胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定的方法研究

寧芳 陳光

胚胎干細(xì)胞是來(lái)源于著床前囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或早期胚胎原始生殖嵴的原始生殖細(xì)胞的一種多潛能細(xì)胞，具有體外無(wú)限增生和高度自我更新的能力，在一定條件下，能分化成3個(gè)胚層來(lái)源的各種細(xì)胞[1，2]。因此，胚胎干細(xì)胞在動(dòng)物和人的胚胎發(fā)育、致畸實(shí)驗(yàn)、組織工程和移植治療等研究領(lǐng)域具有重要的科學(xué)意義和巨大的應(yīng)用前景[3]?，F(xiàn)已經(jīng)證明小鼠胚胎干細(xì)胞可以分化為心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、卵黃囊細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等[4]。然而胚胎干細(xì)胞能否向牙源性上皮方向轉(zhuǎn)化在國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)小鼠的胚胎干細(xì)胞R1系及CGR8系進(jìn)行了原代培養(yǎng)及傳代，并進(jìn)行了體內(nèi)外的鑒定，為下一步探討胚胎干細(xì)胞替代牙源性上皮細(xì)胞的研究奠定基礎(chǔ)。

資料和方法

1.細(xì)胞來(lái)源：胚胎干細(xì)胞R1系及CGR8系源自中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6周齡免疫缺陷小鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

3.主要試劑：高糖DMEM/F12 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；無(wú)鈣鎂 PBS（Gibco，美國(guó)）；谷氨酰胺（Gibco，美國(guó)）；2-巰基乙醇（Gibco，美國(guó)）；I型膠原酶（Sigma，美國(guó)）；丙醇酸鈉（Gibco，美國(guó)）；Dispase（Sigma美國(guó)）；非必須氨基酸（Gibco，美國(guó)）；青鏈霉素（Gibco，美國(guó)）；ALP試劑盒（Millipore，美國(guó)）；白血病抑制因子（Gibco，美國(guó)）；0.25%胰蛋白酶（Sigma美國(guó)）；抗小鼠一抗：OCT4（Santa Cruz Biotechnology， 美 國(guó)）；SSEA4（Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)）；FITC 或 Rhodamine標(biāo)記的兔抗羊或羊抗兔二抗（Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)）。

4.主要儀器：低溫高速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)）；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympas，日本）；二氧化碳恒溫孵箱（Forma，美國(guó)）；YJ-875型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng)）；細(xì)胞篩網(wǎng)（Falcon，USA）；不銹鋼高壓鍋（蘇泊爾）；培養(yǎng)板（Falcon，美國(guó)）；濾器（Corrigtwohill，愛(ài)爾蘭）。

5.胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)：①?gòu)?fù)蘇：首先從液氮中取出一支凍存管的胚胎干細(xì)胞，放入37℃水浴中晃動(dòng)，直到只剩下小冰晶。吸取凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液加至有少量培養(yǎng)液的15ml離心管中，離心1000rpm，5分鐘。吸棄上清液，加4～6ml培養(yǎng)液，吹打懸浮。接下來(lái)重復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。隨后轉(zhuǎn)移到一個(gè)已經(jīng)鋪好飼養(yǎng)層的25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)并每天換液。②傳代：一般在復(fù)蘇后第2～3天傳代，視克隆的大小和密度而定。首先吸棄廢液，用PBS（不含鈣鎂）輕輕沖洗兩遍，之后加0.5～1.0ml的胰酶（0.25%）-乙二胺四乙酸（0.02%）溶液至培養(yǎng)瓶，左右晃動(dòng)，使胰酶覆蓋整個(gè)瓶底，消化細(xì)胞。在顯微鏡下觀(guān)察，直到細(xì)胞層全部脫落（一般需要1～2分鐘）。隨后加適量（4～5ml）含血清的培養(yǎng)液終止消化。建議專(zhuān)門(mén)配制只含85%DMEM+15%DFBS的終止液，來(lái)終止胰酶的作用即可，因?yàn)槿绻胢ES培養(yǎng)液，其中還含有LIF、L-谷氨酰胺、NEAA、β-巰基乙醇這些昂貴的成分，而終止胰酶主要是靠血清細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，并加足量的培養(yǎng)液，吹打混勻，細(xì)胞液分裝到25cm2培養(yǎng)瓶中，一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加5～6ml ES培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中。確保每天換液，傳代比例：1：4～1：10或者更大。

培養(yǎng)液配方250ml的培養(yǎng)液中含有210ml的高糖DMEM、37.5ml的滅活胎牛血清、2ml的非必須氨基酸、0.25ml的丙醇酸鈉及0.25ml的2-巰基乙醇。每次換液時(shí)加入LIF，換多少液加入相應(yīng)量LIF。

6.堿性磷酸酶染色：將小鼠胚胎干細(xì)胞接種于明膠預(yù)處理的蓋玻片上培養(yǎng)2天。將培養(yǎng)后的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15分鐘，蒸餾水洗3次，5分鐘/次。堿性磷酸酶染色液37℃避光作用15分鐘，蒸餾水洗2次，5分鐘/次。放入無(wú)水乙醇ⅰ中10分鐘，無(wú)水乙醇ⅱ中10分鐘，二甲苯中20分鐘，樹(shù)膠封固，拍照。

7.擬胚體的形成：胚胎干細(xì)胞通過(guò)懸滴法可以形成具有三胚層結(jié)構(gòu)的擬胚體（EBs）。擬胚體因與胚胎的早期發(fā)育相似，被廣泛用于研究器官的發(fā)育以及不同胚層間的相互作用。成為研究干細(xì)胞進(jìn)展重要的技術(shù)手段。

EB的制備：首先消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)。將濃度調(diào)至12～16萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升后進(jìn)行懸滴。以25μL一滴，均勻的滴至六孔板的上蓋內(nèi)表面。懸滴間距應(yīng)適中。滴滿(mǎn)后的上蓋迅速扣至已經(jīng)事先加入少量PBS 的六孔板上，隨后小心放置孵箱中。2天后，在每一個(gè)懸滴液體中均可以看見(jiàn)一個(gè)白色點(diǎn)狀物，即為擬胚體。小心地將擬胚體吸出后進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)。

8.裸鼠體內(nèi)移植：將2×106細(xì)胞用300μL不含LIF的培養(yǎng)基重懸，隨即注射入裸鼠皮下，移植4周后取材。

9.裸鼠皮下移植物檢測(cè)：體內(nèi)移植4周后取材，首先用多聚甲醛固定移植物約24h，之后用脫鈣液脫鈣直至觸摸至柔軟狀，流水沖洗后石蠟包埋并進(jìn)行HE染色。

結(jié) 果

1.胚胎干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察：胚胎干細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核大，有一個(gè)或幾個(gè)核仁，胞核中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)胞漿少，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞排列緊密，呈集落狀生長(zhǎng)，呈一個(gè)個(gè)克隆團(tuán)樣（圖1A）。細(xì)胞克隆團(tuán)和周?chē)嬖诿黠@界限，形成的克隆細(xì)胞彼此界限不清，細(xì)胞表面有折光較強(qiáng)的脂狀小滴。細(xì)胞克隆形態(tài)多樣，多數(shù)呈島狀或巢狀。小鼠胚胎干細(xì)胞的直徑約為7μm～18μm，在LIF存在的情況下可以一直處于未分化狀態(tài)，細(xì)胞的增值能力快。

2.胚胎干細(xì)胞的體外鑒定結(jié)果：未分化的胚胎干細(xì)胞生物學(xué)特性為表達(dá)階段特異性胚胎抗原-4（SSEA4），OCT4，及堿性磷酸酶，體外在一定條件下能生成擬胚體等。本實(shí)驗(yàn)中用堿性磷酸酶染色后，胚胎干細(xì)胞呈棕紅色。說(shuō)明堿性磷酸酶染色陽(yáng)性，細(xì)胞處于未分化狀態(tài)（圖1B）。

懸滴法培養(yǎng)2天后即可生成擬胚體（圖1C），鏡下觀(guān)察擬胚體的周緣光滑，聚集緊密，為正圓形態(tài)，易于計(jì)算直徑。

圖1 胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)及體外鑒定（A：未分化的胚胎干細(xì)胞 B：堿性磷酸酶染色 C：懸滴法生成的擬胚體）

3.胚胎干細(xì)胞的體內(nèi)鑒定結(jié)果：將胚胎干細(xì)胞離散制成懸液，以適當(dāng)劑量注射到裸鼠皮下，4周后取材可見(jiàn)有混合組織瘤形成（圖2）。大體觀(guān)較大的畸胎瘤直徑有2個(gè)厘米，生長(zhǎng)速度很快，在植入約2周后迅速生長(zhǎng)。組織切片HE染色結(jié)果顯示：鏡下可觀(guān)察到上皮組織（外胚層結(jié)構(gòu)），軟骨組織（中胚層結(jié)構(gòu)）及內(nèi)臟組織（內(nèi)胚層結(jié)構(gòu)）生成（圖3），三胚層的組織進(jìn)一步驗(yàn)證了畸胎瘤的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的R1系及CGR8系在細(xì)胞的形態(tài)、體內(nèi)外的生物學(xué)特性方面無(wú)顯著差異，在細(xì)胞增值能力方面R1系較強(qiáng)，因此在隨后對(duì)胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中我們將使用R1系的胚胎干細(xì)胞。

圖2 畸胎瘤大體標(biāo)本圖

圖3 體內(nèi)形成畸胎瘤HE染色結(jié)果[A：上皮角化物（外胚層）；B：軟骨組織（中胚層）；C：內(nèi)臟組織（內(nèi)胚層）]

討 論

胚胎干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多向分化能力的全能干細(xì)胞[4]。未分化的胚胎干細(xì)胞不僅從形態(tài)學(xué)上成克隆團(tuán)樣生長(zhǎng)，而且還具有堿性磷酸酶染色陽(yáng)性、能形成具有3個(gè)胚層結(jié)構(gòu)的擬胚體及特異性胚胎抗原SSEA4及OCT4表達(dá)陽(yáng)性。體內(nèi)可以形成畸胎瘤[5～8]。

胚胎干細(xì)胞極易受外界因素的影響，對(duì)生長(zhǎng)條件要求非常苛刻[9]。常規(guī)的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中含有高糖MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇和非必需氨基酸等，為了防止胚胎干細(xì)胞發(fā)生分化，還要在培養(yǎng)液中加入白血病抑制因子（LIF），胎牛血清的質(zhì)量及濃度也是影響ES細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的重要因素。

擬胚體是廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞研究的一種途徑，而目前關(guān)于形成擬胚體方法的研究彼此相差很大[10～12]。在本實(shí)驗(yàn)形成擬胚體的過(guò)程中我們通過(guò)比較各種條件后發(fā)現(xiàn)以15萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL懸滴48小時(shí)生成擬胚體的方法最理想。因?yàn)樵谶@種條件下生成的擬胚體大小一致，形態(tài)規(guī)則。我們使用R1和CGR8這兩種細(xì)胞系多次重復(fù)，結(jié)果一致。雖然有學(xué)者認(rèn)為，即使剛生成的擬胚體大小不同，但經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，分化程度不會(huì)有很大差別。但是我們?nèi)匀煌扑]這個(gè)濃度，因?yàn)楫?dāng)大于這個(gè)濃度懸滴時(shí)，培養(yǎng)液會(huì)由于細(xì)胞的量大而發(fā)黃，提示培養(yǎng)液中沒(méi)有足夠的養(yǎng)分提供給全部的胚胎干細(xì)胞。由于培養(yǎng)液的PH值也發(fā)生了變化，對(duì)擬胚體的早期形成不利。此外，當(dāng)以小于這個(gè)濃度懸滴時(shí)，由于在消化中胰酶的作用會(huì)引起部分細(xì)胞的死亡，而在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)這些細(xì)胞也在計(jì)算中。如果懸滴細(xì)胞達(dá)不到一定的濃度，則在規(guī)定時(shí)間內(nèi)就不能形成擬胚體。換言之，細(xì)胞的濃度低后就需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)形成較為成熟的擬胚體。因此，我們認(rèn)為15萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL懸滴48小時(shí)是最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件。

胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)可以形成三胚層的畸胎瘤，充分說(shuō)明了它的多向分化潛能。胚胎干細(xì)胞體內(nèi)外的多向分化潛能為下一步誘導(dǎo)其向牙齒上皮方向轉(zhuǎn)化提供了依據(jù)。但是如果胚胎干細(xì)胞未分化完全，則在體內(nèi)可以形成畸胎瘤，這為胚胎干細(xì)胞在應(yīng)用方面帶來(lái)很大障礙，因此在實(shí)驗(yàn)中探索胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的同時(shí)如何提高誘導(dǎo)效率也是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

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