沉渣包埋法在卵巢腫瘤手術(shù)盆腔沖洗液細(xì)胞學(xué)診斷中的應(yīng)用

譚麗珊 陳玉英 余健華 陳智慧 郭慧

卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率近年來(lái)不斷上升，發(fā)病僅次于宮頸癌和子宮體癌，嚴(yán)重威脅女性的生命健康與安全［1?2］。上皮性卵巢癌約占卵巢惡性腫瘤的85%［3］。卵巢位于盆腔深部，其胚胎的發(fā)育過(guò)程及其相應(yīng)的內(nèi)分泌功能相對(duì)復(fù)雜，因此患者在卵巢癌早期常無(wú)明顯的臨床癥狀，70%患者確診時(shí)已到中晚期［4］。因此對(duì)卵巢惡性腫瘤的早期診斷和及時(shí)治療是改善患者預(yù)后的重要前提［5］。婦科卵巢腫瘤手術(shù)中常開(kāi)腹進(jìn)行盆腔沖洗，收集沖洗液并對(duì)沖洗液進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析，以協(xié)助臨床進(jìn)行診斷及腫瘤分期。關(guān)于卵巢腫瘤盆腔沖洗液細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果的可靠性，及對(duì)沖洗液細(xì)胞的診斷及鑒別診斷是病理細(xì)胞學(xué)診斷的難點(diǎn)。

在病理科的日常工作中，常進(jìn)行胸腹水的脫落細(xì)胞檢查，處理過(guò)程常采用常規(guī)涂片法。收集胸、腹水或體腔沖洗液離心后獲得絮狀凝塊沉渣，經(jīng)常規(guī)脫水石蠟包埋，稱(chēng)之為沉渣包埋法。沉渣包埋法制作石蠟細(xì)胞塊這一技術(shù)的運(yùn)用，使細(xì)胞學(xué)診斷上到了一個(gè)新臺(tái)階。所制作而成的石蠟細(xì)胞塊，可以和腫瘤大體組織塊一樣，多次進(jìn)行切片并長(zhǎng)期保存，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展以下檢測(cè)技術(shù)：蘇木精?伊紅（hematoxylin?eosin staining，HE）染色進(jìn)行細(xì)胞的良惡性區(qū)分；免疫組化抗體聯(lián)合運(yùn)用，揭示轉(zhuǎn)移性腫瘤的來(lái)源部位；運(yùn)用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)對(duì)腫瘤治療進(jìn)行綜合判斷等，解決更多臨床診斷和研究上的問(wèn)題［6］。為探索提高盆腔沖洗液腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性檢出率的方法，獲得更高的陽(yáng)性率，本研究收集我院66例卵巢癌手術(shù)術(shù)中盆腔沖洗液標(biāo)本，均行常規(guī)細(xì)胞涂片法和沉渣包埋法檢查，進(jìn)行對(duì)比分析，為卵巢腫瘤盆腔沖洗液的脫落細(xì)胞學(xué)病理診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取韶關(guān)市第一人民醫(yī)院2012年1月至2016年12月66例卵巢腫瘤病例資料，患者手術(shù)前未接受任何放化療等其他輔助治療。術(shù)后腫瘤大體組織學(xué)診斷均為上皮性卵巢癌，其中漿液性腺癌27例，透明細(xì)胞腺癌15例，子宮內(nèi)膜樣癌10例，黏液性腺癌9例，惡性Brenner瘤3例，未分化癌2例，術(shù)后組織學(xué)結(jié)果與術(shù)中盆腔沖洗液細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果相對(duì)照?；颊吣挲g為34～63歲，中位年齡為48歲。

1.2 標(biāo)本采集

術(shù)中開(kāi)腹后取100 mL生理鹽水注入盆腔中，于子宮直腸陷窩抽取盆腔沖洗液，放入干凈容器。

1.3 檢查方法

1.3.1 常規(guī)細(xì)胞涂片法制片方法

將手術(shù)盆腔沖洗液充分震蕩混勻，取50 mL液體分別裝入2支試管，以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，棄去上清液，吸取沉渣，涂片4張，經(jīng)95%乙醚酒精固定1 h，HE染色后，光鏡觀察。

1.3.2 盆腔沖洗液沉渣包埋法制片方法

取患者手術(shù)盆腔沖洗液50 mL，離心方法同前，棄去上清液后，沿試管壁緩慢加入4%中性甲醛液固定，防止沉渣再度沖散，固定時(shí)間6 h以上。沉渣固定后，將試管再次離心，棄去上清液，將沉渣吸出，用棉紙包好，常規(guī)脫水后石蠟包埋，4 μm厚度切片，HE染色，光鏡觀察。

1.4 常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片及沉渣包埋制片觀察

1.4.1 陽(yáng)性判斷

光鏡下觀察到具有惡性特征的細(xì)胞評(píng)為陽(yáng)性，惡性特征細(xì)胞具有細(xì)胞核大、深染，核形不規(guī)則，細(xì)胞大小不一，成團(tuán)脫落、排列成腺樣，異形性明顯等形態(tài)特點(diǎn)，未見(jiàn)上述惡性特征細(xì)胞評(píng)為陰性。

1.4.2 卵巢癌分類(lèi)細(xì)胞學(xué)形態(tài)觀察特點(diǎn)

漿液性腺癌可見(jiàn)體積較小的腫瘤細(xì)胞，排列成腺管狀或乳頭狀，胞漿豐富紅染，核偏位，個(gè)別細(xì)胞呈“鞋釘樣”形態(tài)，胞漿內(nèi)未見(jiàn)明確黏液空泡；透明細(xì)胞腺癌的細(xì)胞胞漿豐富，富含糖原，呈空泡或透明狀；子宮內(nèi)膜樣腺癌的腫瘤細(xì)胞亦呈乳頭或腺管狀排列，核仁較漿液性腺癌細(xì)胞及透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞的清晰可見(jiàn)，胞漿粉染，染色質(zhì)為粗顆粒；黏液性腺癌可見(jiàn)細(xì)胞胞漿充滿大量透明黏液，細(xì)胞核被擠壓至一旁，呈印戒細(xì)胞樣形態(tài)；惡性Brenner瘤可見(jiàn)典型的橢圓形或圓形腫瘤細(xì)胞，呈“鋪磚樣”排列，未見(jiàn)明確腺管結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核居中；未分化癌細(xì)胞為單一圓形形態(tài)，核膜不規(guī)則，染色質(zhì)成顆粒狀密集分布且不均勻，核仁不明顯或者較小，胞漿少。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，計(jì)量資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片法與沉渣包埋法對(duì)上皮性卵巢癌陽(yáng)性檢出率比較

沉渣包埋法聯(lián)合常規(guī)涂片法癌細(xì)胞陽(yáng)性檢出率高于單一的常規(guī)細(xì)胞涂片法或沉渣包埋法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），常規(guī)細(xì)胞涂片法和沉渣包埋法癌細(xì)胞檢出率對(duì)比無(wú)明顯差異（P＞0.05）。提示兩法聯(lián)合對(duì)盆腔沖洗液癌細(xì)胞陽(yáng)性檢出率更高，見(jiàn)表1。

表1 2種方法對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞陽(yáng)性檢出率的比較Table 1 Comparison of positive detection rate of epithelial ovarian tumor cell between 2 methods

2.2 2種診斷方式對(duì)上皮性卵巢癌分類(lèi)診斷統(tǒng)計(jì)結(jié)果

以術(shù)后腫瘤大體組織學(xué)腫瘤類(lèi)型分類(lèi)為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比2種方法在細(xì)胞學(xué)上對(duì)卵巢癌初步分類(lèi)的符合率。常規(guī)細(xì)胞涂片法腫瘤類(lèi)型診斷符合率為51.50%（34/66）；沉渣包埋法腫瘤類(lèi)型分類(lèi)診斷符合率為69.70%（46/66）。沉渣包埋法對(duì)卵巢癌分類(lèi)診斷的符合率高于常規(guī)涂片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.569，P=0.033），見(jiàn)表2。

2.3 2種診斷方式鏡下所見(jiàn)形態(tài)

常規(guī)細(xì)胞涂片法：涂片較厚，背景復(fù)雜，卵巢癌細(xì)胞成堆，重疊，分布不均，立體感強(qiáng)。癌細(xì)胞體積大小不等，個(gè)別細(xì)胞體積巨大，細(xì)胞異形明顯，核大深染，核仁明顯，染色質(zhì)不均勻，成塊狀，胞質(zhì)稀少?？梢?jiàn)單個(gè)散在癌細(xì)胞，胞質(zhì)部分有空泡，核仁明顯增大（圖1）。

表2 2種方式對(duì)卵巢癌分類(lèi)診斷符合率比較（n）Table 2 Comparison of coincidence rate of tumor classification between 2 methods（n）

圖1 常規(guī)涂片法示癌細(xì)胞Figure 1 A group of cancer cell in the smear

沉渣包埋與常規(guī)涂片相比，細(xì)胞在同一平面上，細(xì)胞相對(duì)較小，沉渣包埋切片中細(xì)胞染色清晰。可見(jiàn)形成典型的腺管樣結(jié)構(gòu)，癌細(xì)胞核大、畸形、深染，染色質(zhì)粗，部分胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)空泡及粘液，把核擠向一側(cè)呈印戒狀，三維立體感不如涂片強(qiáng)烈，細(xì)胞輪廓較常規(guī)涂片法清晰（圖2）。

圖2 沉渣包埋制片法示癌細(xì)胞Figure 2 A group of cancer cell in sedimentation method

3 討論

來(lái)源于卵巢表面上皮的卵巢癌是最常見(jiàn)的卵巢惡性腫瘤［7］，臨床診斷卵巢癌常通過(guò)血清學(xué)腫瘤指標(biāo)及影像學(xué)（B超、MRI、CT）等方法，不同的檢查方法診斷結(jié)果差異較大［8］，婦科手術(shù)探查仍然是確定腫瘤良惡性及腫瘤分類(lèi)的重要方法。近年來(lái)，將術(shù)中盆腔沖洗液脫落細(xì)胞學(xué)檢查引入婦科卵巢術(shù)中行盆腔沖洗并收集沖洗液進(jìn)行脫落細(xì)胞學(xué)檢查，使卵巢腫瘤的診斷與鑒別診斷得以快速進(jìn)行且準(zhǔn)確性提高，因此提高盆腔沖洗液脫落細(xì)胞學(xué)腫瘤細(xì)胞的診斷技術(shù)日益迫切。

卵巢手術(shù)盆腔沖洗液中細(xì)胞成分較多，除腫瘤脫落細(xì)胞外，還可見(jiàn)腹腔間皮細(xì)胞、炎細(xì)胞、紅細(xì)胞等。對(duì)盆腔沖洗液的處理，傳統(tǒng)大多采用常規(guī)涂片法，離心常規(guī)涂片后鏡下觀察，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定性和分類(lèi)。近年來(lái)，出現(xiàn)了沉渣包埋法制作成細(xì)胞塊的技術(shù)，促進(jìn)了盆腔沖洗液細(xì)胞學(xué)診斷的發(fā)展。筆者總結(jié)，兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)。常規(guī)涂片法優(yōu)點(diǎn)：快速經(jīng)濟(jì)，簡(jiǎn)單方便［9］；缺點(diǎn)：細(xì)胞過(guò)于分散或重疊，存在過(guò)多的血液背景或黏液背景，不利于鏡下觀察；腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)腫脹，核質(zhì)比失調(diào)，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的判定易出現(xiàn)誤判［10?11］。沉渣包埋法優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞集中且分布均勻，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，背景清晰，易于觀察；所制成的細(xì)胞塊可用于下一步切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)或腫瘤分子檢測(cè)。缺點(diǎn)：細(xì)胞塊包埋脫水后，組織與切片方向的不同有時(shí)會(huì)引起可觀察腫瘤細(xì)胞數(shù)量的減少。研究報(bào)道［9］，常規(guī)涂片法細(xì)胞學(xué)診斷不確定率為10.3%，沉渣包埋法聯(lián)合常規(guī)涂片法可將診斷不確定率降低。因此，筆者認(rèn)為，沉渣包埋法聯(lián)合常規(guī)涂片法，可以減少單一包埋法中的誤差，增加腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)性檢出率。唐麗艷［12］、陳廣峰等［13］曾將沉渣包埋技術(shù)應(yīng)用于漿膜腔惡性積液的診斷當(dāng)中，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉渣包埋法聯(lián)合常規(guī)涂片法可以提高癌細(xì)胞的檢出率和準(zhǔn)確性。楊紅等［14］報(bào)道，肯定了沉渣包埋法聯(lián)合常規(guī)涂片法是提高細(xì)胞學(xué)病理診斷的有效方法。筆者嘗試將沉渣包埋法應(yīng)用于卵巢癌盆腔沖洗液當(dāng)中，實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)常規(guī)涂片法及沉渣包埋法制片的陽(yáng)性率分別為56%與70%，而聯(lián)合2種方法檢測(cè)的癌細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)92%。提示與單一的常規(guī)細(xì)胞涂片法及沉渣包埋法相比，沉渣包埋法聯(lián)合常規(guī)涂片法對(duì)癌細(xì)胞陽(yáng)性檢出率更高，漏診率更低。這與文獻(xiàn)［12?14］上的相關(guān)研究結(jié)果一致。盆腔沖洗液中，常規(guī)涂片法可以觀察到細(xì)胞的整體輪廓，沉渣包埋切片后，顯示了卵巢癌團(tuán)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，腺管樣形態(tài)清晰可見(jiàn)，有形成組織結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)。2種方法結(jié)合可以彌補(bǔ)沉渣包埋切片的誤差，綜合判斷可以取得取長(zhǎng)補(bǔ)短的作用。由此推斷沉渣包埋法值得廣泛應(yīng)用于盆腔沖洗液當(dāng)中，結(jié)合常規(guī)涂片法提高癌細(xì)胞陽(yáng)性檢出率，在工作當(dāng)中聯(lián)用兩種方法檢出率更高。

研究顯示，沉渣包埋法由于能保持脫落細(xì)胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，與常規(guī)涂片（細(xì)胞分散，形態(tài)模糊）相比，對(duì)腫瘤分型準(zhǔn)確性更大［15］。本研究沉渣包埋法卵巢癌分類(lèi)符合率為69.70%，高于常規(guī)涂片法的符合率（51.50%）（P<0.05）。沉渣包埋法制片的細(xì)胞輪廓清晰，易于觀察到腫瘤細(xì)胞的排列結(jié)構(gòu)，更加利于腫瘤分型，提示沉渣包埋法在細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)上對(duì)卵巢癌初步分型的可行性。接下來(lái)我們可以用沉渣包埋法所得的細(xì)胞塊進(jìn)行切片，在此基礎(chǔ)上選擇有針對(duì)性的免疫組化抗體進(jìn)行染色，對(duì)腫瘤分類(lèi)進(jìn)行細(xì)化或?qū)ζ鋪?lái)源進(jìn)行判斷，有助于提高腫瘤細(xì)胞學(xué)的診斷水平；也可以進(jìn)行腫瘤分子檢測(cè)，為臨床靶向藥物的選擇提供依據(jù)。

準(zhǔn)確而有效的病理診斷是對(duì)腫瘤治療取得滿意療效的先決條件［16］，卵巢手術(shù)盆腔沖洗液脫落細(xì)胞學(xué)由于操作簡(jiǎn)單，可以比術(shù)后大體腫瘤組織學(xué)更為高效而迅速。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，雖然單一的沉渣包埋法使用未能使盆腔沖洗液檢出率達(dá)到最高，但同時(shí)結(jié)合沉渣包埋法和常規(guī)涂片法這兩種細(xì)胞制片法，明顯提高陽(yáng)性檢出率。術(shù)中收集盆腔沖洗液并進(jìn)行沉渣包埋法制片，有利于快速進(jìn)行卵巢癌腫瘤分型。本實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行，有利于卵巢癌患者得到及時(shí)，快速診斷，值得在病理日常工作中推廣。

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