深圳地區(qū)孕婦定植型B群鏈球菌流行病學(xué)特征

聶署萍，成子賢，王 瓊，范菲楠，蕭曉友，陸學(xué)東

(中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院，深圳 518033)

B群鏈球菌(group Bstreptococcus, GBS)是一種定植在人類下消化道及泌尿生殖道的細(xì)菌，健康人群帶菌率為15%～35% ，也是導(dǎo)致圍產(chǎn)期母親及新生兒嚴(yán)重感染的重要致病菌之一[1-2]。在圍產(chǎn)期，孕婦陰道定植的GBS可以通過產(chǎn)道上行擴(kuò)散感染子宮和胎膜，引起胎膜早破、早產(chǎn)、產(chǎn)褥感染、產(chǎn)后出血等多種產(chǎn)科并發(fā)癥。在分娩期，細(xì)菌可由陰道逆行至羊水，胎兒在產(chǎn)程中吞咽或吸入GBS 感染的羊水，導(dǎo)致新生兒肺炎、敗血癥和腦膜炎等嚴(yán)重侵襲型感染，病死率高達(dá)50%[3]。GBS編碼很多毒力因子，包括莢膜多糖、表面α-樣蛋白(α-like protein，Alp)和菌毛等，不僅在GBS的致病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，還是疫苗研發(fā)的重要靶點(diǎn)[4-6]。青霉素是目前臨床預(yù)防和治療GBS感染的一線藥物，然而對(duì)青霉素敏感性降低的菌株已有報(bào)道[7]?？肆置顾睾图t霉素推薦用于治療青霉素過敏人群的GBS感染，但由于其耐藥水平的不斷上升，能否繼續(xù)作為抗GBS感染二線藥物受到廣泛質(zhì)疑[8-11]。國(guó)內(nèi)有關(guān)孕婦定植GBS流行情況的研究少見[2,12-13]。監(jiān)測(cè)本地區(qū)孕婦定植GBS的血清型、毒力因子分布和耐藥現(xiàn)狀對(duì)圍產(chǎn)期孕婦和新生兒GBS感染的預(yù)防、控制及疫苗的研發(fā)極其重要，現(xiàn)將檢測(cè)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2015年10月—2016年9月中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院(深圳福田)、深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院和光明新區(qū)人民醫(yī)院3所醫(yī)院送檢的孕婦GBS產(chǎn)前篩查陽(yáng)性菌株56株。

1.2 菌種培養(yǎng)及鑒定 GBS采用哥倫比亞瓊脂平板35°C在5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)18～24 h。菌種鑒定采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀結(jié)合CAMP試驗(yàn)進(jìn)行。

1.3 GBS莢膜血清學(xué)分型 參考文獻(xiàn)[14]，用多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法(QIAGEN公司)檢測(cè)GBS莢膜血清型。菌株DNA抽提采用北京全式金細(xì)菌基因組抽提試劑盒，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠120 V電泳120 min 后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.4 GBS毒力因子檢測(cè) GBS菌體表面蛋白和菌毛蛋白檢測(cè)：參考文獻(xiàn)[15-16]，用多重PCR法檢測(cè)GBSAlp基因(bca、eps、rib、alp2/3及alp4)和菌毛基因PI-I、PI-2a及PI-2b。直接根據(jù)PCR擴(kuò)增片斷大小判斷目的基因存在與否。

1.5 GBS藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè) 嚴(yán)格按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2015年標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥敏紙片購(gòu)自法國(guó)Oxide公司：青霉素G、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氯霉素以及左氧氟沙星。藥敏培養(yǎng)基為含5%綿羊血Mueller-Hinton瓊脂(購(gòu)于安圖生物)。采用雙紙片擴(kuò)散法(D試驗(yàn))檢測(cè)GBS對(duì)紅霉素及克林霉素耐藥表型，包括：對(duì)大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺-鏈陽(yáng)菌素B結(jié)構(gòu)性耐藥(constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance，cMLSB)，即紅霉素和克林霉素均耐藥；誘導(dǎo)性耐藥(inducible MLSB resistance，iMLSB) 即紅霉素耐藥，靠近紅霉素紙片一側(cè)的克林霉素抑菌環(huán)出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象，即D試驗(yàn)陽(yáng)性；大環(huán)內(nèi)脂類耐藥型(macrolide resistance phenotype, M) 即紅霉素耐藥，克林霉素敏感，靠近紅霉素紙片的一側(cè)克林霉素抑菌環(huán)未出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象，即D試驗(yàn)陰性[17]。GBS紅霉素和四環(huán)素耐藥基因檢測(cè)：參考文獻(xiàn)[18]，用多重PCR法檢測(cè)紅霉素耐藥基因ermA、ermB、mefA/E，以及四環(huán)素耐藥基因tetM、tetO、tetK及tetL，根據(jù)擴(kuò)增片斷大小判斷耐藥基因有無。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用Fisher精確檢驗(yàn)比較毒力因子和耐藥基因在不同莢膜血清型中的分布差異，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBS的血清分型與毒力因子分布 56株無乳鏈球菌共檢測(cè)出5種血清型，包括Ia、Ib、II、Ⅲ和V。其中Ia型6株(10.7%)，Ib型8株(14.3%)，II型2株(3.6%)，Ⅲ型34株(60.7%)，V型6株(10.7%)。部分菌株莢膜血清分型多重PCR電泳圖見圖1。除3株細(xì)菌外，其余53株細(xì)菌檢出alp基因，其中以rib為主，占46.4%，eps、alp2/3 及bca檢出率分別為25.0%、8.9%和14.3%，未檢出alp4基因。所有菌株均檢出至少一種菌毛基因，基因型以PI-2a+PI-1和PI-2b型為主，分別占37.5%、41.07%。表面蛋白基因和菌毛基因在各血清型中的分布見表1。部分血清型與特異表面蛋白及菌毛基因有明顯相關(guān)性，如血清型Ia與eps、Ib與bca、III與rib、V與alp2/3，血清型Ib與PI-2a、III與PI-2b及V與PI-2a+PI-1(均P<0.05)。

M:DNA marker；-：陰性對(duì)照；其余為不同血清型的GBS

Figure1Multiplex PCR electrophoresis map of partial GBS strains with different capsule serotyps

2.2 藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 56株GBS對(duì)青霉素全部敏感，對(duì)氯霉素、左氧氟沙星、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素有不同程度的耐藥，耐藥率分別為14.3%、23.2%、75.0%、67.9%及85.7%。42株紅霉素耐藥的GBS中包括36株cMLSB，4株M型及2株iMLSB表型。紅霉素耐藥菌株中耐藥基因ermB的檢出率最高，約88.1%，單獨(dú)存在或與mefA/E共存，未檢出ermA。V型血清型中有1株紅霉素誘導(dǎo)性耐藥菌株耐藥基因檢測(cè)均為陰性，可能存在其他耐藥機(jī)制。48株四環(huán)素耐藥菌株中tetM ，tetO及tetL檢出率分別為87.5%、64.6%及6.25%。不同血清型GBS分布見表2。部分耐藥基因與血清型有明顯相關(guān)性，如血清型Ib與ermB、III與tetM+tetO(均P<0.05)。

表1 56株不同血清型GBS表面蛋白及菌毛蛋白基因分布(株)

表256株不同血清型GBS紅霉素和四環(huán)素耐藥的表型、基因型分布

Table2Distribution of erythromycin and tetracycline resistance phenotypes and genotypes of 56 GBS strains with different serotypes

血清型菌株數(shù)紅霉素耐藥菌株數(shù)表型(菌株數(shù))基因型(菌株數(shù))四環(huán)素耐藥菌株數(shù)基因型(菌株數(shù))Ⅰa63M(2)、cMLSB(1)mefA/E(2)、ermB(1)6tetM(4)、tetM+tetO(2)Ⅰb87iMLSB(1)、cMLSB(6)mefA/E+ermB(1)、ermB(6)6tetM(2)、tetO(2)、tetM+tetO(2)Ⅱ21cMLSB(1)mefA/E+ermB(1)1tetM(1)Ⅲ3425M(2)、cMLSB(23)mefA/E(2)、mefA/E+ermB(12)、ermB(11)30tetM(2)、tetO(4)、tetM+tetO(21)、tetM+tetL(3)Ⅴ66iMLSB(1)、cMLSB(5)mefA/E+ermB(2)、ermB(3)5tetM(5)

3 討論

GBS是定植在健康女性陰道中的正常菌群之一，我國(guó)孕婦的帶菌率約為5%～15%[12-13]。GBS可以通過產(chǎn)道上行擴(kuò)散感染子宮和胎膜，使孕婦發(fā)生晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎膜早破，還可引起絨毛羊膜炎、產(chǎn)褥感染等。分娩期帶菌孕婦則易在生產(chǎn)過程中將GBS 傳染給新生兒，引起新生兒肺炎、腦膜炎和敗血癥等嚴(yán)重侵襲性感染[1-3]。二十世紀(jì)90年代初發(fā)達(dá)國(guó)家推行的GBS產(chǎn)前篩查及分娩期預(yù)防性使用抗菌藥物，有效減低了圍產(chǎn)期孕婦和新生兒GBS感染的發(fā)病率和病死率，但由于各種原因這些措施在我國(guó)還未廣泛推廣[1,19-21]。

GBS編碼很多與致病力相關(guān)的毒力因子，其中莢膜多糖能幫助細(xì)菌產(chǎn)生免疫逃逸，促進(jìn)細(xì)菌的定植或侵襲，已成為疫苗研究的主要靶點(diǎn)。根據(jù)莢膜多糖抗原特異性的不同，GBS被分為10個(gè)血清型，包括Ia、Ib及II-IX，其中與新生兒侵襲性感染相關(guān)的血清型主要為Ia、II、III及V型[1,4]。孕婦定植GBS的血清型在不同國(guó)家和地區(qū)分布不同，如美國(guó)及部分歐洲國(guó)家主要為Ia、II、III及V型，VI-IX罕見，而馬來西亞主要為VI、VII及III型，非洲加蓬81%的孕婦定植GBS血清型為V、III及Ib[22-24]。本地區(qū)的研究結(jié)果與我國(guó)北京地區(qū)相似，以III、Ia、V及 Ib等血清型為主[13]。目前，正在研發(fā)的覆蓋5種血清型(Ia、Ib、II、III及V)的莢膜結(jié)合疫苗，如果將來在本地區(qū)投入使用能很好的預(yù)防新生兒GBS感染[4]。

此外，GBS Alp和菌毛也是重要的毒力因子及疫苗靶點(diǎn)。Alp由5個(gè)不同等位基因alpha-C、epsilon、alp2/3、rib及alp4編碼，能介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)宮頸上皮細(xì)胞的侵襲。除3株細(xì)菌外，本研究中其余53株GBS均檢出一種alp基因，以rib為主，約46.4%，eps、alp2/3及bca的檢出率分別為25.0%、8.9%和14.3%，未檢出alp4。本研究還發(fā)現(xiàn)GBS的alp基因與特定的血清型有明顯相關(guān)性，如血清型Ia與esp、Ib與bca、III與rib、V型與alp2/3等，而馬來西亞Eskandarian等[23]報(bào)道rib與Ia、VI、II及III型相關(guān)。北京地區(qū)報(bào)道V型與alp2/3、III與rib、Ia與eps及Ib型與alp2/3有明顯相關(guān)性[13]。菌毛樣結(jié)構(gòu)參與細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和定植，根據(jù)編碼菌毛的等位基因的不同，被分為三型：PI-1、PI-2a及PI-2b，每株細(xì)菌至少含有其中一型[6.16]。本研究中所有菌株均檢出至少一型菌毛，菌毛基因型以PI-2a+PI-1和PI-2b型為主，分別占37.5%和41.07%；菌毛類型與特異血清型分布也有明顯相關(guān)性，如血清型Ib與PI-2a、III型與PI-2b、V型與PI-2a+PI-1，而Eskandarian等[23]報(bào)道血清型III與PI+PI-2a、Ia型與PI-2a有明顯相關(guān)性，表明不同地區(qū)Alp和菌毛的分布有明顯差異。因此，了解本地區(qū)孕婦定植GBS毒力因子分布及流行情況對(duì)有效預(yù)防圍產(chǎn)期孕婦和新生兒的侵襲性疾病有重要意義。

青霉素是目前臨床預(yù)防和治療GBS感染的一線藥物，然而對(duì)青霉素敏感性降低的菌株已有報(bào)道[7]?？肆置顾睾图t霉素推薦用于治療青霉素過敏人群的GBS感染，但由于其耐藥水平的不斷上升，克林霉素和紅霉素能否繼續(xù)作為抗GBS感染二線藥物受到廣泛質(zhì)疑[8-9]。GBS對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的主要機(jī)制是由erm基因介導(dǎo)的核糖體靶位點(diǎn)甲基化修飾，從而引起的細(xì)菌MLSB交叉耐藥。此外，GBS對(duì)紅霉素的耐藥機(jī)制還包括mefA/E基因介導(dǎo)的外排作用，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)14、15元大環(huán)內(nèi)酯耐藥(M型)。細(xì)菌對(duì)四環(huán)素的耐藥機(jī)制通常由tetM或tetO基因介導(dǎo)，且與大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因位于同一可移動(dòng)元件上[17-18]。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有細(xì)菌對(duì)青霉素皆敏感，表明青霉素仍可作為治療和預(yù)防GBS感染的一線藥物。與其他報(bào)道[23-24]相似，本地區(qū)GBS對(duì)四環(huán)素有很高的耐藥率(85.7%)，耐藥基因主要為tetM 、tetO。但本地區(qū)GBS對(duì)紅霉素和克林霉素的耐藥率高于其他地區(qū)(馬來西亞紅霉素耐藥率為23.3 %，克林霉素為17.5%)[23]。因此，建議對(duì)青霉素過敏的孕婦選用紅霉素或克林霉素進(jìn)行抗GBS治療之前，應(yīng)先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)再合理選擇抗菌藥物。42株紅霉素耐藥的GBS中包括36株cMLSB、4株M型及2株iMLSB表型。紅霉素耐藥菌株中耐藥基因ermB的檢出率最高，約88.1%，單獨(dú)存在或與mefA/E共存，未檢出ermA。部分血清型與特異耐藥基因有明顯相關(guān)性，如血清型Ib與ermB、III型與tetM+tetO。

綜上所述，本研究通過了解本地區(qū)孕婦定植的GBS莢膜血清型及主要毒力因子分布，監(jiān)測(cè)GBS對(duì)不同抗菌藥物的耐藥情況并研究其相關(guān)的耐藥機(jī)制，為GBS疫苗的研發(fā)，感染性疾病的預(yù)防控制及治療提供理論基礎(chǔ)。但本研究范圍小，樣本數(shù)不足，一定程度上影響GBS流行病學(xué)研究結(jié)果的完整性。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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