HPLC法測(cè)定養(yǎng)陰生肌婦炎栓中龍膽苦苷的含量*

古秋莉，劉效栓，李喜香，郭 敏

1甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2甘肅中醫(yī)藥研究院

中藥復(fù)方養(yǎng)陰生肌婦炎栓以甘肅省中醫(yī)院院內(nèi)制劑(甘藥制字Z04000835)養(yǎng)陰生肌散處方為依據(jù)，通過提取工藝研究，溶媒篩選，基質(zhì)配比研究及制劑工藝考察，研制出便利、高效的用于治療宮頸炎、陰道炎等婦科疾病的養(yǎng)陰生肌婦炎栓劑［1］。

養(yǎng)陰生肌婦炎栓主要由黃柏、龍膽草、雄黃、青黛等藥物組成，龍膽草作為處方中不可缺少的組成部分，具有清熱燥濕，瀉肝膽火的功效；龍膽苦苷性質(zhì)穩(wěn)定，為龍膽草的主要成分，因此，本研究采用高效液相色譜法對(duì)養(yǎng)陰生肌婦炎栓中龍膽草的有效成分龍膽苦苷進(jìn)行含量測(cè)定［2-7］，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國Waters高效液相色譜儀(包括：Waters 2487紫外檢測(cè)器，Waters 1525自動(dòng)進(jìn)樣器)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；電子分析天平(上海天平儀器廠)；超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)。

1.2 試藥 養(yǎng)陰生肌婦炎栓(甘肅省中醫(yī)院中藥研究所制備)；龍膽苦苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：11070-200510)；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水；其他試劑均為分析醇，實(shí)驗(yàn)所用藥材由甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS(150×4.6 mmI.D.)；流動(dòng)相：水 - 乙腈(80∶20)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25.0℃；外標(biāo)法。理論塔板數(shù)按龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算不得低于3 500。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 取在五氧化二磷減壓干燥器中放置24小時(shí)的龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇配制成濃度為0.8 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 取養(yǎng)陰生肌婦炎栓適量，加熱溶解，精密稱取約600 mg置50 mL燒杯中，加甲醇適量，超聲10分鐘，放冷至室溫，過濾到25 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。取8 mL移至25 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液備用。

2.2 結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系考察 精密稱得龍膽苦苷對(duì)照品4.1 mg，配制濃度為0.41 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.5、1.0、1.5、2.0、

2.5 mL置10 mL的容量瓶，用甲醇定容至刻度，依次進(jìn)樣10 μL，每組平行進(jìn)3針，以峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸。得回歸方程為：Y=12 519X+238 59，r=0.999 8，線性范圍為 20.0～110.0 μg/mL。表明在此濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一濃度龍膽苦苷對(duì)照品溶液(82 μg/mL)，重復(fù)進(jìn)樣7次，每次進(jìn)樣量 10 μL，以“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以龍膽苦苷峰面積計(jì)算，RSD為2.17%(n=7)。結(jié)果表明，精密度較好。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液及樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件操作，記錄色譜圖。結(jié)果供試品與對(duì)照品溶液均在相同保留時(shí)間出現(xiàn)吸收峰，陰性溶液無此峰，同時(shí)本試驗(yàn)條件下龍膽苦苷與其他組分分離完全。結(jié)果見圖1。

圖1 龍膽苦苷含量測(cè)定的HPLC色譜圖

2.2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同批養(yǎng)陰生肌婦炎栓，加熱溶解、混勻，取6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，記錄色譜圖，其RSD為0.98%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.5 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，取已知龍膽苦苷含量的同批養(yǎng)陰生肌婦炎栓，加熱溶解、混勻，精密稱取約600 mg，分別加入1、2、4 mL濃度為0.41 mg/mL的龍膽苦苷對(duì)照品溶液，各制備3份樣品。按“2.1.3”項(xiàng)下相應(yīng)方法制備供試品溶液，以“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示平均回收率為98.10%，RSD為0.41%，見表1。

表1 養(yǎng)陰生肌婦炎栓中龍膽苦苷的回收率測(cè)定(n=3)

2.2.6 樣品含量測(cè)定 取10批養(yǎng)陰生肌婦炎栓，加熱溶解，混勻，取適量，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，測(cè)定10批樣品中龍膽苦苷的平均含量為1.62mg/g，RSD=2.57%，見表2。到處方中另外一味藥的有效成分，而且兩成分呈基線分離。因此，選取254 nm作為檢測(cè)波長具有實(shí)際意義。3.2 流動(dòng)相的選擇 以龍膽苦苷為檢測(cè)對(duì)象，通過調(diào)整流動(dòng)相中乙腈與水的比例，以峰是否存在明顯的拖尾、峰高，分離度和理論塔板數(shù)是否理想，基線是否平穩(wěn)等作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，最終選取乙腈∶水(20∶80)為流動(dòng)相。對(duì)于混合樣品不能達(dá)到基線分離時(shí)，采用程序-時(shí)間處理方法，對(duì)基線進(jìn)行回歸。

表2 養(yǎng)陰生肌婦炎栓中龍膽苦苷的含量測(cè)定(n=3)

3 討論

本研究測(cè)定的養(yǎng)陰生肌婦炎栓中龍膽苦苷的含量(1.62mg/g)，與《中華人民共和國藥典》(2015年版一部)龍膽藥材“含量測(cè)定”項(xiàng)下龍膽苦苷的含量(不得少于3.0%，即30.00 mg/g)相比，轉(zhuǎn)移率較高，證明栓劑的制備過程中藥材提取比較完全。

3.1 檢測(cè)波長的選取 龍膽苦苷的最大吸收波長在274 nm處，當(dāng)采用274 nm為檢測(cè)波長時(shí)，檢測(cè)靈敏度較高，但相應(yīng)雜峰增多，基線不平穩(wěn)，分離度較差；采用254 nm為檢測(cè)波長時(shí)，基線平穩(wěn)，分離度好。此外在254 nm處同一流動(dòng)相下還可檢測(cè)

［1］李喜香，劉效栓，張小華，等.養(yǎng)陰生肌散急性毒性及全身過敏性實(shí)驗(yàn)研究［J］.西部中醫(yī)藥，2014，27(1)：29-31.

［2］陳長勛，劉占文，孫崢嶸，等.龍膽苦苷抗炎藥理作用研究［J］.中草藥，2003，34(9)：814-816.

［3］王北嬰，李儀奎.中藥新藥研制開發(fā)技術(shù)與方法［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2001：788-808.

［4］趙瑞芝，梁偉杰，丘小惠.龍膽藥材中龍膽苦苷的提取工藝研究［J］.中國藥房，2005，16(12)：956-957.

［5］趙冰璐，姜連閣，劉亞芹.薄層掃描法測(cè)定龍膽中龍膽苦苷的含量［J］.中醫(yī)藥信息，2000，17(3)：69.

［6］陳二林，黃艷輝，劉效栓，等.養(yǎng)陰生肌散中龍膽苦苷的HPLC測(cè)定［J］.西部中醫(yī)藥，2013，26(10)：24-26.

［7］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：96.

［8］趙昱瑋，于淼，司學(xué)玲，等.炎熱清片中龍膽苦苷的薄層鑒別及含量測(cè)定［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(3)：118-120.