類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎單核巨噬細胞極化表型分析及臨床意義

黃自坤，李 雪，羅 清

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種病因尚未闡明的慢性全身性炎癥性的自身免疫性疾病，其主要特點是不可逆的關(guān)節(jié)炎癥和損傷[1]。RA病因復(fù)雜，可能與遺傳、環(huán)境、感染和體內(nèi)激素水平等因素有關(guān)[2]。骨關(guān)節(jié)炎( osteoarthritis，OA) 是一種中老年人常見的慢性、漸進性和退行性關(guān)節(jié)疾病，病理變化常見軟骨的降解、關(guān)節(jié)邊緣骨贅的形成、關(guān)節(jié)囊的改變和滑膜炎癥。雖然RA致病機制還不明確，但已有研究[3]表明單核細胞/巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等參與RA的發(fā)生和發(fā)展。單核細胞/巨噬細胞可通過分泌大量的炎性細胞因子來維持RA患者的炎性環(huán)境以及招募大量的免疫細胞遷移至關(guān)節(jié)炎，導(dǎo)致關(guān)節(jié)不可逆的損傷。巨噬細胞作為全血代謝、造血功能、血管生成、細胞凋亡、腫瘤和繁殖過程的參與者，在OA的發(fā)病中也起著非常重要的作用[4]。研究[5]表明在眾多的炎癥細胞中巨噬細胞與OA的炎癥過程緊密相連。巨噬細胞極化是靜息巨噬細胞在不同環(huán)境下分化成不同表型：M1(促炎型)和M2(抑炎型)，而 M1與M2在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化，來調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)應(yīng)答[6-7]。該研究通過檢測RA患者和OA患者外周血單核細胞及關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞表面極化指標(M1：CD206、CD163；M2：CD64、CD40、CD86、HLA-DR)的表達，包括平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)和百分率，分析其與疾病活動度、炎癥程度和自身抗體的關(guān)系，探討單核巨噬細胞極化在RA發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2016年6月～2017年9月于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的28例RA患者作為RA組，其中男5例，女23例，年齡25～80(55.18±14.85)歲，臨床診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)1987年的RA診斷標準[8]，都有關(guān)節(jié)腔積液，并排除嚴重糖尿病、高血壓、高血脂、心腦血管疾病、肝腎疾病、血栓性疾病、血小板疾病等其他疾病。選取同期于風(fēng)濕免疫科就診的OA患者20例作為對照組，男3例，女18例，年齡44～82(58.20±10.22)歲，臨床診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)1986年的OA診斷標準[9]，其中6例有關(guān)節(jié)腔積液。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。詳細收集RA患者臨床資料及相關(guān)實驗室檢查數(shù)據(jù)，并計算其RA疾病活動性評分(disease activity score 28, DAS28)[10]。所有的RA患者在采集標本前使用了抗風(fēng)濕病藥物的治療。本實驗經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2試劑和儀器流式細胞抗體藻紅蛋白標記的CD163抗體(phycoerythrin-CD163, PE-CD163)、PE標記的CD206抗體(PE-CD206)、PE標記的CD86抗體(PE-CD86)、異硫氰酸熒光素標記的CD40抗體(fluorescein isothiocyanate-CD40，F(xiàn)ITC-CD40)、FITC標記的CD64抗體(FITC-CD64)、FITC標記的HLA-DR抗體(FITC-HLA-DR)購自美國eBioscience公司，藻紅蛋白-得克薩斯紅標記的CD14抗體(phycoerythrin-texas red，ECD-CD14)及相應(yīng)的同型對照PE-IgGl和FITC-IgG1均購自美國Beckman Coulter公司。Cytomics FC 500流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司，分析軟件為儀器自帶的CXP分析系統(tǒng)。

1.3單個核細胞提取采集受試者清晨空腹EDTA抗凝外周血5 ml和關(guān)節(jié)腔積液10 ml，6 h內(nèi)送檢。采用 Ficoll-Paque 分離液 (美國Sigma公司)提取RA患者及對照者的單個核細胞。

1.4流式細胞術(shù)檢測細胞表面分子各取受試者100 μl 生理鹽水重懸的細胞加入4支試管中，按以下組合加入單克隆抗體各10 μl：ECD-CD14、PE-IgGl、FITC-IgGl; ECD-CD14、PE-CD163、FITC-CD64; ECD-CD14、PE-CD206、FITC-CD40; ECD-CD14、PE-CD86、FITC-HLA-DR，4 ℃避光孵育30 min，室溫1 500 r/min離心5 min，棄上清液，用生理鹽水洗滌2次，用500 μl生理鹽水重懸上機檢測。Cytomics FC 500流式細胞儀進行分析，使用CXP分析軟件分析細胞CD163/CD206/CD40/CD64/CD86/HLA-DR的表達。

1.5RA的其他指標檢測方法類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor, RF)采用速率散色比濁法(美國Beckman Coulter公司)檢測；抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-citrullinated protein antibodies, ACPA)采用酶聯(lián)免疫吸附法(上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司)檢測；紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)采用動態(tài)血沉儀法(北京普利生公司)檢測。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理運用SPSS 17.0軟件進行分析。首先進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)性分布數(shù)據(jù)，兩組間比較采用t檢驗，否則采用非參數(shù)檢驗。兩變量為正態(tài)分布數(shù)據(jù)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，否則采用Spearman 相關(guān)分析。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1RA組及OA組外周血單核細胞極化指標的表達水平采用流式細胞術(shù)分析RA組和OA組外周血單核細胞(CD14+)上CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR表達水平，結(jié)果見表1，RA組外周血單核細胞CD163、CD206、CD40、CD64和HLA-DR表達的MFI，顯著高于OA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；外周血單核細胞上的CD86表達的MFI在兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而RA組外周血單核細胞CD163、CD206、CD40、CD80、CD64和HLA-DR表達百分率與OA組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 RA組及OA組單核細胞表面CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR的表達

2.2RA組外周血單核細胞及關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞極化指標的表達水平采用流式細胞術(shù)分析RA組外周血單核細胞及關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞上CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR表達水平，結(jié)果見表2，RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞CD206、CD40、CD86和HLA-DR表達的MFI顯著高于RA組的外周血單核細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而CD163和CD64表達的MFI在兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞CD206、CD40 和CD64表達百分率顯著高于外周血，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞CD163表達百分率低于外周血，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞CD86和HLA-DR表達百分率與外周血比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3RA組及OA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞極化指標的表達水平采用流式細胞術(shù)分析RA組及OA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞上CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR表達水平，結(jié)果見表3，RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR表達的MFI與OA組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞HLA-DR表達百分率顯著高于OA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞CD163表達百分率低于OA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞CD206、CD40、CD64和CD86表達百分率與OA組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4RA組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞上CD163和HLA-DR表達與臨床指標的關(guān)系本文進一步分析RA患者關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞上CD163、HLA-DR表達與DAS28、ESR、RF、ACPA的相關(guān)性顯示：RA患者關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞上CD163表達百分率與ACPA的含量呈正相關(guān)性，而與DAS28、ESR、RF之間無相關(guān)性；RA患者關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞上HLA-DR表達百分率與DAS28、ESR、RF、ACPA之間無相關(guān)性，見圖1。

表2 RA組單核細胞及關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞表面CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR的表達

表3 RA組及OA對照組關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞表面CD163、CD206、CD40、CD64、CD86和HLA-DR的表達

圖1 RA患者關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞上CD163表達百分率與ACPA含量的關(guān)系

3 討論

單核細胞/巨噬細胞在RA患者的炎性環(huán)境的維持以及不可逆的關(guān)節(jié)損傷中發(fā)揮著重要的作用，而巨噬細胞極化在這個過程中作用還不是很明確，尤其是外周血中單核細胞上極化指標的表達及其作用了解甚少。Zhu et al[11]研究發(fā)現(xiàn)RA患者關(guān)節(jié)腔積液內(nèi)的巨噬細胞是M1和M2混合型，但以M1為主。Soler Palacios et al[12]研究發(fā)現(xiàn)RA患者關(guān)節(jié)腔積液內(nèi)的巨噬細胞高表達M1相關(guān)的基因以及M1相關(guān)的表型，說明其以M1為主。Highton et al[13]研究發(fā)現(xiàn)RA患者的外周血單核細胞表達HLA-DR和CD64等M1極化指標。這些研究表明RA患者中單核巨噬細胞的極化表型還存在爭議。OA 一般常見于老年人，是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變?yōu)樘卣?，無菌性、慢性、進行性、侵犯關(guān)節(jié)，特別是負重關(guān)節(jié)的疾病，一般認為是關(guān)節(jié)老化的現(xiàn)象。OA 的發(fā)病原因不明，目前越來越多的證據(jù)表明單核巨噬細胞與OA的炎癥過程密切相關(guān)[4-5]。而單核巨噬細胞參與的炎癥過程在RA和OA中的具體作用以及機制是否相同還不是很明了，尤其是單核巨噬細胞極化所發(fā)揮的作用。因此，為了深入了解單核巨噬細胞極化在RA中的作用，本研究對RA患者和OA患者外周血單核細胞和關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞的極化指標的表達進行檢測，結(jié)果表明RA患者外周血單核細胞高表達M1型和M2型極化指標，呈現(xiàn)M1和M2混合型，說明RA患者外周血單核細胞被活化、處于極化調(diào)控的動態(tài)平衡，如果M1型巨噬細胞不斷增多, 則炎癥加劇，病情進展[14]；此外，RA患者關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞高表達M1極化指標、低表達M2極化指標，呈現(xiàn)M1型，關(guān)節(jié)有明顯的炎癥。不同研究其結(jié)果不一致可能原因是不同RA患者異質(zhì)性較大，其病程、用藥情況、自身抗體的狀況、年齡和性別都有所差異，且其發(fā)病機制較為復(fù)雜。

本研究還分析了RA患者關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞極化指標表達與炎癥指標、自身抗體和疾病活動性的相關(guān)性。在RA患者中，關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞CD163的表達水平與自身抗體ACPA密切相關(guān)。而近期研究[11]顯示ACPA抗體可影響巨噬細胞的極化，誘導(dǎo)巨噬細胞向M1轉(zhuǎn)化。

此外，需要指出的是,本文尚存在一些不足：① OA患者的關(guān)節(jié)腔積液研究樣本不夠多；② 沒有檢測未用藥的新發(fā)RA患者，因此本文無法了解在沒有藥物干擾情況下,極化在RA中的作用。本研究在后續(xù)的研究中將進一步擴大樣本量并檢測未用藥新發(fā)RA 患者極化指標表達情況,使研究結(jié)果更具可靠性。

綜上所述, RA 患者外周血單核細胞呈現(xiàn)M1和M2混合型，關(guān)節(jié)腔積液巨噬細胞呈現(xiàn)M1型，且與ACPA的含量相關(guān)。深入研究單核巨噬細胞的極化表型對RA患者免疫調(diào)節(jié)機制的影響，可為闡明 RA 患者免疫調(diào)節(jié)機制及臨床免疫治療提供新思路。

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