塞來昔布對顱腦創(chuàng)傷后Fas表達及認知功能的影響

張金玲，張 濤，國建飛，鄭 麗，楊群福，崔福生，張宇新

顱腦損傷是一種常見病、多發(fā)病，其后遺癥一直是危害人類健康的主要因素之一，其中顱腦創(chuàng)傷后認知功能障礙對患者的生活質量產生重要的影響，且認知功能障礙是顱腦損傷后最持久、最嚴重的并發(fā)癥之一[1]。近年來，大量研究[2]顯示顱腦損傷后出現神經細胞凋亡，從而出現認知及學習記憶功能障礙。目前，國內外研究對顱腦創(chuàng)傷后神經細胞凋亡以及認知功能障礙的確切機制尚無完全揭示。因此，該研究利用Marmarou方法構建閉合性顱腦損傷模型，采用實時定量熒光PCR、免疫組織化學、原位末端標記技術法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)及Y型迷宮實驗對大鼠顱腦創(chuàng)傷后Fas表達、神經細胞凋亡和認知功能障礙的相關機制進行探討，以及應用塞來昔布藥物的治療作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑塞來昔布購自美國輝瑞制藥有限公司；兔抗人Fas多克隆抗體、兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(cysteine aspartic acid protease-8，Caspase-8)多克隆抗體均購自福州邁新生物技術有限公司；PCR試劑盒、細胞和組織裂解液均購自美國Invitrogen公司；PV-6001/6002二步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Y型三等臂式迷宮刺激器由華北理工大學醫(yī)學實驗中心提供。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物分組 SPF級健康雄性Wistar大鼠96只，體質量280～300 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)于華北理工大學醫(yī)學實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境，Wistar大鼠，隨機分為4組：對照組、假手術組、模型組、藥物組，每組24只。

1.2.2構建大鼠顱腦創(chuàng)傷模型 參照Marmarou et al[3]方法構建大鼠閉合型腦創(chuàng)傷模型，假手術組僅切開頭皮縫合，不予以打擊，分籠飼養(yǎng)，于術后2～8 h恢復飲食；對照組正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.2.3給藥方法 藥物組于模型制作成功后即刻給予塞來昔布藥物(250 mg/kg)腹腔內注射，隨后每隔6 h給藥1次，直至各時相點處死；對照組、假手術組、模型組在相同時間內給予等量生理鹽水腹腔注射。

1.2.4腦組織取材 術后72 h選取SD大鼠，乙醚吸入深度麻醉，快速開胸暴露心臟，灌注生理鹽水，隨后灌注4%多聚甲醛，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h以上。取出腦組織標本，以損傷灶為中心，切取厚約4 mm左右的組織標本，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，冠狀面連續(xù)切片，厚度為4.5 μm，60 ℃烤箱烘烤4 h后，室溫下保存?zhèn)溆?。另取部分腦組織放置于凍存管中，立即投入液氮速凍，以備實時定量熒光PCR檢測使用。

1.2.5實時定量熒光PCR法檢測Fas、Caspase-8的mRNA表達 取出腦組織，滴加400 μl ERSR裂解液，參照TRIzol說明書提取總RNA，檢測RNA純度及濃度，逆轉錄反應合成cDNA，PCR擴增反應：Fas引物序列(414 bp)：上游5′-GAATGCAAGGGACTGATAGC-3′；下游5′-TGGTTCGTGTGCAAGGCTC-3′；caspase-8引物序列(109 bp)：上游：5′-CGAACGATCAAGCACAGAGAGA-3′；下游：5′-CTGGCGAGTCCCACATGTC-3′；β-actin引物序列(277 bp)：上游5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′；下游5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。實驗結果采用相對定量的方法進行分析。

1.2.6免疫組織化學法檢測腦組織Fas、Caspase-8表達 常規(guī)脫蠟水化，3% H2O2室溫孵育，滅活內源性過氧物酶，枸櫞酸鹽溶液100 ℃沸騰，組織抗原熱修復；血清封閉液室溫孵育；滴加兔抗人Fas(1 ∶200)、兔抗人Caspase-8多克隆抗體，于4 ℃下孵育過夜；滴加生物素標記的二抗工作液，37 ℃孵育；DAB顯色；蘇木精復染，流水沖洗反藍；0.1%鹽酸酒精分化；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察并采集照片；采用Image-Pro-Plus圖像分析軟件分析圖片染色結果，依據染色分數(染色強度)評分評定結果。

1.2.7TUNEL染色檢測細胞凋亡情況 常規(guī)脫蠟脫水；3% H2O2室溫孵育10 min，以滅活內源性過氧化物酶；Proteinase K工作液孵育消化15 min；標記緩沖液20 μl，保持切片濕潤；封閉液50 μl，室溫孵育30 min；50 μl生物素化抗地高辛抗體，37 ℃孵育30 min；50 μl鏈霉親和素-生物素復合物，37 ℃孵育30 min；DAB顯色；蘇木精復染，脫水，透明，甘油封片，并于光學顯微鏡下觀察拍照，計數陽性細胞數，細胞凋亡指數(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.8迷宮實驗檢測大鼠認知功能 嚴格按照Y型迷宮刺激器說明要求操作，將大鼠置于迷宮中，10 s內大鼠1次成功直接逃至安全區(qū)域記為行為正確，否則記為行為錯誤。給予10次電刺激后有9次做出正確行為記為“學會”，記錄“學會”大鼠所需訓練的次數(記憶獲得能力)。休息24 h后再行20次上述測試，正確行為次數記錄為記憶成績。

2 結果

2.1各組Fas、Caspase-8的mRNA表達各組Fas和Caspase-8的mRNA表達量，見表1。各組Fas和Caspase-8表達比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=25.64、36.30，P<0.001)，模型組Fas和Caspase-8的mRNA表達量均明顯高于對照組、假手術組(P<0.05)；藥物組與創(chuàng)傷組比較Fas和Caspase-8的mRNA表達量有所降低(P<0.05)，但仍高于對照組及假手術組(P<0.05)；假手術組與對照組之間兩者的表達量比較差異無統(tǒng)計學意義。

表1 實時熒光定量PCR檢測腦組織Fas、Caspase-8的mRNA表達

圖1 免疫組織化學染色法觀察腦組織Fas表達 ×400

圖2 免疫組織化學染色法觀察腦組織Caspase-8表達 ×400

圖3 TUNEL染色觀察大鼠腦組織神經細胞凋亡 ×400

2.2各組腦組織中Fas、Caspase-8蛋白表達Fas、Caspase-8陽性表達定位于腦組織神經元細胞胞質或胞膜，陽性反應呈棕黃色染色，假手術組腦組織偶見陽性細胞，染色淺，模型組可見大量陽性細胞，胞質著色棕黃，染色深，藥物組可見少量陽性細胞，著色程度較淺，見圖1、2。經Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)半定量分析得出光密度值，見表2。各組Fas和Caspase-8表達比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=112.26、84.55，P<0.001)，模型組Fas和Caspase-8表達量均高于對照組、假手術組(P<0.05)；藥物組與模型組比較Fas和Caspase-8表達量均減少(P<0.05)，但仍高于假手術組和對照組(P<0.05)；假手術組與對照組之間兩者的表達量比較差異無統(tǒng)計學意義。

表2 免疫組織化學法檢測腦組織Fas、Caspase-8的表達

2.3各組細胞凋亡情況TUNEL染色陽性凋亡細胞為神經元細胞核內出現棕色顆粒，對照組和假手術組腦組織偶見凋亡細胞，模型組腦組織可見大量凋亡細胞，藥物組可見少量凋亡細胞。對照組、假手術組、模型組、藥物組的凋亡細胞數分別為(4.32±0.25)、(6.21±0.46)、(28.60±1.23)、(11.91±0.60)。各組之間凋亡細胞數差異有統(tǒng)計學意義(F=36.57，P<0.001)，模型組較對照組、假手術組凋亡細胞數增多(P<0.05)；藥物組較模型組凋亡細胞數減少(P<0.05)，但仍高于假手術組和對照組(P<0.05)；假手術組與對照組之間兩者的表達量比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.4各組大鼠認知功能情況各組大鼠記憶功能比較，見表3。各組大鼠之間記憶獲得次數差異無統(tǒng)計學意義(F=16.28，P=0.064)；各組大鼠之間記憶成績次數差異有統(tǒng)計學意義(F=38.60，P<0.001)，模型組較對照組、假手術組大鼠記憶成績次數明顯減少(P<0.05)，而藥物組較模型組大鼠記憶成績次數明顯增加(P<0.05)，但仍低于對照組與假手術組(P<0.05)；對照組與假手術組之間記憶成績次數差異無統(tǒng)計學意義。

表3 各組大鼠記憶功能的比較

3 討論

顱腦損傷后繼發(fā)性腦損害可加重腦損傷程度，是患者顱腦損傷后致殘和死亡的主要原因。大量研究[4]均證實細胞凋亡參與了顱腦損傷后繼發(fā)性腦損害的病理過程，研究探索阻抑顱腦損傷后神經細胞凋亡的腦保護策略是近年研究的熱點話題。環(huán)氧合酶-2是重要的炎癥介質，是介導花生四烯酸代謝、血栓素A2、前列腺素生物合成過程中重要的限速酶，其介導的炎癥反應、細胞毒性在繼發(fā)性腦損傷神經元凋亡過程發(fā)揮重要作用[5-6]。本研究通過探討塞來昔布對顱腦創(chuàng)傷后Fas表達及認知功能的影響，分析其對顱腦創(chuàng)傷后的保護作用及其可能機制，為塞來昔布臨床應用于顱腦創(chuàng)傷治療提供可靠的實驗和理論依據。

目前，顱腦創(chuàng)傷后神經細胞凋亡已成為近幾年來關注的熱點，大量研究[7]均表明，顱腦損傷后神經細胞發(fā)生凋亡現象。通過調控凋亡信號轉導系統(tǒng)阻抑神經細胞凋亡以治療顱腦創(chuàng)傷正成為目前神經系統(tǒng)領域的研究熱點之一。顱腦創(chuàng)傷后神經細胞凋亡的發(fā)生是一個主動的細胞死亡過程，是由抗凋亡基因和促凋亡基因參與調控的。Fas是細胞表面重要的死亡受體，屬于神經生長因子受體/腫瘤壞死因子受體超家族成員，研究表明Fas在顱腦損傷中發(fā)揮著重要的作用，顱腦損傷后神經元凋亡發(fā)生機制中的關鍵性因素，Fas與Fas-L結合后，通過介導Caspase激活的外源性激活途徑，再經過Caspase級聯反應最終導致細胞凋亡[8-9]。Beer et al[10]研究發(fā)現在大鼠顱腦損傷灶的腦皮質內Fas、FasL高表達，并參與顱腦損傷后的凋亡及炎癥反應。Rosenbaum et al[11]研究發(fā)現在大鼠局灶性顱腦損傷區(qū)神經元Fas、FasL表達增加，表明Fas介導的凋亡過程參與了顱腦損傷的病理過程。劉清軍 等[12]發(fā)現在顱腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)神經細胞過度表達Fas mRNA，并且該區(qū)出現明顯的神經細胞凋亡，推測Fas的過度表達可能是腦創(chuàng)傷后神經細胞凋亡的重要原因。

本研究首先參照Marmarou方法構建大鼠閉合型腦創(chuàng)傷模型，采用實時熒光定量PCR和免疫組織化學法檢測Fas、Caspase-8表達，TUNEL法檢測神經細胞凋亡情況，Y型迷宮實驗檢測大鼠認知功能，結果發(fā)現，顱腦創(chuàng)傷后大鼠腦組織Fas和Caspase-8的mRNA和蛋白表達明顯增高，凋亡細胞數明顯增加，大鼠記憶成績次數明顯減少。而塞來昔布藥物可使大鼠顱腦創(chuàng)傷后Fas和Caspase-8表達降低，凋亡細胞數減少，大鼠記憶成績次數增加?？紤]顱腦損傷后其可能的作用機制為Fas與其配體FasL結合，通過胞質內Fas相關死亡域蛋白，進一步和Caspase-8酶原發(fā)生相互作用，激活Caspase-8酶原，再經過Caspase級聯反應最終導致神經細胞凋亡，并造成不同程度的神經功能障礙，可表現為認知功能以及智力的減退。而環(huán)氧合酶-2特異性抑制劑塞來昔布可通過抑制上述Fas介導的死亡受體途徑信號通路，抑制Fas表達，進一步抑制其下游Caspase-8表達，抑制神經細胞凋亡，改善認知功能和空間學習記憶能力，發(fā)揮顱腦保護作用。王金光 等[13]研究發(fā)現Fas參與了脊髓損傷后神經細胞凋亡的調節(jié)，Fas和Caspase-3的表達變化有一定的相關性。趙景霞 等[14]研究發(fā)現顱腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)出現Fas蛋白表達增加并出現神經細胞凋亡，美洛寧能夠減少腦創(chuàng)傷后Fas蛋白表達，并減少神經細胞凋亡。

參考文獻

[1] 費英俊，張海湃，商慧娟，等. 顱腦損傷后認知功能障礙評估與康復治療研究進展[J]. 人民軍醫(yī)，2017，60(2)：191-2.

[2] 李新娟，葛治國，李東亮，等. 牛磺酸對大鼠腦損傷后認知功能及海馬凋亡相關蛋白表達的影響[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2006，23(6)：569-71.

[3] Marmarou A，Foda M A，Vavden Brink W，et al. A new mode of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics[J].J Neurosurg，1994，80(2)：291-300.

[4] Sun G Z，Gao F F，Zhao Z M，et al. Endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in the penumbra aggravates secondary damage in rats with traumatic brain injury[J]. Neural Regen Res，2016，11(8)：1260-6.

[5] Fathali N，Ostrowski R P，Lekic T，et al. Cyclooxygenase-2 inhibition provides lasting protection against neonatal hypoxic-ischemic brain injury[J]. Crit Care Med，2010，38(2)：572-8.

[6] Strauss K I. COX2 inhibitors for acquired brain injuries: is the time ripe[J]. Crit Care Med，2010，38(2)：723-4.

[7] Han Y，Zhang T，Su J，et al. Apigenin attenuates oxidative stress and neuronal apoptosis in early brain injury following subarachnoid hemorrhage[J]. J Clin Neurosci，2017，40：157-62.

[8] DiFranco K M，Johnson-Farley N，Bertino J R，et al. LFA-1-targeting Leukotoxin (LtxA; Leukothera) causes lymphoma tumor regression in a humanized mouse model and requires caspase-8 and Fas to kill malignant lymphocytes[J]. Leuk Res，2015，39(6)：649-56.

[9] Weckbach S, Hohmann C, Denk S, et al. Apoptotic and inflammatory signalingviaFas and tumor necrosis factor receptor I contribute to the development of chest trauma-induced septic acute lung injury[J]. J Trauma Acute Care Surg, 2013, 74(3): 792-800.

[10] Beer R，Franz G，Schopf M，et al. Expression of Fas and Fas ligand after experimental traumatic brain injury in the rat[J]. J Cereb Blood Flow Metab，2000，20(4)：669-77.

[11] Rosenbaum D M，Gupta G，D'Amore J，et al. Fas (CD95/APO-1) plays a role in the pathophysiology of focal cerebral ischemia[J]. J Neurosci Res，2000，61(6)：686-92.

[12] 劉清軍，朱 軍，趙景霞，等. 大鼠腦創(chuàng)傷后Fas mRNA表達與細胞凋亡關系及GM-1的腦保護作用[J]. 四川大學學報(醫(yī)學版)，2005，36(4)：477-9.

[13] 王金光，鄭啟新，趙 銘，等. 大鼠脊髓損傷后細胞凋亡及Caspase-3、Fas的表達和意義[J]. 中國康復醫(yī)學雜志，2006，21(4)：296-300.

[14] 趙景霞，劉清軍，崔建忠，等. 大鼠腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)Fas蛋白表達與神經細胞凋亡[J]. 第三軍醫(yī)大學學報，2005，27(12)：1226-8.