新型多重不對稱PCR?電化學(xué)芯片法檢測甲型流感病毒

蔣析文 黃桃生 黃志文 張險(xiǎn)朋 殷三鴻

甲型流感是由甲型流感病毒（influenza A vi?rus）引起的一種人畜共患的疾病綜合癥。目前許多甲型流感病毒如 H1N1、H3N2、H5N1、H9N2、H7N9 等［1?2］均由禽類傳播到人類中，容易引起極高的死亡率，導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。監(jiān)測是確定甲型流感流行株、發(fā)現(xiàn)變異株、預(yù)測和防控疫情的基礎(chǔ)［3?4］。甲型流感病毒的檢測方法多種多樣，主要包括病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測及核酸檢測［5］。作為流感病毒檢測的傳統(tǒng)方法，病毒培養(yǎng)和血清學(xué)檢測靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性均較低，且操作繁瑣，檢測周期長。核酸分子檢測憑其高特異性及高靈敏度，正逐步取代傳統(tǒng)方法，廣泛用于甲型流感病毒的檢測中，其主要方法包括逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR、芯片及高通量測序技術(shù)等。然而，目前所有針對甲型流感病毒的核酸檢測均以3～4個(gè)型為主，完整的分型檢測幾乎空白。

本研究根據(jù)利用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司自主研發(fā)的電化學(xué)芯片核酸檢測系統(tǒng)，針對甲型流感病毒的血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）常見型別 H1、H3、H5、H7、H9、H10和 N1、N2、N6、N8、N9的基因序列，建立一種基于多重不對稱PCR?電化學(xué)芯片技術(shù)同時(shí)檢測多種甲型流感病毒型的新分子診斷方法，并對200例流感樣動(dòng)物咽拭子樣本進(jìn)行檢測及測序驗(yàn)證，對甲型流感病毒的臨床診斷和治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

c?MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動(dòng) Taq酶、Rnasin、dNTP均購自美國Promega公司，ABI 9700 PCR儀、ABI 7500 Real?time PCR 儀購自美國ABI公司，DA9100電化學(xué)基因傳感器檢測系統(tǒng)（DA?01?004）和核酸提取或純化試劑（磁珠法）（貨號：Cat.#DA?512）及甲型流感相關(guān)熒光定量PCR檢測試劑盒均來自于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.2 臨床樣本

H1N1、H3N2、H5N1、H5N6、H7N9、H9N2、H10N8乙型流感病毒、丙型流感病毒、呼吸道合胞病毒標(biāo)準(zhǔn)病毒株、250例動(dòng)物咽拭子臨床樣本（200例甲型流感陽性、50例陰性）均由東莞動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心提供。

1.3 引物與探針

根據(jù)https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/nph?select.cgi流感數(shù)據(jù)庫中提供的基質(zhì)蛋白（matrix protein，MP）、H1、H3、H5、H7、H9、H10和 N1、N2、N6、N8、N9的基因序列，下載并比對分析后，利用生物軟件Oligo 7.0分別在其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，并通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast同源性比對驗(yàn)證，其中HA和NA序列的下游引物采用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，MP序列采用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增（MP?sense，MP?Anti?sense）。引物和探針均由上海生工生物股份有限公司合成，捕獲探針（capture probe，CP）采用C6 S?S標(biāo)記，信號探針（signal probe，SP）采用二茂鐵（Fc）標(biāo)記，具體序列特征和探針標(biāo)記見表1和表2。

表1 甲型流感病毒分型引物的核酸序列Table 1 Sequences of influenza A virus genotyping primers

表2 甲型流感病毒分型探針的核酸序列Table 2 Sequences of influenza A virus genotyping probes

1.4 病毒基因組核酸提取和PCR擴(kuò)增

標(biāo)準(zhǔn)病毒株及咽拭子樣本核酸的提取采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法），按試劑盒說明書進(jìn)行操作。提取后的核酸置于?20℃冰箱中，并通過甲型流感相關(guān)熒光定量PCR檢測試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）標(biāo)定其濃度。甲型流感多重不對稱PCR采用50 μL反應(yīng)體系，其中主要包含MgCl2（10 mmol/L），KCl（50 mmol/L），12 條上游引物（每條用量3 pmol），3條下游引物（每條30 pmol）以及20 μL擴(kuò)增模板。采用ABI 9700 PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：50℃30 min，95℃15 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；72℃7 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，由于采用的不對稱PCR方法上下游引物用量不對等，擴(kuò)增完成后產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ssDNA），所以雜交檢測前擴(kuò)增產(chǎn)物（50 μL）無需經(jīng)過高溫變性即可直接與信號探針（100 μmol/L）、新生牛血清（10 μL）及高氯酸鈉（20 μL）進(jìn)行雜交，于DA9100電化學(xué)基因傳感器檢測系統(tǒng)中檢測。

1.5 多重不對稱PCR?電化學(xué)芯片法

采用的電化學(xué)基因芯片表面有72個(gè)金電極，捕獲探針分別固定在特制的印刷電路板金電極表面，制備成電化學(xué)芯片，用于捕獲PCR多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，信號探針與已被捕獲的PCR產(chǎn)物特異結(jié)合。同時(shí)，在電極上施加交流電壓，刺激信號探針上的二茂鐵分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，通過檢測電流值來判定結(jié)果陰陽性。

1.5.1 特異性測定

利用確定的PCR?電化學(xué)芯片法體系分別對滅活的乙型流感病毒、丙型流感病毒、呼吸道合胞病毒及甲型流感 H1N1、H3N2、H5N1、H5N6、H7N9、H9N2、H10N8病毒核酸進(jìn)行檢測，評價(jià)其特異性。

1.5.2 靈敏度測定

將己標(biāo)定濃度的甲型流感H1N1、H5N1、H5N6、H7N9的核酸進(jìn)行梯度稀釋，檢測其靈敏度。

1.5.3 臨床樣品檢測

利用本研究所建立的多重不對稱PCR?電化學(xué)芯片法，對通過中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的甲型流感通用型熒光定量PCR檢測試劑盒檢測陽性的200例甲型流感樣本核酸及50例陰性樣本核酸進(jìn)行檢測，并通過本公司生產(chǎn)的甲型流感熒光 PCR 檢測試劑盒（H1N1、H5N1、H7N9、H9N2等）進(jìn)行對照驗(yàn)證，對比方法的一致性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過kappa檢驗(yàn)分析多重不對稱PCR?電化學(xué)芯片法和熒光定量PCR法檢測結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果

2.1 PCR?電化學(xué)芯片法檢測特異性

檢測試劑可以準(zhǔn)確檢測出甲型流感各型別病毒核酸并且未出現(xiàn)錯(cuò)檢、漏檢等情況，而乙型流感病毒、丙型流感病毒以及呼吸道合胞病毒核酸等未出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

2.2 PCR?電化學(xué)芯片法檢測靈敏度

將 H1N1、H5N1、H5N6、H7N9病毒株的核酸進(jìn)行梯度稀釋，直至電化學(xué)芯片法無法檢出為止，結(jié)果顯示當(dāng)核酸濃度低于1×103copies/mL時(shí)，則H1N1和H5N6未見電化學(xué)信號產(chǎn)生，而H5N1和H7N9在100 copies/mL時(shí)出現(xiàn)漏檢。因此，確定該方法靈敏度可達(dá)約1×103copies/mL。

2.3 臨床樣本檢測結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用本研究所建立的多重不對稱PCR?電化學(xué)芯片法對200例甲型流感陽性臨床樣本以及50例陰性樣本進(jìn)行檢測，并采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的對應(yīng)型別熒光定量PCR檢測試劑盒進(jìn)行對照驗(yàn)證，結(jié)果顯示200例甲型流感陽性臨床樣本中，多重不對稱PCR?電化學(xué)芯片法檢出194例陽性，其中6例漏檢，敏感率為97%，50例陰性樣本檢測均為陰性，特異度為100%，kappa分析結(jié)果為0.928（P＜0.000 1）顯示2種方法一致性高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 PCR?電化學(xué)芯片和熒光PCR檢測結(jié)果比較Table 3 The detection outcomes of PCR?electrochemical chip and real?time PCR

具體到不同型別，電化學(xué)方法與熒光定量法比較，結(jié)果顯示H9N2 82例，H5N6 56例，H5N1 16例，H3N2 6例，H10N8 5例未出現(xiàn)漏檢情況，H7N9 27例（電化學(xué)漏檢4例），H1N1 8例（電化學(xué)漏檢2例），通過分析熒光定量Ct值，發(fā)現(xiàn)這6例樣本濃度均低于電化學(xué)方法確定的最低檢出限，結(jié)果見圖1。

圖1 各型別PCR?電化學(xué)芯片與熒光定量PCR樣本檢出比較Figure 1 The detection outcomes of PCR?electrochemical chip and real?time PCR

3 討論

目前已有大量研究［6?8］通過逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測甲型流感病毒通用型、H1N1、H3N2、H7N9等，其靈敏度和特異性均非常高但需根據(jù)Ct值來判斷結(jié)果，且由于熒光通道數(shù)目限制，單管體系最多能檢測4～5種型別，同時(shí)對熒光PCR儀器要求較高，通道過少大大限制了其在分型檢測中的應(yīng)用，故至少需要3管體系才能完成所有常見型甲型流感病毒的檢測。熒光定量PCR技術(shù)要廣泛用于多重分型檢測中，目前要解決的關(guān)鍵問題就是儀器本身對各通道的兼容性。相比熒光PCR，本文方法僅通過單管體系即可完成所有分型檢測，優(yōu)勢明顯。

微陣列芯片法［9?10］和高通量測序技術(shù)（next?generationse quencing，NGS）［11?12］也被廣泛用于甲型流感病毒檢測中。微陣列芯片技術(shù)先進(jìn)，通量高，但其價(jià)格昂貴，勞動(dòng)密集，耗時(shí)較長，且容易受到污染，檢測靈敏度及特異性易受各種因素影響，重復(fù)性差，也容易出現(xiàn)假陰性。如若微陣列芯片技術(shù)能在操作性方面更加自動(dòng)化，成本方面得到進(jìn)一步控制，相信其一定會(huì)成為未來核酸檢測領(lǐng)域的趨勢之一。相比微陣列芯片法，電化學(xué)基因芯片僅需一步分子雜交，2 h內(nèi)即可完成檢測，且結(jié)果顯示良好的重復(fù)性、準(zhǔn)確性及高度特異性。而NGS技術(shù)是由幾個(gè)特定制造商的平臺(tái)、不同的測序方法、試劑和生物信息學(xué)軟件組成，構(gòu)成復(fù)雜，成本高，其結(jié)果分析必須通過特定生物信息學(xué)軟件完成，復(fù)雜繁瑣，耗時(shí)較長，但在通量及挖掘病毒深層信息方面，NGS具有獨(dú)特優(yōu)勢。作為國內(nèi)外分子檢測的最熱點(diǎn)與最前沿技術(shù)，NGS備受關(guān)注，然而，本身復(fù)雜的生物信息學(xué)軟件及居高不下的成本大大制約了其更加廣泛的應(yīng)用。相比NGS，本方法的優(yōu)勢在于檢測結(jié)果以PDF形式呈現(xiàn)，簡潔明了，且成本較低。

本研究根據(jù) https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ge?nomes/FLU/Database/nph?select.cgi流感數(shù)據(jù)庫中提供的幾乎所有 MP、H1、H3、H5、H7、H9、H10 和N1、N2、N6、N8、N9的基因序列進(jìn)行比對分析后，分別在其保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性上游引物，并參照相關(guān)研究［13］確定2條通用引物作為下游引物，而針對MP設(shè)計(jì)特異性引物通過優(yōu)化最終建立可同時(shí)檢測甲型流感病毒 MP、H1、H3、H5、H7、H9、H10和 N1、N2、N6、N8、N9的單管多重不對稱 PCR?電化學(xué)芯片法，經(jīng)過對比實(shí)驗(yàn)，其檢測靈敏度可達(dá)1×103copies/mL，且同時(shí)具有較高特異性和準(zhǔn)確性。因此，我們完全有理由相信新構(gòu)建的電化學(xué)基因芯片方法在甲型流感病毒分型篩查中一定可以發(fā)揮很好的作用。

基因序列的重組、插入、缺失以及突變導(dǎo)致甲型流感病毒經(jīng)常發(fā)生變異，如 H7N9［14］、H9N2［15］等，這使得針對其進(jìn)行分型檢測變得異常困難。因此，我們將密切關(guān)注甲型流感病毒最新信息，及時(shí)更新試劑，為臨床診斷和治療奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］Mgbere O，Ngo K，Khuwaja S，et al.Pandemic?relat?ed health behavior：repeat episodes of influenza?like illness related to the 2009 H1N1 influenza pandemic［J］.Epidemiol Infect，2017，145（12）：2611?2617.

［2］Pulit?Penaloza JA，Simpson N，Yang H，et al.Assess?ment of molecular，antigenic，and pathological fea?tures of canine influenza A（H3N2） viruses that emerged in the United States［J］.J Infect Dis，2017，216（suppl_4）：S499?S507.

［3］Si YJ，Choi WS，Kim YI，et al.Genetic characteris?tics of highly pathogenic H5N8 avian influenza viruses isolated from migratory wild birds in South Korea dur?ing 2014?2015［J］.Arch Virol，2016，161（10）：2749?2764.

［4］Peeters B，Reemers S，Dortmans J，et al.Genetic ver?sus antigenic differences among highly pathogenic H5N1 avian influenza A viruses：Consequences for vaccine strain selection［J］.Virology，2017，503（1）：83?93.

［5］Vemula SV，Zhao J，Liu J，et al.Current approaches for diagnosis of influenza virus infections in humans［J］.Viruses，2016，8（4）：96.

［6］Mohammad AB，Mazyar Z，Abdolvahab A.A diag?nostic one?step real?time reverse transcription poly?merase chain reaction method for accurate detection of influenza virus type A［J］.Arch Med Sci，2016，12（6）：1286?1292.

［7］Cui D，Zhao D，Xie G，et al.Simultaneous detection of influenza A subtypes of H3N2 virus，pandemic（H1N1）2009 virus and reassortant avian H7N9 virus in humans by multiplex one?step real?time RT?PCR as?say［J］.Springerplus，2016，5（1）：2054.

［8］Zadeh VR，Jagadesh A，Krishnan A，et al.Detection of D151G/N mutations in the neuraminidase gene of in?fluenza A（H3N2）viruses by real?time RT?PCR allel?ic discrimination assay［J］.J Med Virol，2017，89（7）：1174?1178.

［9］Zhang Y，Liu Q，Wang D，et al.Genotyping and de?tection of common avian and human origin?influenza viruses using a portable chemiluminescence imag?ing microarray［J］.Springerplus， 2016，5（1）：1871.

［10］Fei Y，Sun YS，Li Y，et al.Characterization of recep?tor binding profiles of influenza A viruses using an el?lipsometry ?based label?free glycan microarray assay platform［J］.Biomolecules，2015，5（3）：1480?1498.

［11］Li D，Li Z，Zhou Z，et al.Direct next?generation se?quencing of virus?human mixed samples without pre?treatment is favorable to recover virus genome［J］.Bi?ol Direct，2016，11（1）：3.

［12］Seong MW，Cho SI，Park H，et al.Genotyping influ?enza virus by next?generation deep sequencing in clini?cal specimens［J］.Ann Lab Med，2016，36（3）：255?258.

［13］Inoue E，Wang X，Osawa Y，et al.Full genomic am?plification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers［J］.Microbiol Immu?nol，2010，54（3）：129?134.

［14］Dai M，McBride R，Dortmans JC，et al.Mutation of the second sialic acid?binding site，resulting in reduced neuraminidase activity，preceded the emergence of H7N9 influenza A virus［J］.J Virol，2017，91（9）：e00049?17.

［15］Liu YF，Lai HZ，Li L，et al.Endemic variation of H9N2 avian influenza virus in China［J］.Avian Dis，2016，60（4）：817?825.