黑色素瘤優(yōu)先表達(dá)抗原在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義

譚平先， ，，，，， ，

(1.深圳市龍崗中心醫(yī)院脊柱、骨腫瘤科，廣東 深圳 518116；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨腫瘤科，廣東 廣州 510080)

腫瘤相關(guān)抗原能夠刺激并被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T cell, CTL)識(shí)別,成為腫瘤免疫治療的靶向抗原，有著較好的臨床治療前景，1997年Ikeda等[1]發(fā)現(xiàn)黑色素瘤優(yōu)先表達(dá)抗原(preferentially expressed antigen of melanoma，PRAME)在黑色素瘤患者中表達(dá)，并且能被CTL識(shí)別，該腫瘤抗原位于22號(hào)染色體上,由509個(gè)氨基酸編碼的抗原性蛋白,目前功能尚不清楚,其能被HLA-24識(shí)別，并遞呈給CTL。作者應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)骨肉瘤患者治療前穿刺活檢標(biāo)本中PRAME表達(dá)情況，并分析PRAME表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系，探討其在骨肉瘤患者中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料95例骨肉瘤術(shù)前穿刺活檢病理切片及16例術(shù)后骨纖維結(jié)構(gòu)不良病理切片(陰性對(duì)照)均取自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科病理組織標(biāo)本庫，95例骨肉瘤術(shù)前穿刺活檢病理切片取自1998年至2008年間中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的骨肉瘤患者，均為所有治療發(fā)生之前進(jìn)行穿刺活檢確定骨肉瘤診斷送病理檢查的標(biāo)本。所有標(biāo)本活檢及術(shù)后病理均確診為骨肉瘤，且患者隨訪資料齊全。95例患者均獲得了腫瘤廣泛性切除和規(guī)范的新輔助化療。

1.2方法主要試劑：羊抗人抗PRAME抗體(英國(guó)Abcam公司)，兔抗羊二抗(美國(guó)Proteintech Group公司)，羊抗人抗GAPDH抗體(美國(guó)Invitrogen公司)。具體方法：1)石蠟切片脫蠟水化，過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)，PBS洗滌，正常血清封閉。滴加一抗，4 ℃冰箱過夜孵育。PBS洗滌，滴加生物素化的二抗，37 ℃孵育40 min。PBS洗滌。滴加SAB復(fù)合物，37 ℃孵育40 min。PBS洗滌。DAB顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止，避免過度染色(自來水沖洗終止)。自來水充分沖洗。蘇木素復(fù)染，室溫滴加蘇木素，孵育30 s，自來水沖洗。自來水沖洗返藍(lán)，15 min。梯度酒精脫水：80%，2 min；95%，2 min；100%，5 min，2次。二甲苯透明。中性樹膠封片。

1.3免疫組化染色判斷從5個(gè)視野中選取100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽性染色細(xì)胞的讀數(shù)及染色的強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)判斷PRAME表達(dá)情況：0分:無腫瘤細(xì)胞陽性染色,陰性結(jié)果；1分：<10%腫瘤細(xì)胞陽性染色；2分：<50%腫瘤細(xì)胞陽性染色；3分：≥50%腫瘤細(xì)胞陽性染色。0分：無染色；1分：染色弱；2分：中度染色；3分：重度染色。根據(jù)上面評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定陽性染色腫瘤細(xì)胞<50%為弱陽性，陽性染色腫瘤細(xì)胞≥50%為強(qiáng)陽性。由2名病理科醫(yī)生閱片判斷PRAME免疫組化染色分級(jí)及PRAME表達(dá)強(qiáng)弱程度。

2 結(jié)果

2.1穿刺活檢取材標(biāo)本患者臨床病理特征95例骨肉瘤就診時(shí)穿刺活檢標(biāo)本病理切片均來自病理科組織庫，95例患者中，男65例，女30例，平均年齡17.2(6～45)歲，平均隨訪時(shí)間86(6～144)個(gè)月。見表1。

表1 95例患者的臨床病理特征

2.2PRAME蛋白在骨肉瘤組織中表達(dá)情況免疫組化技術(shù)分析95例骨肉瘤治療前穿刺活檢病理切片發(fā)現(xiàn)，陽性染色腫瘤細(xì)胞既有細(xì)胞漿內(nèi)PRAME蛋白陽性染色，又有細(xì)胞核內(nèi)PRAME蛋白陽性染色，也有腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿、細(xì)胞核均有PRAME蛋白陽性染色。因此PRAME蛋白既有在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)分布，也有在細(xì)胞漿內(nèi)分布。部分標(biāo)本腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿、細(xì)胞核PRAME蛋白染色均為陰性，無PRAME蛋白表達(dá)。95例病理切片中PRAME蛋白陰性26例，陽性69例。69例陽性染色標(biāo)本中32例為強(qiáng)陽性，37例為弱陽性，另外作為陰性對(duì)照的16例骨纖維結(jié)構(gòu)發(fā)育不良患者的組織病理切片PRAME蛋白染色均為陰性，骨纖維結(jié)構(gòu)發(fā)育不良組織中未檢測(cè)到PRAME蛋白表達(dá)。見圖1。

2.3PRAME蛋白表達(dá)與骨肉瘤患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性及預(yù)后意義單因素回歸分析示，PRAME蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤部位、Enneking分期及病理類型等無關(guān)(P>0.05,表2)。Kaplan-Meier生存分析顯示，治療前穿刺活檢病理切片PRAME蛋白強(qiáng)陽性患者預(yù)后差，5 a總生存率僅為29.9%；而治療前穿刺活檢病理切片PRAME蛋白陰性或弱陽性患者預(yù)后較好，5 a總生存率60.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010)。另外治療前穿刺活檢標(biāo)本病理切片PRAME蛋白染色強(qiáng)陽性患者較PRAME蛋白陰性或弱陽性患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加(P=0.032,表3)。

圖1 PRAME蛋白在骨肉瘤和

A、B：PRAME蛋白強(qiáng)陽性骨肉瘤標(biāo)本；C、D：PRAME蛋白弱陽性骨肉瘤標(biāo)本；E、F：PRAME蛋白陰性骨纖維結(jié)構(gòu)發(fā)育不良標(biāo)本

3 討論

骨肉瘤是多發(fā)于兒童、青少年人群的惡性腫瘤，新輔助化療明顯的提高了患者生存率，但肺轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)仍是威脅患者生存的重要因素。尋找新的免疫治療方法和靶向藥物是目前研究的熱點(diǎn)，腫瘤抗原可以刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原的CTL從而殺傷腫瘤細(xì)胞，還可以作為腫瘤免疫和生物治療的靶向目標(biāo)。PRAME最早由Ikeda等[1]從黑色素瘤細(xì)胞中分離出來的一種腫瘤相關(guān)抗原，能夠被HLA-A24分子遞呈給CTL。PRAME蛋白能夠刺激產(chǎn)生CTL，并被CTL-17識(shí)別和溶解。PRAME除了在卵巢、睪丸生殖細(xì)胞表達(dá)外，還在腎上腺、胎盤及子宮內(nèi)膜有少量的表達(dá)。但其微弱的表達(dá)量不能被CTL所識(shí)別，而在大多數(shù)惡性血液病及實(shí)體瘤中PRAME異常高表達(dá)，因此被認(rèn)為是腫瘤免疫治療理想的靶向目標(biāo)[2]。本課題組的前期研究[3-4]證實(shí)，通過骨肉瘤蛋白質(zhì)組學(xué)及腫瘤分子標(biāo)志物基因芯片的篩選研究發(fā)現(xiàn)PRAME在骨肉瘤組織中異常表達(dá)，現(xiàn)在我們對(duì)其在骨肉瘤組織中的具體表達(dá)情況及其表達(dá)變化與患者臨床預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了更深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRAME蛋白在大多數(shù)患者標(biāo)本中有表達(dá)，且PRAME蛋白在骨肉瘤患者中的表達(dá)變化與肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生和疾病的預(yù)后有著密切的聯(lián)系。

表2 95例骨肉瘤組織中PRAME的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表3 PRAME蛋白表達(dá)與骨肉瘤患者臨床預(yù)后的關(guān)聯(lián)性 n

有研究[5-9]報(bào)道在一些類型的惡性血液病及實(shí)體瘤中檢測(cè)到PRAME基因有不同程度的高表達(dá)，其中在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和絕經(jīng)前乳腺癌患者中，PRAME基因轉(zhuǎn)錄文本表達(dá)水平的高低還與疾病的預(yù)后有關(guān)。另外，在一些惡性腫瘤中PRAME表達(dá)變化除與疾病進(jìn)展、預(yù)后有關(guān)外，系統(tǒng)化療前后PRAME表達(dá)變化還與治療效果有關(guān)，如在一些類型的白血病患者中經(jīng)過化療后PRAME基因表達(dá)水平明顯下降。因此，PRAME除被看作疾病進(jìn)展變化及預(yù)后的指標(biāo)外，還被作為檢測(cè)腫瘤治療后微小病灶殘存和化療效果評(píng)價(jià)的指標(biāo)[10-14]。Haqq等[15]發(fā)現(xiàn)PRAME表達(dá)水平的高低與黑色素瘤分期有關(guān)。Oberthue等[8]報(bào)道PRAME高表達(dá)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者生存時(shí)間短，預(yù)后差。Tajeddine等[10]報(bào)道在急性髓樣白血病(Acute myeloid leukemia，AML)中，PRAME基因轉(zhuǎn)錄文本高表達(dá)的患者預(yù)后較好，分析認(rèn)為PRAME基因轉(zhuǎn)錄文本高表達(dá)患者預(yù)后好的原因可能是由于PRAME刺激機(jī)體CTL的增殖和活性，殺傷和攻擊腫瘤細(xì)胞所致。Partheen等[16]報(bào)道在卵巢腺癌患者中PRAME高表達(dá)往往預(yù)示著疾病的進(jìn)展和預(yù)后不良。Watari等[17]報(bào)道PRAME基因轉(zhuǎn)錄文本高表達(dá)與慢性髓樣白血病的惡化相關(guān)，并認(rèn)為PRAME是BCR/ABL的誘導(dǎo)基因，與造血干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有一定關(guān)聯(lián)。我們的研究發(fā)現(xiàn)PRAME蛋白在治療前穿刺活檢標(biāo)本中強(qiáng)陽性表達(dá)的骨肉瘤患者往往預(yù)后較差。免疫組化分析PRAME蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)骨肉瘤患者5 a生存率僅29.9%，而弱陽性或陰性表達(dá)PRAME蛋白的骨肉瘤患者5 a生存率是60.4%，后者明顯升高。另外，PRAME在治療前穿刺活檢標(biāo)本中強(qiáng)陽性表達(dá)的骨肉瘤患者較PRAME弱陽性或陰性患者有著更高發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，而與腫瘤復(fù)發(fā)和其他因素?zé)o明顯關(guān)聯(lián)性。這預(yù)示著PRAME對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及疾病的預(yù)后有著一定的影響。當(dāng)然，影響骨肉瘤患者預(yù)后的因素很多，包括手術(shù)是否徹底、腫瘤對(duì)化療反應(yīng)等。同時(shí)，治療的差異也影響PRAME與骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性，關(guān)于PRAME與骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性仍需大樣本、多中心、長(zhǎng)期的臨床觀察和驗(yàn)證，我們僅觀察到了初步的現(xiàn)象。PRAME在骨肉瘤細(xì)胞中的功能、作用機(jī)制及對(duì)疾病發(fā)生、發(fā)展作用尚需進(jìn)一步研究、探索。

我們僅在實(shí)驗(yàn)和臨床中觀察到PRAME在人骨肉瘤細(xì)胞和組織標(biāo)本中異常表達(dá)，其異常表達(dá)的具體原因和意義尚不清楚，有待進(jìn)行更深入的研究和探索。研究觀察到PRAME高表達(dá)和骨肉瘤患者預(yù)后差、發(fā)生肺轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加這種關(guān)聯(lián)性尚需大樣本、多中心、長(zhǎng)期的觀察隨訪。因?yàn)橛绊懝侨饬龌颊哳A(yù)后的因素是多方面，不同患者之間治療方法的差異(手術(shù)、化療)，腫瘤對(duì)化療的反應(yīng)，腫瘤負(fù)荷等都會(huì)影響患者的預(yù)后，這些混雜因素很可能妨礙判斷及結(jié)論的正確性。雖然PRAME作為很有潛在應(yīng)用價(jià)值的腫瘤特異性抗原，但利用其開發(fā)新藥及新的治療手段仍面臨很多困難。

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