TSG-6調(diào)控PI3K/Akt-Bcl-2通路影響人瘢痕疙瘩凋亡機(jī)制的研究

田小雨，李小靜，李心怡,李 濤

瘢痕疙瘩是由皮膚傷害和刺激造成的，其形成過(guò)程中人瘢痕疙瘩成纖維(human keloid fibroblast,HKF)細(xì)胞數(shù)量不斷增多、凋亡減少是瘢痕不斷增生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)之一[1]。前期課題組研究[2]證實(shí)腫瘤壞死因子α刺激基因6(tumor necrosis factor alpha stimulated gene-6，TSG-6 )mRNA及蛋白表達(dá)在病理性瘢痕組織中比瘢痕周?chē)Ｆつw明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Tan et al[3]以無(wú)瘢痕愈合皮膚作對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩中TSG-6表達(dá)水平明顯降低，推測(cè)無(wú)瘢痕皮膚愈合可能與TSG-6蛋白大量表達(dá)相關(guān)。綜上，誘導(dǎo)病理性瘢痕形成的因素之一可能是TSG-6蛋白表達(dá)不足。TSG-6的大量表達(dá)可以有效抑制病理性瘢痕形成，但作用機(jī)制尚不完全明確。該實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步探討TSG-6是否通過(guò)負(fù)向調(diào)控3-磷酸肌醇激酶/絲/蘇氨酸蛋白激酶-B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B-B cell lymphoma-2，PI3K/Akt-Bcl-2)促進(jìn)HKF凋亡而抑制瘢痕疙瘩增生。

1 材料與方法

1.1材料8例組織標(biāo)本來(lái)自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科門(mén)診、住院患者明確診斷，手術(shù)切除棄用的典型瘢痕疙瘩。取材標(biāo)本術(shù)前均未接受藥物及其他治療且均獲得本人或其監(jiān)護(hù)人同意。質(zhì)粒載體pLVX-puro和pLVX-shRNA1購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供大腸桿菌DH5a和293T細(xì)胞。

1.2主要試劑Transcriptor First Strand cDNA Syn-thesis Kit購(gòu)自瑞士Roche公司；Trizol、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；One Step SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit購(gòu)自大連寶生物TAKARA工程有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本DOJINDO公司；Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒及兔抗人PI3K、AKT、鼠雙微基因2(murine double minute 2，MDM2)、P53、Bcl-2抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1HKF的原代培養(yǎng)及鑒定 手術(shù)取得標(biāo)本后加入配置好的IV型膠原酶溶液，于37 ℃恒溫振蕩器震蕩10 h消化標(biāo)本，將HKF接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)3～5 d觀察細(xì)胞貼壁率達(dá)75%以上傳代。細(xì)胞傳至第3代時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體pLVX-pour-TSG-6及干擾載體pLVX-shRNA1-TSG-6 參考GenBank中TSG-6全基因擴(kuò)增引物，設(shè)計(jì)上游引物為[4]：5′-GGAATTCATGATCATCTTAATTTACT-3′，下游引物為：5′-CGGGATCCTAAGTGGCTAAATC-3′。 提取HKF總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA行PCR擴(kuò)增。將成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和pLVX-Puro行雙酶切。再設(shè)計(jì)TSG-6干擾載體序列后設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列并使之形成雙鏈DNA片段行雙酶切。擴(kuò)增培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，依據(jù)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒備用。

1.3.3慢病毒包裝及轉(zhuǎn)染、細(xì)胞分組 制備攜帶pLVX-Puro-TSG-6質(zhì)粒的慢病毒。48 h后檢測(cè)慢病毒滴度，-80 ℃凍存。同樣方法將pLVX-Puro空質(zhì)粒、pLVX-shRNA1-TSG-6、pLVX-shRNA1空質(zhì)粒用慢病毒包裝，檢測(cè)后-80 ℃凍存。HKF細(xì)胞胰酶消化后接種，24 h后加入各組病毒液繼續(xù)培養(yǎng)。1周后再感染一次，48 h后篩選。得TSG-6過(guò)表達(dá)組、TSG-6干擾組、過(guò)表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組。提取RNA、蛋白行PCR及Western blot方法檢測(cè)表達(dá)水平。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，加75%乙醇4 ℃固定24 h，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml,配置Annexin V標(biāo)記液和Binding Buffer，避光室溫孵育15 min后加PI，余組處理同前。15～30 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀完成檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/正常細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.5CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力 調(diào)整各組細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/ml，向96孔板每孔加入0.1 ml細(xì)胞懸液和10 μl CCK-8混勻后，培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)在450 nm波長(zhǎng)下各組細(xì)胞的吸光度。以空白孔為對(duì)照，周?chē)訮BS作為濕化孔，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3.6RT-PCR 提取各組總RNA，用表1中引物行PCR擴(kuò)增。采用日本TAKARA公司One Step SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)條件為95 ℃、45 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。

1.3.7Western blot 采用RIPA裂解液法提取各組細(xì)胞蛋白并采用BCA試劑盒經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)后計(jì)算出蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE法電泳后轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過(guò)夜；再經(jīng)二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h，ECL顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中拍攝照片。β-actin做內(nèi)參。

表1 RT-PCR檢測(cè)所用的引物

2 結(jié)果

2.1TSG-6對(duì)HKF細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況：HKF組、過(guò)表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、TSG-6過(guò)表達(dá)組、TSG-6干擾組的細(xì)胞凋亡比例分別為12.57%、13.60%、13.00%、22.23%、8.13%。上調(diào)TSG-6基因?qū)?xì)胞凋亡有明顯的促進(jìn)作用。與HKF組對(duì)比，TSG-6過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；TSG-6干擾組結(jié)果則相反(P<0.05)；過(guò)表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、HKF組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

2.2TSG-6對(duì)HKF細(xì)胞增殖能力的影響對(duì)各組細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后觀察，上調(diào)TSG-6基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖有顯著抑制作用。與HKF組比較，TSG-6過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞增殖顯著減緩(P<0.05)；TSG-6干擾組細(xì)胞增殖效應(yīng)顯著升高(P<0.05)；過(guò)表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、HKF組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

2.3TSG-6對(duì)HKF細(xì)胞PI3K/Akt-Bcl-2信號(hào)通路的影響與HKF組相比，TSG-6過(guò)表達(dá)組PI3K、AKT、MDM2、Bcl-2明顯降低,P53顯著升高(P<0.05)；與HKF組相比，TSG-6干擾組PI3K、AKT、MDM2、Bcl-2顯著升高,P53明顯降低(P<0.05)；過(guò)表達(dá)對(duì)照組、干擾對(duì)照組、HKF組間差異無(wú)意義，見(jiàn)圖3、4。

3 討論

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

A：HKF組；B：過(guò)表達(dá)對(duì)照組；C：干擾對(duì)照組；D：TSG-6過(guò)表達(dá)組；E：TSG-6干擾組；F：各組細(xì)胞凋亡百分比比較;與HKF組比較：*P<0.05

圖2 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力

圖3 RT-PCR檢測(cè)PI3K、AKT、MDM2、Bcl-2、P53的mRNA表達(dá)

圖4 Western blot檢測(cè)PI3K、AKT、MDM2、Bcl-2、P53表達(dá)

瘢痕疙瘩又稱為結(jié)締組織增生癥，是創(chuàng)面愈合后所形成的過(guò)度生長(zhǎng)的異常瘢痕組織。病理性瘢痕所致的外觀及功能障礙嚴(yán)重影響患者身心健康和生活質(zhì)量，目前無(wú)滿意治療方案。組織學(xué)研究[5-6]顯示：HKF增殖加快，進(jìn)入非正常凋亡途徑，因此，治療病理性瘢痕的關(guān)鍵之一即使HKF增殖減緩或凋亡增快。相關(guān)研究證實(shí)，PI3K/Akt通路在所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在[7]，并促進(jìn)HKF增殖[8]。TSG-6基因是在篩選腫瘤壞死因子α干預(yù)的人成纖維細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫(kù)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)的，在人體內(nèi)編碼為T(mén)NFAIP6基因，該基因是一種有透明質(zhì)酸結(jié)合的鏈域a，其編碼的蛋白包含277個(gè)氨基酸，是30 ku的分泌蛋白[9]。隨著研究的不斷深入，已證實(shí)該基因在正常皮膚成纖維細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，若在炎性因子的刺激下，TSG-6蛋白在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)增加。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建TSG-6慢病毒表達(dá)、干擾載體及其對(duì)應(yīng)空質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染HKF，觀察瘢痕疙瘩形成過(guò)程中TSG-6對(duì)成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)性，結(jié)果顯示與HKF相比，TSG-6過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖減緩，凋亡率顯著升高；TSG-6干擾組則相反；余組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。RT-PCR、Western blot檢測(cè)顯示TSG-6過(guò)表達(dá)組抑制PI3K、Akt、MDM2、Bcl-2表達(dá),促進(jìn)P53表達(dá)。TSG-6干擾組促進(jìn)PI3K、Akt、MDM2、Bcl-2表達(dá),抑制P53表達(dá)；余組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。

課題組前期實(shí)驗(yàn)研究[9]證實(shí)：TSG-6提高HKF的凋亡率效果顯著。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用不同方法更充分地證實(shí)這一結(jié)論。相關(guān)研究[10]證實(shí)，在兔角膜損傷模型中，將重組人TSG-6蛋白在創(chuàng)傷早期應(yīng)用于損傷部位，可抑制白介素-6 、白介素-1β的表達(dá)及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。在小鼠關(guān)節(jié)炎模型中，TSG-6蛋白可促使炎癥局部化并減輕關(guān)節(jié)水腫和軟骨、骨質(zhì)損害[11]。TSG-6在結(jié)膜松弛癥中也對(duì)結(jié)膜基質(zhì)層及Tenon囊細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用[12]。PI3K/Akt-Bcl-2通路在維持細(xì)胞正常生理功能中起到及其關(guān)鍵作用[13]。Bcl-2蛋白是B淋巴細(xì)胞瘤-2原癌基因的編碼產(chǎn)物，是一種內(nèi)膜蛋白，有關(guān)Bcl-2基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的研究較多，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)其在腫瘤細(xì)胞中超正常高表達(dá)，提示該基因有抑制凋亡作用。在兔耳瘢痕模型實(shí)驗(yàn)中，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)正常皮膚與瘢痕組織時(shí)，觀察到Bcl-2蛋白在瘢痕組織中的表達(dá)陽(yáng)性率明顯更高，提示Bcl-2的抗凋亡作用可能與瘢痕組織中成纖維細(xì)胞富集存在關(guān)聯(lián)，但具體機(jī)制不明確[14]。本實(shí)驗(yàn)顯示TSG-6過(guò)表達(dá)組與HKF組相比，PI3K、AKT、MDM2、Bcl-2 mRNA及蛋白的表達(dá)量明顯降低,P53顯著升高；TSG-6干擾組則相反。而HKF組、過(guò)表達(dá)對(duì)照組以及干擾對(duì)照組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)研究[15]證實(shí)PI3K被激活后，間接激活A(yù)KT， 增加其下游分子MDM2、Bcl-2的表達(dá)而抑制P53的表達(dá)。而在此實(shí)驗(yàn)中TSG-6作用于HKF降低了PI3K、AKT、MDM2、Bcl-2的蛋白表達(dá)，上調(diào)P53蛋白表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)提示，TSG-6在影響HKF增殖與凋亡的過(guò)程與PI3K/Akt-Bcl-2途徑相關(guān)。調(diào)控細(xì)胞凋亡的多條途徑是相互交織、互相關(guān)聯(lián)的，而TSG-6本身具有多種誘導(dǎo)調(diào)控功能，且瘢痕的發(fā)生發(fā)展與皮膚損害密不可分，相關(guān)研究[16]已證實(shí)在瘢痕形成過(guò)程中NF-κB等通路也有參與，但是否與這些通路之間具有協(xié)同作用，還有待進(jìn)一步研究。

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