γ 射線終末輻照對同種異體肌腱病毒滅活效果及生物力學(xué)性能影響的研究

趙彥濤 劉思揚(yáng) 尹惠瓊 白玉龍 韓麗偉 胡先同 朱加亮 衷鴻賓

肌腱在機(jī)體運(yùn)動過程中傳遞肌肉和骨骼間的相互作用，常承受著高強(qiáng)度的機(jī)械負(fù)荷，容易損傷，因此肌腱損傷跟骨折、骨缺損一樣，屬于較為常見的臨床疾病[1]。其中，肌腱損傷中最為常見的是前交叉韌帶 (anterior cruciate ligament，ACL) 損傷，據(jù)報道美國每年有超過 100 000 例 ACL 損傷的患者接受治療[2-3]，且 ACL 手術(shù)在美國最常做的手術(shù)中排第六位[4]。

肌腱損傷尤其是 ACL 損傷修復(fù)手術(shù)中，自體肌腱移植和同種異體肌腱移植應(yīng)用最為普遍[5-6]。自體肌腱移植因來源受限，且給患者帶來二次手術(shù)的傷害而限制其發(fā)展。同種異體肌腱來源相對豐富且能夠滿足臨床上肌腱損傷修復(fù)手術(shù)對移植物的要求，被認(rèn)為是一種理想的肌腱修復(fù)材料。但其同樣存在發(fā)生病毒交叉感染的風(fēng)險。因此，評價該類生物材料的生物安全性尤為重要。本研究參考我國血液制品病毒滅活規(guī)范及動物源性醫(yī)療器械審查指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容[7-8]，驗證終末輻照對人工污染在同種異體肌腱上的偽狂犬病毒 (porcine pseudorbies virus，PRV)、水泡性口炎病毒 (vesicular stomatitis virus，VSV)、豬細(xì)小病毒 (porcine parvovirus，PPV)、豬腦心肌炎病毒 (encephalomyocarditis virus，EMCV)及人免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus，HIV-1) 滅活效果，同時觀察該病毒滅活工藝對同種異體肌腱生物極限拉伸載荷和組織結(jié)構(gòu)的影響。

材料與方法

一、試驗材料

同種異體肌腱：原材料由解放軍骨科研究所提供，經(jīng)北京鑫康辰醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司進(jìn)行了前處理和清洗后提供，批號 14001、14002、14003。

輻照源：由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供，輻照劑量 25 kGy。

細(xì)胞株：按常規(guī)方法培養(yǎng)用于 PRV 和 PPV 培養(yǎng)的豬腎傳代細(xì)胞 (PK-15)、用于 VSV 培養(yǎng)的綠猴腎細(xì)胞 (Vero E6)、用于 EMCV 培養(yǎng)的倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、MT4 細(xì)胞。

病毒株：PRV、PPV 可經(jīng) PK-15 細(xì)胞培養(yǎng)并產(chǎn)生細(xì)胞病變，VSV 可經(jīng) Vero E6 細(xì)胞培養(yǎng)并產(chǎn)生病變，EMCV 可經(jīng) BHK-21 細(xì)胞培養(yǎng)并產(chǎn)生細(xì)胞病變，HIV-1 可經(jīng) MT4 細(xì)胞培養(yǎng)并產(chǎn)生病變。以上指示病毒滴度均＞6.00 Log TCID50 / 0.1 ml，均分裝并置于 -70 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM＋10% FBS，RPMI 1640＋10% FBS，MEM＋10% FBS。96 孔板 (Greiner bioone)，CO2孵箱 (Thermo-Fisher)，MTS-858 Mini BionixII 型材料力學(xué)試驗機(jī) [ 美斯特工業(yè)系統(tǒng) (中國)有限公司 ]。

二、試驗方法

1. 樣品制備：取同種異體肌腱樣品浸泡于 5 ml 指示病毒液 (PRV、PPV、VSV、EMCV) 中，室溫放置60 min。取上一步樣品，至于包裝袋中，封口備用。按擲硬幣方法將樣品隨機(jī)分為兩組，一組經(jīng) 25 kGy輻照滅菌處理，另一組不做輻照處理。將輻照前后樣品浸泡于無血清細(xì)胞培養(yǎng)液中放置 30 min，取上清液 2 ml，置于離心機(jī)中，以 4000 r / min 離心10 min，吸取上清 1 ml，除菌過濾后置于 -70 ℃ 冰箱保存?zhèn)錂z。該部分內(nèi)容于軍事醫(yī)學(xué)研究院衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所完成。

取同種異體肌腱樣品一塊，加入 HIV-1 1 ml，混勻、孵育，作為輻照前取樣；同樣，取同種異體肌腱一塊，加入 HIV-1 1 ml，混勻，輻照后取樣。該部分內(nèi)容于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實驗室完成。

取正常供體手部肌腱 12 根，直徑 4～5 mm 肌腱(由解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院骨科研究所提供)，按擲硬幣的方法隨機(jī)分為兩組，一組經(jīng) 25 kGy 輻照處理，另一組不經(jīng)輻照。室溫，生理鹽水潤濕，將兩組肌腱修剪至等長 10 cm。將無菌紗布剪成寬 2 cm 的長條，在肌腱兩端 2 cm 處纏繞 4 圈，用2#Ethibond 縫線將每根肌腱和紗布縫合 7 針，針距0.2 cm，固定，用于輻照前后同種異體肌腱力學(xué)性能檢測。

2. 病毒滴度檢測：將載有病毒的樣品取樣融化后，立即使用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行 10 倍的梯度稀釋，然后加入鋪好細(xì)胞的 96 孔板中，設(shè)定病毒對照和細(xì)胞對照，根據(jù) Karber 氏法測定病毒滴度變化。每批樣品重復(fù)測定 3 次，取其平均值。

3. 細(xì)胞盲傳與檢測：對經(jīng)處理后不出現(xiàn)細(xì)胞病變的樣品，吸取 96 孔板中最低稀釋倍數(shù)孔的上清液加入鋪好敏感細(xì)胞的 96 孔板中，置于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，盲傳 3 代，并觀察上清液細(xì)胞病變。

4. 力學(xué)性能檢測：室溫，生理鹽水潤濕，將兩組肌腱固定于 MTS-858 Mini BionixII 材料試驗機(jī)夾具 (上下端各 2 cm) 上。調(diào)整力學(xué)機(jī)使肌腱拉直但無張力，測量夾具間肌腱的長度。對肌腱預(yù)載，施加0～100 N 拉力，循環(huán) 5 次后恢復(fù)初長度靜置 10 min后，行拉斷試驗，加載速度 3 mm / min，力學(xué)機(jī)記錄載荷－時間曲線，記錄極限載荷。

5. 組織學(xué)觀察：取輻照前、輻照后肌腱，10%福爾馬林固定后進(jìn)行石蠟包埋切片，HE 染色，觀察肌腱纖維結(jié)構(gòu)是否有破壞。

6. 病毒滅活效果評價：根據(jù)衛(wèi)生部《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002 版) 和《血液制品去除 / 滅活病毒技術(shù)方法及驗證指導(dǎo)原則》(2002 版) 關(guān)于病毒滅活 / 去除效果的評價，當(dāng)病毒降低系數(shù) ≥ 4 Log 值時，表明該病毒滅活工藝有效；如因?qū)嶋H檢測方法限制導(dǎo)致病毒降低系數(shù)＜4 Log 值時，應(yīng)盲傳 3 代，如無病毒檢出，則可以認(rèn)為病毒滅活工藝有效。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用 SPSS 19.0 進(jìn)行處理，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗對同種異體肌腱兩組極限載荷數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PRV 檢測結(jié)果

三批同種異體肌腱樣品經(jīng)輻照滅活工藝對病毒進(jìn)行滅活后，均未檢測到病毒，該工藝可使 PRV、VSV、PPV、EMCV、HIV-1 的滴度下降 4 個 Log 以上。對于檢測不到病毒滴度的樣品，取其最低稀釋倍數(shù)孔上清液，接種敏感細(xì)胞，盲傳 3 代，結(jié)果均未觀察到細(xì)胞病變 (表1)。

表1 輻照對 5 種病毒的滅活效果Tab.1 Effect of irradiation sterilization on viral inactivation

二、力學(xué)性能

γ 射線輻照滅菌 (輻照劑量 25 kGy) 前后，同種異體肌腱移植物在外觀上無顯著變化，均呈乳白色，質(zhì)地柔軟 (圖1)。通過 MTS 力學(xué)試驗機(jī)測試同種異體肌腱移植物輻照前后載荷與時間的關(guān)系 (圖2～3)，輻照前，同種異體肌腱極限載荷為(315.34～402.31) N，均值 363.76 N；輻照后，同種異體肌腱極限載荷為 (301.98～411.32) N，均值344.99 N。兩組極限載荷數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05) (表2)。

圖1 MTS 力學(xué)試驗機(jī)及輻照前后同種異體肌腱Fig.1 MTS testing machine & allogeneic tendon (before and after irradiation)

圖2 同種異體肌腱輻照前極限載荷Fig.2 The ultimate load of allogeneic tendon before irradiation

圖3 同種異體肌腱輻照后極限載荷Fig.3 The ultimate load of allogeneic tendon after irradiation

表2 輻照前后同種異體肌腱極限載荷比較Tab.2 The ultimate lord of allogeneic tendon before and after irradiation

三、組織學(xué)觀察

HE 染色顯示輻照前后肌腱組織呈粉色波浪紋，膠原纖維稠密，結(jié)構(gòu)無明顯破壞 (圖4)。

討 論

同種異體肌腱在嚴(yán)重肌腱 / 韌帶損傷修復(fù)領(lǐng)域應(yīng)用歷史久遠(yuǎn)且較為廣泛，尤其是在膝關(guān)節(jié)交叉韌帶的修復(fù)重建和跟腱斷裂的修復(fù)上，其臨床治療效果與自體肌腱移植相當(dāng)[6,9]。具國外文獻(xiàn)報道，近來年同種異體肌腱用于 ACL 重建的使用率增長迅速，2002 年為 17.4%，2008 年已增長至 45.6%[10]。盡管同種異體肌腱擁有上述諸多優(yōu)勢，但是，在使用過程中仍存在問題：同種異體肌腱移植存在導(dǎo)致易感病毒傳播的風(fēng)險[11]。捐獻(xiàn)的供體在取材之前雖已經(jīng)過嚴(yán)格篩選和血清學(xué)檢查，但仍不能完全排除感染病毒的可能 (如處在病毒感染的窗口期)。因此，在同種異體肌腱處理工藝中增加病毒滅活工序是必要的。國家食品藥品監(jiān)督管理總局對動物源性 / 同種異體組織修復(fù)材料的要求需要有相應(yīng)的病毒滅活工序，旨在對處在窗口期的病毒進(jìn)一步殺滅，排除處理過程中引入新的病毒，保證組織移植材料的生物安全性。

組織修復(fù)材料病毒滅活的方法多種多樣，包括：(1) 物理法：如巴氏消毒法、干熱滅活法、γ 射線輻照滅活法等；(2) 化學(xué)法：如乙醇滅活法、過氧乙酸－乙醇滅活法、有機(jī)溶劑 / 表面活性劑洗滌法 (S / D 法) 等；(3) 物理法和化學(xué)法聯(lián)合使用。在選擇病毒滅活工藝時，一方面需考慮該方法是否能夠有效殺滅病毒，另一方面需考慮該方法是否對生物材料的性能產(chǎn)生不利的影響。對于同種異體生物材料而言，干熱滅活法溫度過高，無論是對硬組織(同種異體骨、軟骨) 還是軟組織 (同種異體肌腱 /韌帶、皮膚、神經(jīng)等) 均會造成較大的損害，不宜使用。巴氏消毒法 (60 ℃) 廣泛用于牛奶、蛋白制品的病毒滅活，也可用于同種異體骨的病毒滅活，該溫度對同種異體骨材料的生物性能影響不大，但卻不適用于軟組織材料的病毒滅活[12]。酒精滅活病毒的能力一般，對于一些較難殺滅的病毒如 PPV，酒精無法起到滅活作用。過氧乙酸－乙醇的病毒滅活效果較好[13]，但過氧乙酸具有強(qiáng)氧化性，經(jīng)過氧乙酸－乙醇處理后組織材料通常會出現(xiàn)顏色發(fā)白，組織結(jié)構(gòu)膨脹等現(xiàn)象，且過氧乙酸具有腐蝕性，屬于危險品，在生物材料制備過程中使用有較大的風(fēng)險。另外，使用化學(xué)試劑對同種異體組織修復(fù)材料進(jìn)行病毒滅活，通常需要較長時間的浸泡和解吸附，還需要驗證有毒溶劑殘留對材料的影響，故應(yīng)盡量避免使用。

圖4 同種異體肌腱輻照前 (a) 輻照后 (b)組織學(xué) HE 染色 (× 40) 觀察Fig.4 Histological results of allogeneic tendon before irradiation (a) and after irradiation (b),× 40

γ 射線輻照滅菌是目前生物材料制備過程中使用較為廣泛的一種滅菌方式，通常在產(chǎn)品制備結(jié)束，裝入包裝袋后進(jìn)行，稱作終末輻照滅菌。其作用機(jī)理為：γ 射線作用于微生物后直接或通過產(chǎn)生游離基，破壞微生物 DNA 等核酸分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致微生物死亡[14]。另外，γ 射線還可以作用于微生物細(xì)胞活動所需的各種酶，導(dǎo)致酶活性降低或者失活，從而使微生物正常的生理過程受阻，直至死亡[15]。終末輻照滅菌的主要作用是殺滅微生物，保證材料無菌，其是否可以作為生物材料病毒滅活的工序存在一些爭議。有研究者認(rèn)為，低劑量 (＜50 kGy) 輻照滅菌不能徹底殺滅病毒，尤其是 HIV 病毒[16]，但是高劑量同樣也意味著材料生物力學(xué)性能的損失；也有研究者認(rèn)為，需要在終末輻照滅菌之前增加其它化學(xué)滅活病毒的方法，這樣才能保證病毒徹底失活[17]，但同樣帶來了化學(xué)試劑殘留的風(fēng)險，多一步化學(xué)處理可能對生物材料帶來更多的損害或風(fēng)險。

本研究表明，廣泛應(yīng)用的終末輻照滅菌 (劑量 25 kGy) 能夠有效殺滅具有代表性的病毒。例如遺傳物質(zhì)為 DNA 的有囊膜病毒 PRV，無囊膜病毒PPV；遺傳物質(zhì)為 RNA 的有囊膜病毒 VSV，無囊膜病毒 EMCV 以及人免疫缺陷病毒 HIV。上述病毒均為人可能會接觸感染的病毒以及經(jīng)常與人接觸的動物易感病毒，其中包含了耐受性極高的 PPV 和中等的 PRV、VSV 和 EMCV 以及耐受性較低的 HIV。輻照滅菌 (25 kGy) 能夠使上述病毒滴度下降 4 Log 以上，并且盲傳 3 代未觀察到細(xì)胞病變。前期研究同樣表明，60Co 輻照 (25 kGy) 處理同種異體軟組織(羊膜)，在足夠的劑量和作用時間下是一種有效HIV 病毒滅活方法[18]。同時，本實驗中采用 25 kGy輻照處理同種異體肌腱移植物，處理前后檢測同種異體肌腱移植物的極限拉伸載荷，并行組織學(xué)染色觀察兩組組織結(jié)構(gòu)變化，實驗組和對照組的結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明 25 kGy 對同種異體肌腱移植物的極限載荷沒有影響。由此可見，終末輻照滅菌可單獨(dú)作為同種異體肌腱移植物病毒滅活的工藝使用，可避免由化學(xué)試劑的加入和殘留引入的風(fēng)險，并且該方法對同種異體肌腱材料的極限拉伸載荷和組織結(jié)構(gòu)亦無不利影響。

參 考 文 獻(xiàn)

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