ε-聚賴氨酸復(fù)配防腐劑在醬腌菜中的應(yīng)用

宋 萌，付 強，時藝翡，程雅文，鄭佐興，譚之磊*，賈士儒*

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

醬腌菜是深受我國人民喜愛的一種佐餐小菜，具有悠久的歷史，因其美味、脆爽而受到廣大消費者的青睞[1]。美中不足的是醬腌菜中的食鹽含量較高，如果長期食用含鹽量高的食品會對身體造成負面影響[2]。如今，飲食健康和食品安全引起了人們的重視，全世界都在提倡低鹽飲食[3-4]。利用鹽漬方法來延長保質(zhì)期已經(jīng)不再符合人們的飲食觀念，因此引發(fā)醬腌菜的防腐保鮮問題[5-6]。近幾年在各地的醬腌菜抽查報告中，不合格樣品屢屢被檢出，為了防止微生物超標(biāo)而超劑量使用防腐劑是其主要原因[7]。因此，在保證低鹽醬腌菜品質(zhì)的同時，如何安全、規(guī)范地使用防腐劑來延長其保質(zhì)期成為了醬腌菜行業(yè)中亟待解決的問題[8-9]。目前，生物防腐劑如ε-聚賴氨酸（ε-ploy-L-lysine，ε-PL）、乳酸鏈球菌素（Nisin）、納他霉素等已經(jīng)成為國內(nèi)外食品安全領(lǐng)域的研究熱點[10]。ε-PL是一種具陽離子賴氨酸同聚物，并且具有抑菌譜廣、抑菌pH值范圍寬、水溶性好、安全性和熱穩(wěn)定性高[11-12]等特點，可作為食品防腐劑廣泛使用[13-14]。Nisin是一種天然抗菌肽，是目前研究最廣泛的細菌素[15]，可有效地抑制革蘭氏陽性細菌以及產(chǎn)芽孢的枯草芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌的生長[16-17]。納他霉素是一種多烯烴大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌劑，對霉菌、酵母菌、某些原生動物和某些藻類有抑制作用，但是它沒有抗細菌活性[18]，可以和Nisin抑菌譜互補，在奶酪、臘腸和飼料等食品中的應(yīng)用廣泛[19]，是為數(shù)不多的被美國食品藥品監(jiān)督管理局推薦的生物防腐劑；茶多酚是茶葉中酚類物質(zhì)和其衍生物的總稱，具有良好的抗氧化、抗衰老、抗癌變、抗輻射、防腐保鮮、抑菌除臭等功能[20]，往往用于食品的保鮮、保色劑，抑菌除臭劑等[21-23]。目前，茶多酚在食品貯藏保鮮中往往和其他添加劑復(fù)配使用，以延長食品貨架期[24-25]。

本研究以ε-PL、Nisin、納他霉素和茶多酚進行復(fù)配，利用響應(yīng)面法優(yōu)化防腐劑配比，旨在有效延長醬腌菜的存儲時間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

供試菌株由市售醬腌菜中篩選出的腐敗細菌、腐敗酵母菌（經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定分別為Bacillus subtilis、B. thuringiensis、Candida parapsilosis、Fusarium oxysporum、Trichosporon montevideense）。

1.1.2 試劑

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽、Nisin、納他霉素 浙江新銀象生物工程有限公司；茶多酚 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7.4±0.1，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min；固體培養(yǎng)基加20.0 g/L瓊脂。YPD培養(yǎng)基：酵母膏10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，pH 6.0±0.1，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min；固體培養(yǎng)基加20.0 g/L 瓊脂。PCA培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g/L，酵母浸膏2.5 g/L，葡萄糖1.0 g/L，瓊脂15 g/L。pH 7.0±0.1，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min。煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯：蛋白胨10.0 g/L，乳糖10.0 g/L，牛膽粉溶液200 mL，0.1 g/100 mL煌綠溶液13.3 mL，pH 7.2±0.1，121 ℃、0.1 MPa滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

卡盒式SpectraMax Paradigm多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器上海有限公司；Uvmini-1240型紫外分光光度計蘇州島津儀器有限公司；CRH-250-S型恒溫培養(yǎng)箱廣東省醫(yī)療器械廠；FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將從醬腌菜中分離出的腐敗細菌挑取一環(huán)至無菌LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600nm0.2～0.5備用；挑取一環(huán)腐敗酵母菌，接種至無菌YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600nm0.3～0.4備用。

1.3.2 混合微生物的制備

為模擬食品中的微生物環(huán)境，將分離出的腐敗微生物混合制成混合腐敗微生物。方法如下：將每種細菌分別接種到5 mL無菌LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h；腐敗酵母菌接種到5mL無菌YPD培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h后，每管取1 mL菌懸液9 000×g離心10 min，再用無菌生理鹽水（9 g/L）洗滌沉淀，然后用0.5 mL的無菌生理鹽水重懸浮沉淀，分別得到107CFU/mL的腐敗細菌和腐敗酵母菌[26]。將細菌和酵母菌的重懸液分別等比例混合，得到腐敗細菌和腐敗酵母菌混合微生物樣品備用。

1.3.3 單一防腐劑抑菌效果實驗

不同質(zhì)量濃度的單一防腐劑制備：參照GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中食品添加劑最大允許使用范圍，分別制備含不同質(zhì)量濃度的ε-PL（0、15、30、60、100、150、250、500 μg/mL）、Nisin（0、15、30、60、100、150、250、500 μg/mL）、茶多酚（0、15、30、60、150、300、400、500 μg/mL）、山梨酸鉀（0、50、100、200、400、500、1 000、2 000 μg/mL）、苯甲酸鈉（0、50、100、200、400、500、1 000、2 000 μg/mL）的LB培養(yǎng)基，以及含有不同質(zhì)量濃度納他霉素（0、10、25、40、50、60、80、100 μg/mL）、山梨酸鉀（0、50、100、200、400、500、1 000、2 000 μg/mL）、苯甲酸鈉（0、50、100、200、400、500、1 000、2 000 μg/mL）的YPD培養(yǎng)基。向每組培養(yǎng)基中接入腐敗微生物后，細菌在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h，酵母菌在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24h后，分別測定OD600nm。每組實驗3 次平行，并設(shè)置未添加防腐劑的空白對照組。

1.3.4 防腐劑協(xié)同抑菌效果評價

采用棋盤式微量液體稀釋法（棋盤法）[27]測試同時使用兩種防腐劑（ε-PL＋Nisin；ε-PL＋茶多酚，Nisin＋茶多酚）時對腐敗菌的抑制效果。其原理是根據(jù)分數(shù)抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）判斷兩種物質(zhì)是否存在協(xié)同作用。具體評價標(biāo)準(zhǔn)為：FICI≤0.5，表示協(xié)同作用；0.5＜FICI≤1，表示相加作用；1＜FICI≤2，表示無關(guān)作用；FICI≥2，表示拮抗作用。FICI的計算公式如下：

式中：OIC為同時使用兩種防腐劑時，有抑制效果的實驗組中最小的防腐劑濃度；MIC為防腐劑最小抑菌濃度。

1.3.5 ε-PL復(fù)配防腐劑的響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單一防腐劑的抑菌效果實驗結(jié)果，設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面，根據(jù)其水平設(shè)計，采用不同ε-PL（A）、Nisin（B）、納他霉素（C）與茶多酚（D）用量，如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used in Box-Behnken design

根據(jù)Design-Expert 8.0.6 trial軟件進行Box-Behnken設(shè)計得到29 組試驗，其中每組試驗設(shè)3 組平行，以菌落總數(shù)為響應(yīng)值（Y），試驗結(jié)果經(jīng)Design-Expert 8.0.6 trial軟件分析得到響應(yīng)值與4因素的回歸方程，Y極值即為預(yù)期菌落總數(shù)值，所對應(yīng)的4因素取值即為復(fù)配防腐劑中各組分最佳配比。

1.3.6 醬腌菜的制作工藝

干制蘿卜浸泡時，蘿卜要完全浸沒水中（蘿卜-水質(zhì)量比1∶10）；調(diào)味料與復(fù)水蘿卜之間比例（質(zhì)量分數(shù)）：白糖1%、食鹽4%、雞精0.3%、辣椒油6%～8%。同時設(shè)置未添加復(fù)配防腐劑的空白對照組，并按照GB 2760—2014最大允許使用量同時添加山梨酸鉀和苯甲酸鈉的化學(xué)防腐劑對照組。

1.3.7 保質(zhì)期的確定

按照1.3.6節(jié)的方法將制作好的醬腌菜樣品用無菌包裝袋進行分裝，扎緊袋口，每份樣品25 g，置于37 ℃培養(yǎng)箱進行加速實驗。每隔3 d對醬腌菜樣品進行取樣，檢測微生物菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、總酸含量以及氨基酸態(tài)氮含量，最后進行感官評價。取樣時若發(fā)現(xiàn)樣品出現(xiàn)褐變，發(fā)霉或者有異味則說明樣品已經(jīng)變質(zhì)。

1.3.8 指標(biāo)檢測

細菌總數(shù)檢測：參照GB 4789—2010《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[28]方法；大腸菌群數(shù)量檢測：參照GB 4789.3—2010《食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》[29]方法；總酸含量檢測：參照譚權(quán)涪[30]方法；氨基酸態(tài)氮含量檢測：按GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生的標(biāo)準(zhǔn)分析方法》[31]中4.2節(jié)方法進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一防防腐劑抑菌效果

圖1 各防腐劑對腐敗細菌的抑菌效果Fig. 1 Inhibitory effects of preservatives on bacteria

從圖1可以看出，生物防腐劑比化學(xué)防腐劑抑菌效果顯著。苯甲酸鈉和山梨酸鉀是醬腌菜中使用最多的防腐劑，隨著化學(xué)防腐劑質(zhì)量濃度的上升，腐敗菌的生長雖然受到了一定的影響，但是并不能被完全抑制。而單獨添加生物防腐劑ε-PL、Nisin 60 μg/mL時可以完全抑制腐敗細菌B. subtilis和B. thurinqiensis生長，提高用量至100 μg/mL可以完全抑制混合腐敗菌的生長；添加茶多酚30 μg/mL和60 μg/mL時可以分別抑制B. subtilis和B. thurinqiensis生長，提高用量至400 μg/mL時，可以完全抑制混合腐敗菌。因此選擇生物防腐劑不僅安全、高效，而且用量少、更經(jīng)濟。

圖2 納他霉素對腐敗酵母菌的抑菌效果Fig. 2 Inhibitory effect of natamycin on spoilage yeasts

納他霉素是一種低劑量、安全性高的食品防腐劑，可以廣泛抑制霉菌和酵母菌的生長，從圖2可以看出，在使用納他霉素進行抑菌實驗時，隨著納他霉素質(zhì)量濃度的增加，腐敗酵母菌OD600nm出現(xiàn)了明顯的下降趨勢，10 μg/mL的納他霉素可以抑制F. oxysporum的生長，納他霉素用量為400 μg/mL時，所有腐敗酵母菌OD600nm幾乎接近于0，對腐敗酵母菌的抑制效果最佳。

2.2 防腐劑協(xié)同抑菌效果評價

由于醬腌菜的腐敗主要是由細菌引起，因此考察除納他霉素外，其他3 種防腐劑共同使用時的抑菌效果。將防腐劑兩兩組合進行抑菌實驗，對其協(xié)同抑菌效果進行評價，結(jié)果見表2。

表2 OIC測定結(jié)果Table 2 Determination of OIC

表3 FICI指數(shù)測定結(jié)果Table 3 FICI values of preservative combinations

根據(jù)防腐劑對兩種腐敗細菌的FICI指數(shù)測定結(jié)果（表3）可以看出，ε-PL和Nisin同時使用時，0.5＜FICI≤1，兩種防腐劑存在相加作用，ε-PL和茶多酚同時使用以及Nisin和茶多酚同時使用時，F(xiàn)ICI≤0.5，表明茶多酚和ε-PL或者Nisin同時使用時會有協(xié)同增效的結(jié)果。因此3 種防腐劑之間存在協(xié)同作用，同時使用會增強抑菌效果，減少用量，降低成本。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)配防腐劑各成分配比

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果Table 4 Box-Behnken design with response variable

響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表4。利用Design-Expert 8.0.6 trial軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，其回歸方程模型如下所示：

Y=7 252.687 50－12.737 50A＋36.927 08B－48.775 00C－31.683 33D＋0.000 625AB－0.125 00AC＋0.015 000AD－0.368 75BC－0.015 500BD－0.054 000CD＋0.036 354A2－0.155 21B2＋1.399 17C2＋0.040 817D2

再進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程模型的方差分析與回歸方程系數(shù)估計值，如表5所示。此響應(yīng)面模型為極顯著，失擬項不顯著，可見回歸方程可靠，可進一步分析。

表5 回歸方程的方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model

2.3.2 復(fù)配防腐劑各組分配比的確定

根據(jù)Box-Behnken試驗所得的結(jié)果與回歸方程，利用Design-Expert 8.0.6 trial軟件分析當(dāng)復(fù)配防腐劑中各組分配比為ε-PL 0.06 μg/mL、Nisin 0.06 μg/mL、納他霉素0.035 μg/mL和茶多酚0.40 μg/mL時，菌落總數(shù)達到理論最小值1.43×105CFU/100 g，醬腌菜制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定菌落總數(shù)小于1～3×106CFU/100 g，可見該預(yù)期值有效，符合國標(biāo)水平。

2.3.3 復(fù)配防腐劑驗證結(jié)果

為驗證響應(yīng)面設(shè)計配方的可行性，將制作好的醬腌菜進行分裝后，置于室溫條件下，每隔3 d取樣，檢測貯存21 d后的樣品感官質(zhì)量、微生物菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、總酸、氨基酸態(tài)氮含量的變化。

圖3 醬腌菜經(jīng)過不同處理方法后保存21 d的表觀結(jié)構(gòu)Fig. 3 Visual appearance of pickles with different treatments after being stored for 21 days

由圖3可知，醬腌菜放置21 d后空白對照、化學(xué)防腐劑、工藝1三組蘿卜顏色變暗、褐變現(xiàn)象明顯，質(zhì)地軟爛已變質(zhì)，無鮮香氣味，異味明顯，而工藝2實驗組的醬腌菜具有蘿卜固有的微黃色，無發(fā)暗變色現(xiàn)象，無褐變具有咸菜的鮮香氣，無異味，與存放前無差異，味美，質(zhì)地脆嫩，有效延長了其保質(zhì)期。

表6 醬腌菜在貯存過程中菌落總數(shù)的變化Table 6 Changes in total colony count of pickled radish during storage CFU/g

表7 醬腌菜在貯存過程中大腸菌群數(shù)的變化Table 7 Changes in coliform count of pickled radish during storage CFU/g

由表6、7可知，未添加防腐劑的空白對照組在存放6 d后已經(jīng)變質(zhì)，按照國標(biāo)范圍內(nèi)最大量添加化學(xué)防腐劑和復(fù)水時添加復(fù)配防腐劑的實驗組在存放9 d后變質(zhì)，只有在拌料時添加復(fù)配防腐劑的實驗組（工藝2）菌落總數(shù)和大腸桿菌群數(shù)量符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2714—2015《醬腌菜》規(guī)定，有效抑制了微生物的增殖。

圖4 醬腌菜在貯存過程中總酸含量的變化Fig. 4 Changes in total acid content of pickled radish during storage

從圖4可以看出，所有實驗組的醬腌菜總酸含量都隨著存放時間延長逐漸增加，由于空白對照組未添加任何防腐劑，其總酸含量增加最快。添加化學(xué)防腐劑和蘿卜復(fù)水時添加防腐劑的實驗組（工藝1）總酸相比存放前分別增加了58%和55%，增幅較大。醬腌菜中總酸含量增加主要是因為乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，此外，還可能還有一些酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生了丁酸等一些酸性物質(zhì)，使醬腌菜pH值降低。從圖4可以看出，拌料時添加復(fù)配防腐劑可以有效減緩產(chǎn)品中總酸含量的增加，保證醬腌菜的口感。

從圖5可以看出，氨基酸態(tài)氮（以氮計）隨著醬腌菜存放時間的延長總體呈現(xiàn)下降的趨勢。其中只有在拌料時加復(fù)配防腐劑的實驗組（工藝2）氨基酸態(tài)氮含量下降緩慢，其他3 組在存放過程中氨基酸態(tài)氮含量下降明顯。氨基酸態(tài)氮是由醬腌菜中微生物發(fā)酵消耗醬腌菜本身蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的，為微生物的生長代謝提供能量，微生物過度繁殖會導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮含量降低，破壞醬腌菜的營養(yǎng)價值，生成的代謝副產(chǎn)物也會影響醬腌菜的風(fēng)味，由圖5可知，拌料時添加復(fù)配防腐劑可以有效抑制氨基酸態(tài)氮消耗，保證醬腌菜品質(zhì)。

3 結(jié) 論

和醬腌菜中常用的化學(xué)防腐劑山梨酸鉀和苯甲酸鈉相比，生物防腐劑ε-PL、Nisin、納他霉素和抗氧化劑茶多酚對醬腌菜中腐敗微生物抑制作用更加顯著，且它們之間存在協(xié)同抗菌效果，同時使用可以提高抑菌性能，減少用量。通過響應(yīng)面法優(yōu)化出復(fù)配防腐劑各成分用量為ε-PL 0.06 μg/mL、Nisin 0.06 μg/mL、納他霉素0.035 μg/mL和茶多酚0.40 μg/mL。和在干制蘿卜復(fù)水時添加復(fù)配防腐劑相比，在醬腌菜拌料時添加復(fù)配防腐劑可以在加速實驗（37 ℃）條件下延長其保質(zhì)期至21 d，品質(zhì)良好，菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、總酸以及氨基酸態(tài)氮含量均符合國家規(guī)定。

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