分型結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

G6PD缺乏組與G6PD正常組之間的計(jì)量資料均數(shù)比較采用兩樣本的t檢驗(yàn)分析，樣本性別和基因型的構(gòu)成比較采用χ2檢驗(yàn)，各個(gè)SNPs位點(diǎn)與血清膽紅素分析的不同遺傳模型方式采用R軟件的SNPassoc軟件包進(jìn)行分析［15］，新生兒攜帶不同風(fēng)險(xiǎn)因素發(fā)生高膽紅素血癥的優(yōu)勢(shì)比（ORs）和95%的置信區(qū)間用卡方檢驗(yàn)分析。樣本間的顯著性采用雙側(cè)檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P<0.05。所有統(tǒng)計(jì)圖表和數(shù)據(jù)均用R 3.4.1軟件制作和分析。

2 結(jié)果

2.1 G6PD缺乏組和G6PD正常組基本資料對(duì)比

G6PD缺乏組和G6PD正常組基本資料對(duì)比結(jié)果見表1。其中G6PD缺乏組外周血清膽紅素濃度峰值為（276.55±94.92）μmol/L，顯著高于G6PD正常組外周血清膽紅素濃度峰值（220.12±89.39）μmol/L（P＜0.001）。除了UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)A（TA）6TAA?A（TA）7TAA 以外，G6PD 缺乏組與G6PD正常組在男女比例，UGT1A1、SLCO1B1和ABCC2基因其余7個(gè)SNPs基因型之間的分布上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 8個(gè)SNPs對(duì)新生兒血清膽紅素水平的影響

分別應(yīng)用顯性遺傳模型、隱性遺傳模型和加性遺傳模型分析上述8個(gè)SNPs對(duì)新生兒血清膽紅素峰值濃度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)UGT1A1211G＞A在3種遺傳模式下均顯著影響新生兒外周血膽紅素水平（P＜0.05），SLCO1B1?11187G＞A在顯性遺傳模型下顯著影響新生兒外周血膽紅素水平（P=0.039）。其余6個(gè)SNPs位點(diǎn)在3種遺傳模型下均對(duì)新生兒血清膽紅素水平?jīng)]有顯著性影響，見表2。

2.3 新生兒高膽紅素血癥風(fēng)險(xiǎn)因素的積累效應(yīng)

在上面研究中發(fā)現(xiàn)G6PD活性、UGT1A1211G＞A和SLCO1B1?11187G＞A在顯性遺傳模型下均可以顯著影響新生兒高膽紅素峰值水平。由此根據(jù)攜帶3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素的差異把樣本分為8組，根據(jù)新生兒高膽紅素血癥峰值的閾值221 μmol/L把所有新生兒分為高膽紅素血癥組和非高膽紅素血癥組。其中不攜帶3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素的第1組（G6PD正常，211GG，?11187GG）發(fā)生新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)值定義為1，分別應(yīng)用卡方檢驗(yàn)比較其它各組與第1組的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，得出其它各組的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值以及95%的置信區(qū)間。從表3中可以看到隨著風(fēng)險(xiǎn)因素?cái)y帶數(shù)量的增多，新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)逐漸增加，攜帶3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素的第8組發(fā)生新生兒高膽紅素血癥的可能性為第1組的8.78倍（95%的置信區(qū)間：2.72～28.39）。從圖1中也可以看出，隨著攜帶風(fēng)險(xiǎn)因素的增加，箱體總體上移，第7組與第8組75%的病例膽紅素峰值均已超過221 μmol/L（圖1中紅線）。

表1 G6PD缺乏組與G6PD正常組的基本資料比較Table 1 Comparison of clinical characteristics of G6PD deficient group and G6PD normal group

表2 不同遺傳模型下8個(gè)SNPs對(duì)新生兒血清膽紅素濃度的影響Table 2 The impact of 8 SNPs on neonatal serum bilirubin concentration using the different genetic models

3 討論

新生兒外周血膽紅素濃度水平取決于紅細(xì)胞在體內(nèi)的破壞速度與機(jī)體對(duì)膽紅素的處理兩方面，也就是血清總膽紅素濃度由膽紅素的產(chǎn)生、結(jié)合和排泄過程動(dòng)態(tài)決定。新生兒G6PD活性缺乏可以導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血進(jìn)而增加膽紅素的產(chǎn)生，本研究中G6PD缺乏組新生兒高膽紅素血癥峰值顯著高于G6PD正常組（P＜0.001），這再次證明了G6PD活性缺乏是新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)因素。而膽紅素代謝通路上相關(guān)基因的SNPs位點(diǎn)可能影響膽紅素的結(jié)合和排泄進(jìn)而與新生兒高膽紅素血癥密切相關(guān)，單個(gè)基因多態(tài)性的研究國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道［4，6，9］。研究表明UGT1A1、SLCO1B1和ABCC2啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)的遺傳變異位點(diǎn)可能導(dǎo)致蛋白含量下降或者功能喪失，進(jìn)而增加新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)，特別是UGT1A1啟動(dòng)子區(qū)A（TA）6TAA?A（TA）7TAA、?3279T＞G 和編碼區(qū)211G＞A是新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)因素［6?8，16］。在本研究中，UGT1A1基因 211 G＞A 在不同的遺傳模型下均顯著影響新生兒外周血膽紅素峰值，這與其他研究結(jié)果［16］相似，進(jìn)一步證實(shí)了該位點(diǎn)為新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。然而，本研究中UGT1A1啟動(dòng)子區(qū) A（TA）6TAA?A（TA）7TAA和?3279 T＞G在3種遺傳模型下與新生兒外周血膽紅素峰值濃度均無顯著相關(guān)性，這兩個(gè)位點(diǎn)是否為新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)仍有待進(jìn)一步證實(shí)。

表3 3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素的不同組合發(fā)生新生兒高膽紅素血癥的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值以及95%置信區(qū)間Table 3 The odds ratios and their 95%confidence intervals for each group carrying the different risk factors

圖1 攜帶不同風(fēng)險(xiǎn)因素組合的各組新生兒血清總膽紅素濃度峰值的比較Figure 1 Comparison of peak serum bilirubin concentrations for each group carrying the different risk factors

Niemi等［17］報(bào) 道SLCO1B1的 ?11187G＞A、388A＞G和521T＞C影響OATP?C功能。在本研究中，只有SLCO1B1的?11187G＞A在顯性模型下顯著影響新生兒外周血膽紅素峰值濃度（P=0.039），Choi等［18］報(bào)道SLCO1B1基因?11187 G＞A 可以影響辛伐他汀在體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，這在一定程度上證實(shí)了SLCO1B1的?11187G＞A位點(diǎn)可能影響有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽C蛋白功能，而本研究發(fā)現(xiàn)的SLCO1B1基因?11187G＞A與新生兒外周血膽紅素峰值濃度相關(guān)目前未見報(bào)道。本研究中SLCO1B1基因 388A＞G和521T＞C在3種遺傳模型下均與新生兒外周血膽紅素峰值濃度無顯著相關(guān)。此外，盡管有報(bào)道顯示ABCC2基因的?24C＞T和1249 G＞A可能影響多藥耐受相關(guān)蛋白2的功能［12］，但本研究中未能證實(shí)這2個(gè)位點(diǎn)與新生兒高膽紅素血癥的相關(guān)性。因此，SLCO1B1基因388A＞G、521T＞C 和ABCC2基 因 的 ?24C＞T、1249G＞A是否會(huì)影響新生兒外周血膽紅素峰值濃度仍有待進(jìn)一步的研究。

在新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)因素分析中，單個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素往往在膽紅素代謝過程中的作用較小，而多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素的積累則可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。因此，本研究通過單因素分析確認(rèn)的新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)因素：G6PD活性缺乏、UGT1A1211G＞A和SLCO1B1?11187G＞A進(jìn)行不同因素的組合，分析攜帶不同風(fēng)險(xiǎn)因素個(gè)體發(fā)生新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)。從表3可以看出，G6PD活性缺乏、UGT1A1211G＞A和SLCO1B1?11187G＞A三者中攜帶風(fēng)險(xiǎn)因素越多，發(fā)生新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)越大，其中攜帶3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素的病例血清高膽紅素血癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是不攜帶任何風(fēng)險(xiǎn)因素病例的8.78倍?？梢钥闯?，隨著攜帶風(fēng)險(xiǎn)因素的數(shù)量增多，新生兒血清膽紅素峰值濃度箱絲圖整體上移，其中第7組與第8組75%以上的個(gè)體均發(fā)生了新生兒高膽紅素血癥。這些結(jié)果表明，G6PD活性缺乏、UGT1A1211G＞A和SL?CO1B1?11187G＞A對(duì)新生兒外周血膽紅素峰值濃度存在積累效應(yīng)，其積累效應(yīng)產(chǎn)生的生物學(xué)基礎(chǔ)為G6PD活性缺乏導(dǎo)致新生兒溶血增加，膽紅素的生成增多，而UGT1A1211G＞A和SLCO1B1?11187G＞A影響尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽C的功能，導(dǎo)致膽紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝障礙，也增加了外周血膽紅素峰值的濃度，若幾個(gè)因素同時(shí)存在，則其作用將累積，導(dǎo)致新生兒外周血膽紅素峰值濃度的進(jìn)一步增高，發(fā)生高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)也進(jìn)一步加大。另外，不同G6PD基因突變類型是否與膽紅素峰值升高的程度有相關(guān)性，需要在后續(xù)的工作中擴(kuò)大研究標(biāo)本的數(shù)量進(jìn)一步研究。

新生兒高膽紅素血癥在G6PD正常新生兒中發(fā)生概率約為7.8%，在G6PD缺乏癥的患兒中發(fā)生率約為15.6%［19］，可見無論在G6PD正常的新生兒還是G6PD缺乏的新生兒中新生兒高膽紅素血癥均較為普遍。本研究?jī)H分析了9個(gè)可能的風(fēng)險(xiǎn)因素與新生兒高膽紅素血癥的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SL?CO1B1基因?11187 G＞A位點(diǎn)為新生兒高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)因素。此外，發(fā)現(xiàn)G6PD缺乏、UGT1A1211 G＞A和SLCO1B1?11187G＞A 3種風(fēng)險(xiǎn)因素對(duì)新生兒外周血膽紅素峰值濃度具有積累效應(yīng)。然而，在臨床上還是存在無上述3種風(fēng)險(xiǎn)因素的新生兒高膽紅素血癥發(fā)生，是否存在其它分子病理機(jī)制，目前機(jī)理不明?？紤]到新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的普遍性，檢測(cè)新生兒G6PD活性和UGT1A1211 G＞A、SLCO1B1?11187G＞A位點(diǎn)的基因型對(duì)臨床上預(yù)防新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生發(fā)展，降低新生兒核黃疸的發(fā)病率，提高我國(guó)人口素質(zhì)具有重要意義。

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