microRNA 在破骨細(xì)胞分化和功能中扮演的角色

謝保平 李勁平 石麗穎

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨骼疾病，其特征是骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，骨強(qiáng)度下降、骨脆性增加。其主要發(fā)病機(jī)制是骨組織內(nèi)的破骨細(xì)胞 (osteoclast，OC)和成骨細(xì)胞 (osteoblast，OB) 的功能活動(dòng)平衡被破壞，成骨細(xì)胞主要發(fā)揮骨重建功能，而破骨細(xì)胞是來源于造血干細(xì)胞的具有骨吸收功能的一類多核細(xì)胞。破骨細(xì)胞的分化受到多種因素的調(diào)控，現(xiàn)已證實(shí)集落細(xì)胞刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF) 和 RANKL為破骨細(xì)胞分化所必需的細(xì)胞因子，RANKL 與破骨細(xì)胞膜上受體 RANK 結(jié)合，激活下游信號(hào)分子調(diào)控破骨細(xì)胞的分化，包括 c-Fos、TRAF6、NF-κB、NFATc1[1]等。此外機(jī)體自身分泌的激素，如雌激素和甲狀旁腺素 (PTH) 也參與破骨細(xì)胞分化的調(diào)控。近年來，越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA 在破骨細(xì)胞分化的過程中扮演重要的角色。

一、microRNA 成熟過程與生物學(xué)功能

microRNA 是一段長度為 19～22 個(gè)堿基的非編碼RNA，由內(nèi)含子和編碼基因間隔區(qū)基因編碼，具有組織特異性和高度時(shí)序性的特點(diǎn)。作用于靶基因 mRNA 的3’-UTR 區(qū)，調(diào)控靶基因的翻譯過程，從而調(diào)控細(xì)胞增殖和分化、凋亡過程[2-3]。當(dāng) miRNA 與靶基因的 3’-UTR區(qū)完全配對(duì)時(shí)，靶基因的 mRNA 完全降解，部分配對(duì)時(shí)，靶基因的翻譯過程受到抑制[4]。成熟 miRNA 的形成要經(jīng)過多種內(nèi)切酶的作用 (圖1)，首先，在轉(zhuǎn)錄因子和RNA 聚合酶 II 的作用下將 DNA 轉(zhuǎn)錄為初始 miRNA (primiRNA)，然后，在細(xì)胞核中 Drosha 酶將其加工成前體miRNA (pre-miRNA)，通過 Exportin-5 運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中，經(jīng)過 Dicer 酶的加工成成熟的 miRNA[5]。故 Drosha酶和 Dicer 酶是 miRNA 成熟的關(guān)鍵酶，有文獻(xiàn)報(bào)道敲除Dicer 基因的小鼠，miRNA 形成障礙，骨骼發(fā)育較正常小鼠晚，軟骨的發(fā)育亦受影響[3]。成熟的 miRNA 與 RISC 結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物與靶基因 mRNA 的 3’-UTR 區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因的翻譯過程[6]?，F(xiàn)就與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程及 miRNA 在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演的角色，作以下總結(jié)。

二、細(xì)胞核因子 κB 受體活化因子 (receptor activator of NF-kappaB，RANK) 信號(hào)傳導(dǎo)過程及相關(guān) miRNA

1. RANK 信號(hào)傳導(dǎo)過程：RANKL 和 RANK 為腫瘤壞死因子超家族的成員，RANKL 為 II 型跨膜蛋白，由成骨細(xì)胞分泌，是破骨細(xì)胞前體分化為成熟破骨細(xì)胞的必須因子。RANK 是 RANKL 唯一的信號(hào)受體，屬 I 型跨膜蛋白。RANK 和 RANKL 結(jié)合募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 (TNF receptor-associated factor-6，TRAF6) 到 RANK胞內(nèi)區(qū)[7]，與 TAB2 和 TAK1 形成 RANK-TRAF6-TAB2-TAK1 復(fù)合物[8]，TRAF6 可通過 TAK1 將信號(hào)傳導(dǎo)給下游的細(xì)胞核因子 κB (NF-κB) 和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPKs)。靶點(diǎn) NF-κB是一類二聚體轉(zhuǎn)錄因子，其中 p50 和 p52 是 NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵蛋白[9]。此外，NF-κB 激酶誘導(dǎo)劑 (IKK) 和NF-κB 可誘導(dǎo)性激酶 (NIK) 是激活 NF-κB 的關(guān)鍵因子，TRAF6 激活 NIK 和 IKK 酶，后者使 NF-κB 抑制物 IκBα(Inhibitor of NF-κB) 磷酸化[9]，從而釋放核因子 p65 /RrelA 和 p50 / 52 復(fù)合物入核，結(jié)合相應(yīng)的 DNA 位點(diǎn)，調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄或者將募集信號(hào)傳導(dǎo)到下游靶點(diǎn)活化 T 細(xì)胞核因子 c1 (nuclear factor of activated T cells，NFATc1)，促進(jìn) NFATc1 的募集。NFATc1 作為核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響破骨細(xì)胞分化。這條信號(hào)通路可表示為 RANKL＋RANK → TRAF6 → NIK / IKK →NF-κB → NFATc1 → OC 分化。

TRAF6 將信號(hào)傳導(dǎo)到 MAPKs，MAPK 途徑是一個(gè)三級(jí)酶聯(lián)反應(yīng)傳遞信號(hào)，激活酶聯(lián)反應(yīng)的途徑主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 (ERK)、JNK、p38MAPK 途徑[10]。另外，RANKL 激活 RANK 受體指導(dǎo) AP-1 蛋白主要成分c-fos 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活 AP-1 蛋白，通過染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng) (ChIP) 發(fā)現(xiàn) c-fos 是 NFATc1 信號(hào)募集的促進(jìn)劑，且 c-fos 基因缺乏的小鼠患有嚴(yán)重的骨硬化癥[9]。因此 NFATc1 核轉(zhuǎn)錄因子是 NF-κB 和 AP-1 的共同靶點(diǎn)。由此形成兩條以膜受體 RANK 和 NFATc1 為核心的調(diào)控破骨細(xì)胞分化的信號(hào)通路 (圖1)。

圖1 RANKL / RANK 信號(hào)通路圖與調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)的 miRNA(注：表示抑制， 表示促進(jìn)或者信號(hào)傳導(dǎo)過程)Fig.1 RANKL / RANK signaling pathways and the role of miRNAs in regulating related targe (Annotations:suppression, the process of promoting or signaling)

2. 調(diào)節(jié) RANKL / RANK 信號(hào)通路的 miRNA：miR-503通過靶點(diǎn) RANK 抑制破骨細(xì)胞分化，Chen 等[11]發(fā)現(xiàn)在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女的 CD14＋PBMCs 細(xì)胞中 miR-503 的表達(dá)顯著減少，體外實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá) miR-503 的顯著抑制RANKL 誘導(dǎo) CD14＋PBMCs 分化為破骨細(xì)胞，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn) RANK 是 miRNA503 的直接靶點(diǎn)，miR-503-5p 端與 RNAK mRNA 的 3’-UTR 區(qū)結(jié)合抑制 RANK蛋白的翻譯，從而抑制破骨細(xì)胞分化。

TRAF6 是破骨細(xì)胞分化中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，TRAF6 基因敲除的小鼠患嚴(yán)重的骨石化病且骨吸收功能減弱。Guo等[12]研究表明 miRNA-125a 下調(diào) TRAF6 的表達(dá)，進(jìn)而顯著降低 NFATc1 的表達(dá)抑制破骨細(xì)胞分化。在脂多糖刺激的人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系 (monocytic leukemia cell line，THP-1) 細(xì)胞中，過表達(dá)的 miR-146a 抑制 TRAP6 的蛋白翻譯[13]另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn) miR-146a 的直接靶點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳感器 1 (signal transducer and activator transcription 1，STAT1)，miR-146a 抑制 STAT1 表達(dá)，STAT1 抑制 SOCS1的表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化[14]。

NF-κB 通路是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的重要通路，研究發(fā)現(xiàn)在破骨細(xì)胞分化過程中 miR-212 / 132 簇 和 miR-99b /let-7e / 125a 簇顯著上調(diào)[15]。Zhou 等[16]用熒光素報(bào)告體研究發(fā)現(xiàn) miR-199b 的直接靶點(diǎn)是 IKKβ，過表達(dá)的 miR-199b 與 IKKβ 的 3’-UTR 區(qū)結(jié)合，抑制 IKKβ 的翻譯過程，阻斷了 NF-κB 的活化。

NFATc1 是一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子，受多種 miRNA 的直接或間接調(diào)控，包括 miR-148a 和 miR-124 等，Cheng 等[17]發(fā)現(xiàn)在 M-CSF 和 RANKL 誘導(dǎo)的 CD14＋PBMCs 分化破骨細(xì)胞的過程中，miR-148a 的表達(dá)顯著上升，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn) miR-148a 的直接靶點(diǎn)是 MAFB，miR-148a抑制 MAFB 蛋白的翻譯過程，MAFB 負(fù)性調(diào)節(jié) NFATc1 的表達(dá)。Lee 等[18]研究發(fā)現(xiàn)在 BMMs 分化為破骨細(xì)胞過程中，miR-124 顯著的抑制 NFATc1 的表達(dá)，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的分化。另外，有學(xué)者報(bào)道，有些 miRNA 可以調(diào)節(jié) NFATc1 的表達(dá)或者通過靶點(diǎn)干擾 NFATc1 與破骨細(xì)胞 DNA 的結(jié)合調(diào)控破骨細(xì)胞的分化。Zhang[19]研究發(fā)現(xiàn)INF-β 可以誘導(dǎo) miRNA-155 的表達(dá)，miR-155 通過抑制靶點(diǎn) MITF 和 SOCS1 的表達(dá)減弱 NFATc1 與 DNA 結(jié)合抑制破骨細(xì)胞的分化。Rossi 等[20]報(bào)道 miR-29b 可以抑制人破骨細(xì)胞的分化和功能，其作用機(jī)制是通過抑制 NFATc1信號(hào)募集的促進(jìn)劑 c-fos 表達(dá)。Cao 等[21]研究表明 miR-422a 在骨密度較低的絕經(jīng)后婦女當(dāng)中顯著上調(diào)，且發(fā)現(xiàn)miR-422a 的表達(dá)與 5 個(gè)破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因 (CBL、CD226、IGF1、PAG1、TOB2) 呈負(fù)性相關(guān)，其中 CBL 是NFATc1 表達(dá)的促進(jìn)劑。

另外，有些 miRNA 通過其它靶點(diǎn)調(diào)節(jié) NFATc1 的表達(dá)影響破骨細(xì)胞的分化，Liu 等[22]發(fā)現(xiàn) miR-9718 通過抑制靶點(diǎn) PIAS3 的表達(dá)抑制 NFATc1 的效應(yīng)，從而抑制破骨細(xì)胞分化。在 RANKL 誘導(dǎo) BMMs 和 RAW264.7 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的過程中，miR-218 的表達(dá)顯著降低，且過表達(dá)的 miR-218 顯著抑制破骨細(xì)胞的分化，進(jìn)一步研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn) MAPKs 是 miR-218 的靶點(diǎn)，miR-218 通過調(diào)控p38MAPK-c-Fos-NFATc1 通路抑制破骨細(xì)胞分化[23]。

3. 調(diào)節(jié) OPG / RANKL 系統(tǒng)平衡的 miRNA：OPG /RANKL 系統(tǒng)是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和骨代謝的重要通路，也是藥物抗骨質(zhì)疏松的重要機(jī)理。Lyu 等[24]報(bào)道女貞子醇提物顯著的增加雌性大鼠的骨密度和改善骨性能，且顯著的減少體內(nèi)體外 RANKL / OPG 的比率。Ge 等[25]研究證實(shí) miR-31 能調(diào)控 runx2-mir-31-satb2 環(huán)路，導(dǎo)致 RANKL /OPG 和 RANKL / RANK 比率降低進(jìn)而使破骨細(xì)胞失活和抑制骨基質(zhì)重塑。Pitari 等[26]證實(shí) miR-21 可以調(diào)控 RANKL /OPG 的平衡減弱成熟破骨細(xì)胞的活性。

三、雌激素受體 (estrogen receptor，ER) 信號(hào)通路與相關(guān) miRNA

1. ER 信號(hào)傳導(dǎo)過程：在破骨細(xì)胞的功能研究中，雌激素常作為陽性對(duì)照藥物，顯著的抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收功能。雌激素是一類甾體類化合物，雌激素通過 ER 直接調(diào)控 (或者通過 FasL 旁路機(jī)制) 破骨細(xì)胞的凋亡，或者直接抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收功能[8]。ER屬于核轉(zhuǎn)錄因子[27]，具有 ERα 和 ERβ 兩種亞型，ERα / β以同源或異源二聚體的形式，與靶基因上的相應(yīng)序列(estrogen response element，ERE) 相結(jié)合調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄過程[28]。破骨細(xì)胞分化越成熟，細(xì)胞核增多，ER 的表達(dá)下降[7]。雌激素與 ER 結(jié)合激活 ER，激活的 ER 通過以下三種方式介導(dǎo)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化：(1) 直接與靶基因上的 ERE 位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)或者抑制基因的轉(zhuǎn)錄活性[8]；(2)同其它轉(zhuǎn)錄因子 (NF-κB、c-fos / c-Jun) 結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與細(xì)胞因子基因啟動(dòng)的調(diào)節(jié)位點(diǎn) (NF-κB、AP-1、SP-1) 結(jié)合，進(jìn)而影響細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄活性[8]；(3)調(diào)節(jié)某些 miRNA 的表達(dá)，通過 miRNA 抑制 OC 分化相關(guān)因子的表達(dá)抑制破骨細(xì)胞分化[29]。

2. 調(diào)節(jié) ER 的 miRNA：Chen 等[11]體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明雌激素通過 ER 可以顯著升高 miR-503 的表達(dá)，抑制RANK 的表達(dá)，故 ER 可能是通過 miR-503 調(diào)節(jié) RANK 的表達(dá)。由此形成 ER / miR503 / RANK 信號(hào)通路，將雌激素信號(hào)傳導(dǎo)與 RANKL / RANK 系統(tǒng)聯(lián)系在一起。

Castellano 等[30]發(fā)現(xiàn) ER 可以調(diào)控位于 13 號(hào)染色體q31-q32 區(qū)域的 miR-17-92 家族的表達(dá)，該區(qū)域的基因具有多順反子的特點(diǎn)，該家族包括 6 個(gè) miRNAs (miR-17，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-1 和 miR-92-1)，ER 可以上調(diào) pri-miR17-92 的表達(dá)，從而增加了 miR-17-92 家族成熟 miRNA 的表達(dá)，而 miR-17-92a 可以抑制成骨細(xì)胞的凋亡[6]。Pandey 等[31]研究發(fā)現(xiàn) ERα 有很長的3’-UTR 區(qū)，miR-22 作用于靶點(diǎn) ERα 顯著抑制 ERα 的翻譯水平。Sugatani 等[32]報(bào)道雌激素下調(diào) miR-21 的表達(dá)，miR-21 作用于靶點(diǎn) FasL，使 FasL 蛋白表達(dá)升高，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡。在 OC 分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子 c-fos上調(diào) miR-21 的表達(dá)水平，miR-21 作用于靶點(diǎn)程序性凋亡基因 4 (PDCD4) 的 3’-UTR 區(qū)，下調(diào) PDCD4 的蛋白表達(dá)，而 PDCD4 會(huì)抑制 c-fos 的表達(dá)[29]。Fujita 等[33]也證實(shí)了 AP-1 可以上調(diào) miR-21 的表達(dá)，而 c-fos 蛋白是 AP-1的主要成分，如此形成一個(gè)以 ER 和 miR-21 為中心調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成和凋亡的網(wǎng)絡(luò) (圖2)。

圖2 ER 信號(hào)通路與調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)的 miRNA (注：表示抑制， 表示促進(jìn)或者信號(hào)傳導(dǎo)過程)Fig.2 ER signaling pathways and miRNAs regulating related targets(Annotations:suppression, the process of promoting or signaling)

四、調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的其它 miRNA

調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和骨吸收的 miRNA 種類繁多，除了上述 RANK 和 ER 兩條通路上的 miRNA 外，還包括 miR-7b[34]、miR-26a[35]、miR-133a[36]、miR-33a[37]、miR-214[38]、miR-31[39]等。

其中 miR-7b、miR-26a、miR-133a、miR-33a 等對(duì)破骨細(xì)胞的分化具有負(fù)性調(diào)節(jié)效應(yīng)。Dou 等[34]報(bào)道樹突狀細(xì)胞特異性跨膜蛋白 (dendritic cell-specific transmembrane protein，DC-STAMP) 是 miR-7b 的直接靶點(diǎn)，miR-7b 通過 DC-STAMP 靶點(diǎn)抑制 NFATc1 和 c-fos 信號(hào)通路從而抑制破骨細(xì)胞前體的融合和分化。Kim 等[35]研究發(fā)現(xiàn)在 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過程中 miR-26a 的表達(dá)上升，且過表達(dá)的 miR-26a 抑制破骨細(xì)胞分化，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) miR-26a 抑制結(jié)締組織生長因子 (connective tissue growth factor，CTGF) 的表達(dá)，而 CTGF 通過上調(diào)DC-STAMP 表達(dá)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化。Wang 等[36]用miRNA 微陣列分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)在破骨細(xì)胞分化中 miR-133a表達(dá)顯著上調(diào)，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn) miR-133a 的靶點(diǎn)為 3 個(gè)破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因 (CXCL11，CXCR3 和SLC39A1)，并指出 miR-133a 可作為絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松診斷的生物學(xué)指標(biāo)。Kou 等[37]研究發(fā)現(xiàn) miR-33a 的水平與 PTHrP 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，PTHrP 是一種骨吸收的促進(jìn)劑，深入研究發(fā)現(xiàn) miR-33a 抑制 PTHrP 的表達(dá)從而減少了 IL-8 的分泌，抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收。

而 miR-214、miR-31a 則促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化。Zhao等[38]研究發(fā)現(xiàn) miR-214 在 M-CSF 和 RANKL 誘導(dǎo) BMMs分化為破骨細(xì)胞過程中表達(dá)顯著上升，miR-214 通過調(diào)節(jié) PTEN / P13k / Akt 信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化。有文獻(xiàn)報(bào)道在 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中 miR-31 的表達(dá)顯著上升，拮抗 miR-31 的功能破骨細(xì)胞的分化被顯著抑制，另外，加入 miR-31 靶點(diǎn) RhoA 的抑制劑可以減弱miR-31 導(dǎo)致的抑制破骨細(xì)胞分化的效應(yīng)，表明 miR-31 是通過靶點(diǎn) RhoA 調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的[39]。

破骨細(xì)胞的分化成熟是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控，這些細(xì)胞因子作用于破骨細(xì)胞受體，激活膜受體引起某些細(xì)胞因子的募集或者激活細(xì)胞因子由胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的過程。然而，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的細(xì)胞因子或者受體絕大多數(shù)受到 miRNA 的調(diào)控，各種 miRNA 的生物學(xué)功能表達(dá)趨勢(shì)并非一致的，且這些miRNA 作用靶點(diǎn)或者機(jī)制并不是完全清楚。故從 miRNA層面研究破骨細(xì)胞分化的機(jī)制有重要的意義，部分功能確切作用機(jī)制清楚的 miRNA 可作為骨質(zhì)疏松、骨損傷等疾病診斷的生物學(xué)指標(biāo)，并為骨代謝疾病的治療提供了新的方向。

參 考 文 獻(xiàn)

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