超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中苯溴馬隆的質(zhì)量濃度

洪 慧，梁文忠

(1.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240；2.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司生物分析服務(wù)部，上海 200131)

近年來伴隨高脂血癥、肥胖癥、糖尿病和高血壓等疾病的高發(fā)，導(dǎo)致高尿酸血癥及痛風(fēng)的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升的趨勢[1-10]。目前，我國臨床主要采用苯溴馬隆等西藥治療原發(fā)性和繼發(fā)性高尿酸血癥，以及各種原因引起的痛風(fēng)。苯溴馬隆為苯并呋喃衍生物，屬于β受體阻滯劑，能抑制腎小管對尿酸的重吸收，促進尿酸排泄，是良好的嘌呤氧化酶抑制劑，具有抑制尿酸生成的作用，對降低血中尿酸質(zhì)量濃度達到雙重效果[11-16]。

根據(jù)目前發(fā)表的國內(nèi)外文獻報道，現(xiàn)有的定量測定血漿中苯溴馬隆的方法有HPLC法[17-20]和GC-MS法[21]，采用LC-MS法[22]只是定性分析其代謝產(chǎn)物，尚未見文獻中報道采用液質(zhì)聯(lián)用方法來定量分析血漿中苯溴馬隆的質(zhì)量濃度。本文首次建立用LC-MS/MS法測定人血漿中苯溴馬隆的質(zhì)量濃度，具有簡單穩(wěn)定、快速、特異性高等特點，可同時滿足臨床藥代動力學(xué)研究及生物等效性研究中大批量樣品快速分析的要求。

1 儀器與試藥

1.1儀器 API6500型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Sciex公司)，配有大氣壓化學(xué)電離源(APCI)及Analyst 1.6.3分析軟件；Nexera UHPLC超高效液相色譜儀(日本島津公司)，配有自動進樣器及柱溫箱等。

1.2試藥 苯溴馬隆標準對照品(加拿大TRC公司，批號2-BLH-83-1，質(zhì)量分數(shù)98.0%)；苯溴馬隆EP Impurity B對照品(加拿大TLC公司，批號2441-002A3，質(zhì)量分數(shù)99.5%)；色譜純級甲醇、乙腈(美國Merck公司)；醋酸銨(加拿大Fluka公司)；甲酸(美國Sigma-Aldrich公司)；去離子純水由實驗室ELGA純凈水發(fā)生器制備。

2 方法

2.1液相色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1色譜條件 色譜柱為Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為分別含1 mL·L-1甲酸的2 mmol·L-1醋酸銨的水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序為[0 min，A∶B(45∶55)→1.6 min，A∶B(5∶95)→2.0 min，A∶B(5∶95)→2.01 min，A∶B(45∶55)→2.5 min，A∶B(45∶55)]；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：60 ℃；進樣量為3 μL。

2.1.2質(zhì)譜條件 離子源為大氣壓化學(xué)電離源(APCI)，負離子模式檢測；掃描方法為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；苯溴馬隆和苯溴馬隆EP Impurity B的檢測離子對分別是m/z422.7→250.8和m/z502.6→250.9，去簇電壓(DP)分別為-45 V和-80 V，碰撞能(CE)分別為-42 V和-50 V，霧化電流為-3 mA；離子源溫度為450 ℃；氣簾氣流速為40 psi，噴霧氣流速為50 psi，各離子通道掃描時間為100 ms，相應(yīng)的二級質(zhì)譜圖見圖1。

圖1二級質(zhì)譜掃描圖

A.苯溴馬隆；B.苯溴馬隆EP Impurity B。

Fig.1 Product Ion spectra

A.benzbromarone；B.benzbromarone EP Impurity B.

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液 精密稱取苯溴馬隆標準對照品適量，置于4 mL棕色玻璃瓶中，加入二甲亞砜(DMSO)溶解至質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對照品儲備液。將上述儲備液用乙腈-水(7∶3)溶液按照梯度稀釋成質(zhì)量濃度為1 000，2 000，5 000，10 000，20 000，100 000，180 000和200 000 ng·mL-1的系列對照品溶液，置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.2內(nèi)標溶液 精密稱取苯溴馬隆 EP Impurity B對照品適量，置于4 mL棕色玻璃瓶中，加DMSO溶解至質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的內(nèi)標儲備液。將上述內(nèi)標儲備液用乙腈-水(7∶3)溶液稀釋至質(zhì)量濃度為8 000 ng·mL-1，即得，置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.3樣品前處理 精密移取血漿50 μL，置于96孔板中，加入20 μL內(nèi)標溶液，置于搖板機中混勻2 min，加入330 μL乙腈沉淀，搖勻10 min，于4 ℃條件下，以4 000 r·min-1離心15 min。取上清液100 μL，移至另一塊96孔板中，加入200 μL乙腈-水溶液(1∶1)稀釋，搖勻。取3 μL進樣檢測。

2.3專屬性考察及干擾考察 本實驗采用的質(zhì)譜和色譜條件下，人空白血漿，空白血漿+苯溴馬隆以及空白血漿+苯溴馬隆+苯溴馬隆EP Impurity B的色譜圖見圖2。由圖2可知，空白基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)對待測物無干擾；內(nèi)標對待測物不存在干擾，只存在串?dāng)_(crosstalk)現(xiàn)象，在色譜上兩者有明顯的分離，不影響待測物分析；作為內(nèi)標的化合物是待測藥物工藝合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)，因此待測物最高定量上限(ULOQ)對內(nèi)標通道信號有一定貢獻，通過適當(dāng)調(diào)整加入的內(nèi)標質(zhì)量濃度，使其干擾峰面積遠小于5%的內(nèi)標峰面積平均值，可滿足生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的要求。

2.4標準曲線與線性范圍 分別精密吸取系列對照品溶液20 μL，加入380 μL的空白血漿中，渦旋混勻，配制得到質(zhì)量濃度為50，100，250，500，1 000，5 000，9 000和10 000 ng·mL-1的血漿樣品，按照血漿樣品預(yù)處理方法進行操作，以不同質(zhì)量濃度對照品樣品測得的苯溴馬隆與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標(y)、苯溴馬隆質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，用加權(quán)最小二乘法進行線性回歸，方程為y=0.000 35x+0.000 63(r=0.999)。苯溴馬隆線性范圍：50～10 000 ng·mL-1，方法定量下限為50 ng·mL-1。

圖2HPLC圖

A.空白血漿；B.空白血漿+苯溴馬隆(10 000 ng·mL-1)；C.空白血漿+苯溴馬隆(50 ng·mL-1)+苯溴馬隆EP Impurity B；(左：苯溴馬隆；右：苯溴馬隆EP Impurity B)。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.blank plasma；B.blank plasma+benzbromarone(10 000 ng·mL-1)；C.blank plasma + benzbromarone (50 ng·mL-1)+ benzbromarone EP Impurity B；(Left：benzbromarone；Right:benzbromarone EP Impurity B).

2.5方法精密度和準確度 按照苯溴馬隆標準曲線制備方法制備質(zhì)控樣品，對定量下限(LLOQ)和低、中和高4個質(zhì)量濃度(分別為50，150，4 000和8 000 ng·mL-1)樣品進行了連續(xù)3 d的6份樣品分析。以同一批次的2條隨行標準曲線計算實測質(zhì)控樣品的質(zhì)量濃度，評價方法的批內(nèi)、批間精密度，其RSD值均小于5%,結(jié)果表明，精密度和準確度良好，符合接受標準。

2.6絕對回收率和基質(zhì)效應(yīng) 按照苯溴馬隆標準曲線制備方法制備低、中和高3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按照血樣預(yù)處理后進樣分析，記錄藥物峰面積。與相同質(zhì)量濃度的空白基質(zhì)提取后添加待測物的樣品進樣得到的峰面積進行比較，計算苯溴馬隆提取回收率(n=6)，3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品回收率分別是102%±5.08%，103%±3.09%和100%±3.96%，其RSD值均小于4%。

提取6個不同批次的單人空白血漿即得空白基質(zhì)樣品。向空白基質(zhì)樣品中添加待測物和內(nèi)標溶液，使其最終質(zhì)量濃度與進樣時的低、中和高3種質(zhì)量濃度一致，各質(zhì)量濃度平行3份。同時配制含有待測物和內(nèi)標溶液的參比溶液，同樣配制低、中和高3種質(zhì)量濃度。比較空白基質(zhì)樣品和參比溶液中待測物和內(nèi)標的峰面積，計算得到苯溴馬隆的3種質(zhì)量濃度基質(zhì)效應(yīng)因子分別是97.8%±3.49%，98.6%±1.43%和100%±1.93%，其RSD值均小于4%。

結(jié)果表明，內(nèi)標的提取回收率在3種質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品中保持一致，且無基質(zhì)效應(yīng)。同時考察溶血和含高脂血的血漿樣品的基質(zhì)效應(yīng)，均符合分析接受標準。

2.7穩(wěn)定性考察 考察標準血漿樣品在各條件下的穩(wěn)定性，按照2.2.3項下方法對血漿進行前處理后，測定其主峰與內(nèi)標峰面積的比值，根據(jù)RSD值及準確度進行判斷。不同條件下各質(zhì)量濃度平行取3份，分別于室溫放置4和24 h以及4 ℃冰箱中放置24 h，結(jié)果表明，苯溴馬隆的質(zhì)量濃度無改變，常規(guī)穩(wěn)定性良好；分別置于-20與-80 ℃冰箱中，反復(fù)融凍3次，結(jié)果表明，苯溴馬隆的質(zhì)量濃度保持穩(wěn)定，凍融穩(wěn)定性良好；分別置于-20與-80 ℃冰箱保存55 d，結(jié)果表明，苯溴馬隆各質(zhì)量濃度均未發(fā)生改變，長期穩(wěn)定性良好。另外，還考察了對照品溶液的室溫穩(wěn)定性，結(jié)果表明，室溫條件下放置54 h穩(wěn)定。

2.8生物等效性研究中的應(yīng)用 出于與客戶間保密協(xié)議的考慮，不便公開發(fā)表藥代動力學(xué)參數(shù)相關(guān)數(shù)據(jù)。這里僅展示實際樣品分析階段中某健康受試者口服苯溴馬隆片后1 h的色譜分析圖，見圖3。

圖3實際樣品HPLC圖

A.苯溴馬?。籅.苯溴馬隆EP Impurity B。

Fig.3 HPLC chromatograms of incurred sample

A.benzbromarone；B.benzbromarone EP Impurity B.

3 討論

苯溴馬隆EP Impurity B與苯溴馬隆結(jié)構(gòu)極其類似，只相差1個-Br基團，二者在質(zhì)譜內(nèi)裂解位點相同，具有部分相同的碎片離子峰。筆者選擇了質(zhì)譜響應(yīng)最強的250.8作為子離子監(jiān)測。苯溴馬隆極性較小，易溶于有機試劑，因此文獻中的前處理大多采用有機溶劑提取法[21]，但前處理所需時間較長且操作繁瑣。本實驗采用簡單的蛋白沉淀法，用乙腈對血漿樣品進行蛋白沉淀，方法簡便、經(jīng)濟、回收率高。質(zhì)譜采用APCI離子源[23]，有效地消除了待測物的基質(zhì)效應(yīng)。同時采用了亞2微米色譜柱，提高柱溫至60 ℃，極大地提高了色譜分離度，縮短了分析時間[24]。

在沒有商業(yè)化的同位素標記內(nèi)標出售的前提下，經(jīng)過評估，最終選擇了與苯溴馬隆結(jié)構(gòu)相似的苯溴馬隆EP Impurity B作為內(nèi)標化合物。雖然它屬于待測物對照品中的1種雜質(zhì)，但由于其含量極低，對待測藥物的分析無干擾，且具有與待測藥物較接近的保留時間，相近的提取回收率(大于93%)和基質(zhì)效應(yīng)(98.5%～100.6%)，是一個適合的內(nèi)標。購買商品化對照品經(jīng)濟便宜，無需花費時間和更高成本去合成同位素內(nèi)標。

本研究首次建立一種高效的LC-MS/MS法測定人血漿中苯溴馬隆的質(zhì)量濃度，并成功應(yīng)用于生物等效性樣品分析。此方法簡單穩(wěn)定，分析速度快，分析效率明顯優(yōu)于目前已有的文獻報道[17-21]，可滿足臨床藥代動力學(xué)研究及生物等效性研究中大批量樣品快速分析的要求。

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